Kỹ thuật tách nuôi cấy và dung hợp tế bào trần protoplast ---------- o 0 ---------- a. Khái niệm tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên trong và bên ngoài tế bào trần. b. Phương pháp tách tế bào trần * Nguyên tắc: - Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần. - Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu như saccarose, manitol, sorbitol, Ca 2+ … - Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp với từng loại cây trồng. Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần. * Các bước tiến hành - Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù. - Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl 2 , đường monitol …0,5÷0,7M) - Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza - Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm. - Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có mật độ phù hợp (10 4 ÷10 7 /ml) Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần + Ở cây thuốc lá Nguyên liệu thực vật: lá thứ 3 từ trên xuống. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 1% macerozyme 0,02% driselaza0,05% Thời gian ủ: 16h (ngâm qua đêm) + Ở cây ngô Nguyên liệu thực vật: tế bào hạt phấn. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 2% macerozyme 0,1% pectolyaza 0,05% Thời gian ủ: 4÷12h (ngâm qua đêm) Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50÷80μm, rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm. c. Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng * Quá trình tái sinh: - Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn + Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chia tạo thành cụm nhỏ tế bào (4÷10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh sáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hoặc bán lỏng. Môi trương cần giàu dinh dưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp. Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ dưỡng. + Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sạo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc. Cần chú ý tới tỷ lệ và hàm lượng Auxin và xytokinin để tái được cây từ callus. - Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh đối với các tế bào có nguồn gốc protoplast: + Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), ví dụ tế bào protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá. + Thông qua con đường phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), ví dụ các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù một số loài cây thuộc họ hoà thảo. Nếu đảm bảo được môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ hình thành sau khoảng 3÷5 tuần. Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, các biến đổi di truyền có thể xảy ra. Ví dụ, trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, con lai là cây 4n. Protoplast TÕ bµo M« / khèi m« Ph¸t sinh chåi / rÔH×nh thµnh cÊu tróc ph«i C©y hoµn chØnh Organogenesis Embryogenesis Protoplast tái sinh vỏ tế bào và phân chia tạo microcallus Callus phát triển từ microcallus Callus trên môi trường tái sinh * Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần - Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu một số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường như: sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào. + Ammonium nitrate, Calcium: kích thích sự phân chia tế bào. + Bổ sung các thành phần hữu cơ: insitol, nicotinic acid, pyridoxine, thiamin, glycine, fonic acid và biotin. + Casein hydrolysate, D-Ca- pantothenate, choline chloride, cysteine, malic acid, ascorbic acid, adenine sulfate, riboflavin và glutamine: có tác dụng tăng nhanh sự tổng hợp vỏ tế bào và kích thích sự phân chia tế bào. + Auxin (NAA và 2,4D 0,45÷10,7μM) và Cytokinin (BA, zeatin 2÷5μM; nước dừa 20÷40ml/l. + Đường manitol, sorbitol 0,3÷0,7M; Sucrose và glucose 0,2÷0,6M. - Điều kiện