BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY XƯƠNG ĐốT SèNG ë PHơ N÷ M·N KINH VIƯT NAM ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY XƯƠNG ĐốT SèNG ë PHơ N÷ M·N KINH VIƯT NAM Chun ngành: Sinh Lý Học Mã số: 62720405 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Huy Bình TS Nguyễn Thị Thanh Hương HÀ NỘI – 2016 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤ BMD Bone Mineral Density (mật độ xương) BMI Body Mass Index (chỉ số khối thể) CXĐ Cổ xương đùi CSTL Cột sống thắt lưng DNA Deoxyribonucleic acid F Forward primer Hcy Homocystein MTHFR Methylene Tetrahydrofolat Reductase Rw Reverse wild type primer Rm Reverse mutation primer SNP Single nucleotide polymorphism ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh loãng xương 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Chẩn đoán 1.1.4 Phân loại loãng xương .6 1.1.5 Điều trị .7 1.1.6 Nguyên nhân gây loãng xương phụ nữ mãn kinh 1.1.7 Gãy xương loãng xương .14 1.2 Gen liên quan đến loãng xương gãy xương 14 1.3 MTHFR 15 1.3.1 Tổng quan MTHFR 15 1.3.2 Vị trí cấu trúc gen MTHFR 15 1.3.3 Cấu trúc chức protein MTHFR 15 1.3.4 Đột biến gen MTHFR .17 1.3.4 C677T (Ala222Val) MTHFR 18 1.3.5 Các nghiên cứu C677T tương quan với mật độ xương nguy gãy xương 20 1.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân tích vị trí đột biến C677T 23 1.4.1 Kỹ thuật PCR 23 1.4.2 Phương pháp ARMS – PCR 25 1.4.3 Kỹ thuật RFLP-PCR .27 1.4.4 Phương pháp RT-PCR .27 1.4.5 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp 28 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu .29 2.1.2 Quy trình lấy máu 31 2.1.3 Đo BMD theo phương pháp hấp thụ tia X lượng kép .31 2.1.3 Chụp đánh giá gãy xương cột sống X Quang 32 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 32 2.2.1 Thời gian nghiên cứu .32 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu .32 2.3 Qui trình nghiên cứu 33 2.4 Phương tiện nghiên cứu 33 2.4.1 Trang thiết bị 33 2.4.2 Hóa chất sinh phẩm 34 2.5 Các bước tiến hành 35 2.5.1 Tách DNA 35 2.5.2 Xác định kiểu gen phương pháp ARMS-PCR 35 2.6 Phân tích xử lý số liệu .37 2.7 Đạo đức nghiên cứu 38 Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Thông số nhân trắc đối tượng nghiên cứu 39 3.2 Kết X Quang cột sống thắt lưng 40 3.3 Kết tách chiết DNA 40 3.4 Kết xác định kiểu gen phương pháp ARMS PCR 41 3.5 Tương quan đa hình gen C677T MTHFR với BMD cổ xương đùi, BMD toàn khớp háng, BMD cột sống thắt lưng .41 3.6 Tương quan đa hình gen C677T MTHFR với BMD BMI 41 3.7 Tương quan tỷ lệ phân bố đa hình gen C677T MTHFR nhóm chứng, nhóm lỗng xương nhóm thiểu xương .42 3.8 Tương quan đa hình gen với nguy gãy xương cột sống 43 Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN .44 4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu .44 4.2 Phương pháp tách chiết DNA, đo OD kỹ thuật ARMS PCR 45 4.3 Tỷ lệ đa hình kiểu gen C677T MTHFR phụ nữ mãn kinh Việt Nam 45 4.4 Tương quan C677T MTHFR với BMD 45 4.5 Tương quan C677T MTHFR với BMI 46 4.6 Tương quan C677T với tỷ lệ gãy xương cột sống 46 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 