nuôi cấy + Cường độ chiếu sáng: nuôi cấy protoplast trong tối hoặc trong điều kiện ánh sáng đã lọc bớt. + Chất lượng ánh sáng: ánh sáng trắng là tốt nhất, ánh sáng xanh và đỏ gây ức chế sự hình thành chồi. + Nhiệt độ: các protoplast thường được nuôi cấy ở 20÷25 0 C. * Dung hợp protoplast: có 2 phương pháp - Dung hợp bằng hoá chất + Năm 1972, Calson tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào protoplast dung hợp trong môi trường bổ sung NaNO 3 . + Năm 1974, Melchers phát hiện ra môi trường dung hợp tế bào trần gồm 50mM Ca 2+ , 0,4M manitol, pH 10,5 tỏ ra thích hợp cho dung hợp tế bào trần nhiều loài cây trồng khác nhau. + Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylenglycol) có tác dụng làm tăng hiệu quả dung hợp của protoplast. Khi được ngâm vào dung dịch PEG (20÷40% w/v), các protoplast kết dính lại với nhau. Sau đó, PEG được rửa bằng dung dịch Ca 2+ có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast sẽ dung hợp với nhau. Do PEG độc với tế bào, nồng độ PEG thường được giảm đi và bổ sung thêm vào đó DMSO (dimethyl sulfuside). - Dung hợp bằng xung điện: đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần vào một điện trường, các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa hai bản cực. Khi có một xung điện cao (750÷1000V) trong một thời gian rất ngắn (1÷200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, hai tế bào trần hoà nhập vào nhau - qua trình dung hợp sẽ xảy ra. Xung điện Hình ảnh dung hợp tế bào trần nhờ xung điện ở cây yến mạch d. Ứng dụng của protoplast * Dung hợp protoplast - Khi các tế bào trần dung hợp với nhau và tạo thành một tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền tất cả các bố mẹ. Các tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào soma nên gọi là lai soma. - Chọn lọc các thể lai soma + Do lai ngẫu nhiên nên có thể A+B→AB A+A→AA B+B→BB + Các cách chọn lọc thể lai vô tính • Phương pháp tế bào học • Phân tích isoenzym • Lai ADN, PCR • Trồng cây tái sinh và đánh giá các đặc điểm nông sinh học… * Chọn dòng tế bào - Xử lý đột biến tế bào trần rồi đưa chúng vào tình trạng stress để thanh lọc nhằm chọn ra các dòng có tính chống chịu với điều kiện bất thuận. Các tế bào sống sót trong các test thanh lọc sẽ được tái sinh thành cây để khảo sát tính chống chịu của chúng. - Một số hệ thống chọn lọc: + Chọn lọc dòng tế bào kháng kháng sinh, các dòng tế bào kháng sâu bệnh, chịu thuốc trừ cỏ, chịu điều kiện bất thuận, và các dòng tế bào có khả năng sinh trưởng trên các amono acid đặc thù trong số những acid amin khác. + Chọn các dòng tế bào có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp. * Biến nạp di truyền - Nhận biết gen thông qua chức năng sinh học ( tính trạng liên quan đến đặc điểm hình thái, đặc điểm chức năng…). Xác định điều kiện đặc trưng cho quá trình biểu hiện và kìm hãm gen. - Gen gắn với các vectơ: thông thường người ta sử dụng các loại plasmid mang gen kháng sinh để tiện lợi cho việc chọn lọc sản phẩm biến nạp sau này. - Chuyển gen vào protoplast: có nhiều phương pháp chuyển gen bằng hoá học, xung điện, súng bắn gen, thông qua vi khuẩn Agrobacterium. - Chọn lọc sản phẩm biến nạp. - Đánh giá kết quả và theo dõi biểu hiện của gen biến nạp. Protoplast ngay sau khi tách Tế bào giống, loài A Tế bào giống ,loài B Tế bào lai soma mang đặc của cả hai giống, loài A và B [...]