47 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đốn lỗng xương WHO .5 Bảng 1.2 Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm2) quần thể phụ nữ Việt Nam đo máy Hologic Bảng 1.3 Vị trí kiểu đột biến gen MTHFR .17 Bảng 1.4 Bảng phân bố tần số đột biến gen MTHFR giới 18 Bảng 3.1 Thông số nhân trắc đối tượng nghiên cứu 39 Bảng 3.2 Kết X Quang cột sống thắt lưng .40 Bảng 3.3 Kết tách chiết DNA 40 Bảng 3.4 Kết xác định kiểu gen phương pháp ARMS PCR 41 Bảng 3.5 Tương quan đa hình gen C677T MTHFR với BMD BMI .41 Bảng 3.6 Tương quan tỷ lệ phân bố đa hình gen C677T MTHFR nhóm chứng, nhóm lỗng xương nhóm thiểu xương 42 Bảng 3.7 Tương quan đa hình gen với nguy gãy xương cột sống 43 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình xương bình thường lỗng xương Hình 1.2 Q trình tái mơ hình (remodelling) xương xảy theo trình tự khởi động, phân hủy, tạm ngưng, tạo xương Hình 1.3 Tương tác dòng tế bào tạo xương hủy xương 11 Hình 1.4 Sự thay đổi nồng độ testosteron (A) estradiol (B) nam nữ người Việt 13 Hình 1.5 Vị trí gen MTHFR NST 15 Hình 1.6 Cấu trúc MTHFR 16 Hình 1.7 Chuyển hóa MTHFR 16 Hình 1.8 Ảnh hưởng nồng độ homocystein cao gây ức chế hoạt động enxym Lox (collagen lysyl oxidase) .20 Hình 1.9 Minh họa chu kì nhiệt phản ứng PCR 25 Hình 2.1 Hình ảnh điện di sản phẩm gen xác định đột biến dạng tự nhiên C677T MTHFR 36 Hình 2.2 Giải trình tự kiểm định độ xác kỹ thuật ARMS PCR 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Loãng xương bệnh lý xương, đặc trưng giảm mật độ xương giảm chất lượng xương, dẫn đến tăng nguy gãy xương Loãng xương hậu gãy xương, công nhận vấn đề y tế cơng cộng tồn cầu quan trọng Loãng xương nguyên phát bao gồm loãng xương sau mãn kinh loãng xương tuổi già Loãng xương sau mãn kinh thường gặp phụ nữ sau mãn kinh sau cắt bỏ buồng trứng khoảng 5-10 năm, liên quan đến thiếu hụt estrogen [1] Gãy xương loãng xương có liên quan đến tăng tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mắc bệnh kết hợp giảm chất lượng sống Tồn giới ước tính có 200 triệu người mắc bệnh loãng xương [2] Tại Việt Nam, gần 1/3 số phụ nữ 50 tuổi có biểu bệnh loãng xương 23% phụ nữ độ tuổi 50-65 bị loãng xương tỷ lệ cao Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc quần thể da trắng [3] Lỗng xương khó phát giai đoạn đầu, thường phát có biến chứng Biến chứng trầm trọng loãng xương gãy xương Trên giới có 8,9 triệu trường hợp gãy xương lỗng xương, trung bình giây lại có trường hợp gãy xương [4] Khoảng nửa phụ nữ bị gãy xương tử vong vòng năm Đối với bệnh nhân may mắn sống sót họ mắc nhiều biến chứng chất lượng sống bị giảm đáng kể Lỗng xương xảy nhiều vị trí, nhiên với mức độ nghiêm trọng gãy xương cột sống, việc quan tâm mực đến bệnh nhân loãng xương vô quan trọng Phát điều trị y tế giai đoạn lỗng xương chưa có biến chứng giúp giảm thiểu tỷ lệ gãy xương cột sống, giảm chi phí y tế, nâng cao đời sống tuổi thọ bệnh nhân Gần nhiều nghiên cứu chứng minh nồng độ homocystein máu cao có liên quan đến bệnh lý loãng xương gãy xương Homocystein acid amin có chứa thiol hình thành trình trao đổi chất methionin