... của kỹ thuật này là mẫu nuôi cấy được bảo quản trong nitơ lỏng, và trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng • Có thể bảo quản mẫu được 20÷30 năm hoặc lâu hơn.Trước khi đưa vào bảo quản mẫu cần được xử lý để tránh tạo thành các tinh thể nước kết tinh gây chết mẫu + Đối tượng: mẫu đem bảo quản thường ở dạng phôi, mô sẹo, các mô nuôi cấy + Các bước tiến hành: • Nuôi cấy in vitro và. .. mô nuôi cấy + Các bước tiến hành: • Nuôi cấy in vitro và tách mẫu ở pha tăng trưởng mạnh để đưa vào bảo quản • Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu cấy: mẫu được xử lý bằng dung dịch 5÷10% prolin, manitol 3÷6% có bổ sung chất chống đông là dung dịch DMSO 1M+ glycerol 1M+ đường saccarose 2M… • Xử lý lạnh đến nhiệt độ đông băng ổn định của tế bào chất (-30÷-400C) • Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -1960C (trong... gian cấy chuyển là 25÷52 tuần Những loài cay nhiệt đới thường bảo quản ở nhiệt độ cao hơn Ví dụ: chuối giữ được 15 tháng ở 15 0C, cọ dầu bảo quản ở 180C Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy ABA (axit abcisic), CCC (Clo Cholin Clorit) Chất gây áp suất thẩm thấu: manitol, sorbitol, saccarose Thay đổi điều kiện nuôi cấy: giảm cường độ chiếu sáng, giảm nồng độ ôxi… Ví dụ: nuôi cấy khoai... tây, khoai lang…) Mẫu đưa vào bảo quản thường ở các dạng phôi, chồi, mầm, cây con + Các bước tiến hành: • Chuẩn bị mẫu: mẫu phải đảm bảo sạch bệnh • Đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy có bổ sung các nhân tố nhằm ức chế sinh trưởng Các nhân tố gây ức chế sinh trưởng thường dùng là: Giảm nhiệt độ của phòng nuôi Với loài cây chịu lạnh nhiệt độ bảo quản từ 0÷50C Ví dụ: chồi cây thông và cây táo giữ được 52...Câu 7 Trình bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro o 0 o -a Mục đích của bảo quản nguồn gen in vitro Mục đích cơ bản của việc bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung để làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách hợp lý cho hiện tại và trong tương lai b Các phương pháp... chiếu sáng, giảm nồng độ ôxi… Ví dụ: nuôi cấy khoai tây ở 220C và môio trường có 5÷10mg/l ABA thì thời gian cấy chuyển kéo dài tới 12 tháng; cây sắn nuôi cấy ở 20 0C trong môi trường có 4% saccarose có thể kéo dài thời gian cấy chuyển tới 15 tháng • Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản, mẫu bảo quản cần được chuyển sang môi trường mới pha chế và đặt trong điều kiện tối thích một thời gian ngắn để kích... nhưng có thể lưu giữ một số lượng lớn cá thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp có hiệu quả đối với các cây trồng nhân vô tính và hạt cây dễ mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp c Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro Có hai phương pháp bảo quản in vitro: bảo quản sinh trưởng tối thiểu và bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời - Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu... điểm: • Đặc điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển nhờ ức chế sinh trưởng của mẫu cấy để giảm tới mức tối thiểu chi phí trong quá trình bảo quản • Trong thời gian bảo quản mô và tế bào thực vật vẫn tiếp tục sinh trưởng nhưng với tốc độ rất chậm • Thời gian bảo quản sinh trưởng chậm có thể kéo dài một vài năm + Đối tượng: phương pháp này thường áp dụng cho việc bảo quản... định của tế bào chất (-30÷-400C) • Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -1960C (trong nitơ lỏng) Mẫu sau thời gian bảo quản khi lấy ra được phá băng ở nhiệt độ 37÷40 0C Mẫu sẽ được phục hồi sinh trưởng và có thể tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh ... được duy trì tại điều kiện sinh thái tự nhiên của chúng - Bảo quản Ex-situ là bảo quản các mẫu trong điều kiện nhân tạo tối ưu Bảo quản ex xitu đóng vai trò quan trọng trong xây dựng các ngân hàng gen và được sử dụng rộng rãi cho bất kì loại cây trồng nào Những hình thức bảo quản ex xitu khác nhau + Bảo quản cây trong vườn ươm tạo thành field bank + Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed bank + . Kỹ thuật tách nuôi cấy và dung hợp tế bào trần protoplast ---------- o 0 ---------- a. Khái niệm tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực. xúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, hai tế bào trần hoà nhập vào nhau - qua trình dung hợp sẽ xảy ra. Xung điện Hình ảnh dung hợp tế bào trần nhờ xung điện