Tình trạng tăng homocystein bệnh di truyền lặn NST thường đặc trưng tăng lưu hành homocystein khởi đầu sớm loãng xương, gãy xương [5], [6] số liệu từ hai nghiên cứu tập cho thấy tổng mức homocystein huyết tương có liên quan đến gãy xương loãng xương [7], [8] Người ta chứng minh số enzym, bao gồm 5,10 – methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR), đóng vai trò quan trọng chuyển hóa homocysteine Một đột biến điểm gen MTHFR (C677T), gây thay acid amin valine thành alanine, liên quan với giảm hoạt động enzym tăng homocysteine máu Một số nghiên cứu báo cáo đa hình kết hợp với hai kiện tăng nguy gãy xương loãng xương [9], [10] suy giảm BMD [11], [12], [13], [14] Để chẩn đoán sớm tiên lượng nguy loãng xương gãy xương phụ nữ mãn kinh nhằm dự phòng điều trị kịp thời, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam” với mục tiêu là: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T phụ nữ mãn kinh Việt Nam Xác định mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU I Thông tin Họ tên: Tuổi: Giới tính: Dân tộc: Khu vực sinh sống: 1.Nơng thơn 2.Thành thị Trình độ học vấn: 1.Cấp I 2.Cấp II 3.Cấp III 4.Đại học 5.Sau đại học 6.Không rõ II Các số nhân trắc Chiều cao (cm): Chiều cao tối đa (cm): Cân nặng (kg): Chiều dài chân (cm): Chiều dài đùi (cm): Chiều dài cẳng chân (cm): Sải tay (cm): Vòng ngực (cm): Vòng eo (cm): Vòng mơng (cm): III Chỉ số sinh tồn: Nhiệt độ (oC): Nhịp thở (lần/phút): Nhịp tim (lần/phút): Huyết áp tâm thu (mmHg): Huyết áp tâm trương (mmHg): IV Tiền sử: Tiền sử gãy xương: Số lần gãy xương: Số lần chẩn đoán X Quang: Năm bị gãy xương: Vị trí gãy: Mức độ gãy: Tiền sử gia đình có bị lỗng xương khơng: Tiền sử gia đình có bị gãy xương lỗng xương khơng: Tiền sử mắc bệnh mạn tính: Tiền sử dùng thuốc kéo dài (≥1 tháng): V Tiền sử kinh nguyệt – thai nghén – sản phụ khoa: Bắt đầu hành kinh năm tuổi: Thời gian hành kinh kéo dài ngày: Chu kì kinh kéo dài ngày: Chu kì kinh có đặn khơng: Trung bình năm bác có chu kì kinh: Bác có chưa: Bác có cho bú khơng: Bác có lần đầu năm tuổi: Bác có người con: Bác mang thai lần: Bác có lần sinh non khơng: Bác có lần xảy thai khơng: Bác mãn kinh năm tuổi (mãn kinh định nghĩa kinh hoàn toàn 12 tháng): Năm tuổi bác có biểu tiền mãn kinh (cơn bốc hỏa, chống váng, nhức đầu, buồn nơn, đánh trơng ngực, da khô, mỏng, nhăn nheo lớp mỡ da, khô âm đạo, teo âm hộ, giảm tiết chất nhờn, són tiểu, thay đổi tâm lý hay lo lắng cáu gắt): Năm tuổi bác bắt đầu thấy kinh nguyệt thay đổi (kinh nguyệt không đều, rong kinh, rong huyết liên quan đến mãn kinh): Bác dùng thuốc tránh thai chưa (loại thuốc, liều dùng, thời gian dùng): Bác dùng hormon thay sau mãn kinh chưa (loại hormon nào, liều dùng, thời gian dùng): VI Các số xét nghiệm cận lâm sàng: - Công thức máu: Hồng cầu(T/l): HGB(g/l): Hct(L/L): MCV(fl): MCH(pg): MCHC(g/l): % hồng cầu lưới: Bạch cầu(G/l): %NEUT: %LYMP: %MONO: %EUSI: %BASE: Tiểu cầu(G/l): - Yếu tố viêm: CRP: Máu lắng 1h: Máu lắng 2h: - Đơng máu: PT(%): PT time(s): PT-INR: APTT(s): Fibrinogen: - Hóa sinh máu: Ure(mmol/l): Creatinin(umol/l): ALT(UI/l): AST(UI/l): Ca2+ máu (mmol/l): Ion Ca2+ (mmol/l): Phụ lục 1: Tiêu chuẩn xác định gãy xương x quang A, Tiêu chí cho hình ảnh X Quang rõ nét Kiểm tra gãy đốt sống lỗng xương chủ yếu dựa vào hình ảnh X Quang, thường X Quang thẳng nghiêng cột sống lưng, thắt lưng Xác định mức độ gãy cần X Quang nghiêng đủ Khoảng cách từ tiêu điểm phát xạ đến phim (focus-to-film distance-FFD) thường 100 cm X Quang lưng tâm T7, thắt lưng L3 [72] X quang thẳng Để xác định số đốt sống hỗ trợ xác định gãy đốt sống Trong X Quang thẳng, thấy đốt sống rõ ràng, lưng từ C7-L1, thắt lưng từ T12-S1 Với đốt sống lưng, đỉnh cassette vai khoảng 5cm Với thắt lưng độ ưỡn tự nhiên, cột sống thẳng bàn chụp Phải gấp hông gối, có miếng để chân bên gối Định vị xác cách đếm từ xuống Theo hướng dẫn này, xác định bất thường số lượng đốt X Quang thẳng a) Lưng: C7-L1; b) Thắt lưng: T11-xương (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) Sự chuẩn trực tia X quan trọng với quan nhạy xạ ngực, tuyến giáp không cần chiếu mức, liều xạ tối thiểu tham khảo: Bảng Liều xạ X Quang phù hợp tương ứng với vị trí chụp Loại Liều lượng (mSv) Cột sống lưng Thẳng 0,4 1,2 Nghiêng 0,3 1,2 Cột sống thắt lưng Thẳng 0,7 1,2 Nghiêng 0,3 1,2 X Quang phổi thẳng 0,02 1,2 Pencil beam DXA < 0,001 Fan beam DXA ~ 0,01 QTC 0,06 Chuẩn trực phù hợp làm giảm rơi tia, cải thiện độ tương phản Với X Quang thẳng, chuẩn trực không nên hẹp X Quang nghiêng X Quang nghiêng quan trọng đánh giá gãy xương lỗng xương, cần phải ý thời gian tư chụp bệnh nhân Yếu tố quan trọng cột sống bệnh nhân phải song song với bàn chụp, tránh quay, vẹo, dễ gây nghiêng đốt sống Với X Quang nghiêng, đỉnh cassette vai bệnh nhân khoảng cm Với cột sống song song với phim/bàn chụp, đĩa đệm thẳng đứng so với phim song song với tia giúp hạn chế hiệu ứng song song tia X bị phân kỳ Có thể cần miếng thấu xạ (radiolucent pad) eo X Quang thắt lưng để kéo thẳng đốt sống lưng dưới, đảm bảo song song vói bàn chụp, tránh cong trước phim Nếu bệnh nhân bị vẹo cột sống, chỉnh hướng phát tia X phía đầu Với phần lưng trên, phải nâng cánh tay lên để tránh chồng lắp xương bả vai, nâng vừa phải không cao đầu Trong X Quang lưng, mép xương sườn làm mờ hình ảnh đĩa đệm Có thể khắc phục cách thở kéo dài khiến vết mờ di chuyển Bệnh nhân phải giữ tư chụp (2-4 giây) Điều khó với người già Liều xạ cao chút chụp với kỹ thuật thở kéo dài Chất lượng hình ảnh cải thiện nhiều cách đặt tờ giấy chì vào trục sau bàn chụp để làm giảm backscatter (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) X Quang nghiêng, thường vai, hông, gối mắt cá chồng lấp, nên đặt padding khuỷu tay, gối mắt cá để giữ tư Đốt sống thắt lưng phải song song với phim Nếu chụp tư nằm nghiêng, trục cột sống thường nghiêng theo hướng L1-L5, phải đặt miếng thấu xạ phần thắt lưng; xoay gốc tia X hướng chân, vuông góc với cột sống GHI CHÚ: - Xương đai vai trở ngại cho X Quang lưng trên, đặc biệt X Quang nghiêng May gãy xương loãng xương xảy T1-3 Tương tự vậy, L5 đơi khó quan sát X Quang nghiêng xương chậu - Do khác biệt hình dáng phần ngực, diện tim chồng lắp lên hình ảnh X Quang cột sống nên khó thấy rõ tồn cột sống lưng X Quang thẳng Hiệu ứng thường gặp bệnh nhân to người hay bị gù - Với bệnh nhân vẹo cột sống nhẹ, nên chụp tư nằm ép phần lồi cột sống vẹo cho cột sống thẳng nhiều ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GÃY XƯƠNG Trên X Quang nghiêng, đốt sống bình thường có dạng hình chữ nhật, đĩa (endplate) rõ, đậm nét (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) THANG BÁN ĐỊNH LƯỢNG GENANT Mức độ gãy đốt sống đánh giá lâm sàng chủ yếu phương pháp Genant Phương pháp bán định lượng đánh giá cách quan sát ước lượng giảm chiều cao thay đổi hình dáng đốt Có mức độ: + Độ 0: khơng giảm chiều cao thân sống (bình thường) + Độ 1: gãy nhẹ, giảm 20 - 25% chiều cao thân sống + Độ 2: gãy vừa, giảm 25 - 40% chiều cao thân sống + Độ 3: gãy nặng, giảm > 40% chiều cao thân sống (Genant HK et al (1993) JBMR 8(9): 1137-1148) Thay đổi hình dáng đốt (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) Thang Genant dễ dàng xác định gãy vừa nặng Với gãy nhẹ vào tiêu chí đĩa đốt xét không tiếp giáp, không song song với đĩa đốt kế cận Một ưu điểm Genant mức độ nặng nhẹ không tỷ lệ với loại gãy (nêm-wedge, lõm-biconcavity hay nén-crush) THANG ĐỊNH LƯỢNG Nhằm khắc phục tính ước lượng thang Genant Phương pháp tính cụ thể chiều cao đốt (Ha, Hm, Hp), suy tỷ lệ (Ha/ Hp, Hm/ Hp, Hp/ Hp-1, Hp/ Hp+1), so sánh với giá trị tham chiếu chuẩn người bình thường đưa kết luận Là gãy xương thay đổi tỷ lệ > lần độ lệch chuẩn Trên X Quang nghiêng, thân đốt chia thành trục: trước (anterior), (middle) sau (posterior) cách đặt điểm phim: điểm đĩa tương ứng điểm đĩa Nguyên tắc đặt điểm: điểm bên tận mép đĩa cùng, điểm (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) Phụ lục 2: Tách DNA từ máu toàn phần Sử dụng Kit OMEGA: Lấy 300ul máu, sau bổ sung thêm 900ul Cell Lysis Solution => Mix Ủ 10 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14500 rcf 30 giây Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul Nucleic Lysis Solution => Mix Bổ sung 100ul Protein Precipitation Solution Vortex 20 giây Ly tâm 16000 rcf phút Chuyển sịch sang ống eppendorf có chứa 300ul Isopropanol => Mix Ly tâm 16000 rcf phút 10.Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul ethanol 70% 11.Ly tâm 16000 rcf phút => Loại bỏ dịch 12.Làm khô mẫu 15 phút máy hút chân không 13.Bổ sung 100ul nước 3D/ DNA Rehydration Solution Ủ 65°C 4°C qua đêm Mơ hình nghiên cứu Bệnh nhân đến khám bệnh viện Đồng ý tham gia nghiên cứu làm câu hỏi Thăm khám lâm sàng Đo mật độ xương chụp X Quang Lấy máu làm xét nghiệm Tách DNA từ máu tồn phần Phân tích mẫu DNA thu xác định kiểu gen C677T MTHFR Xử lý số liệu hoàn thành nghiên cứu ... lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T phụ nữ mãn kinh Việt Nam Xác định mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam 3 Chương TỔNG QUAN. .. mãn kinh nhằm dự phòng điều trị kịp thời, tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam với mục... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUY N THANH TÙNG NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY XƯƠNG ĐốT SèNG ë PHơ N÷ M·N KINH VIƯT NAM