ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số : 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS Đỗ Hữu Nghị 2.TS Nguyễn Xuân Vũ Thái Nguyên 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ quy tắc Kết trình bày luận văn thu thập trình nghiên cứu trung thực, chưa công bố trước Thái Nguyên, tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Xuân Thành Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Luận văn thực phịng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) có liên quan đến nội dung nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang nội hàm cao phục vụ sàng lọc, đánh giá hợp chất có hoạt tính chống ung thư mức độ tế bào hướng đích phân tử" (VAST 04.05/18-19) Để hồn thành luận văn tơi nhận động viên, giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân tập thể Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Hữu Nghị TS Nguyễn Xuân Vũ, người thầy trực tiếp hướng dẫn tơi tận tình q trình thực đề tài, giúp tơi vượt qua khó khăn hồn thành tốt luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Hồng Nhung cán phịng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, cán Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên giúp đỡ, trang bị kiến thức tạo điều kiện cho tơi q trình học tập Cuối tơi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ động viên tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tầm quan trọng ý nghĩa vấn đề cần nghiên cứu 1.2 Tổng quan vấn đề nghiên cứu .2 1.2.1 Tổng quan ung thư .2 1.2.2 Ung thư cổ tử cung 1.2.3 Sàng lọc hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.2.4 Hoạt tính điều hịa chu kỳ tế bào (cell cycle) 11 1.2.5 Hoạt tính điều hịa yếu tố nhân kappa B (NF-B) 12 1.2.6 Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào đích phân tử 15 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ nghiên cứu tối ưu kỹ thuật huỳnh quang tế bào 22 2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng chất thử phân tích tín hiệu huỳnh quang đặc trưng 22 2.2.3.Nghiên cứu phát chuyển vị yếu tố nhân NF-κB 22 2.3 Vật liệu 22 2.3.1.Dòng tế bào 22 2.3.2.Mẫu thử nghiệm .22 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv 2.3.3 Môi trường nuôi cấy tế bào 23 2.3.4 Hóa chất thiết bị 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu .24 2.4.1 Ni cấy hoạt hóa tế bào 24 2.4.2 Đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào – phương pháp MTT .25 2.4.3 Kích hoạt yếu tố NF-κB 27 2.4.4 Cố định tế bào 27 2.4.5 Nhuộm huỳnh quang tế bào đích phân tử 28 2.4.6 Thu nhận phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào hệ Olympus scanR 28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư .30 3.2 Đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB dòng tế bào HeLa 32 3.2.1 Kích thích chuyển vị NF-κB 32 3.2.2 Thu nhận hình ảnh huỳnh quang 33 3.2.3 Thiết lập thơng số phân tích hình ảnh 35 3.2.4 Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB .37 3.2.5 Thử nghiệm hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB tế bào HeLa 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 Kết luận .43 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHLB: Cơng hịa liên bang CTC: Cổ tử cung DMEM: Dulbecco’s modified Eagle medium – Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM DMSO: Dimethyl Sunfoxide EMEM: Eagle’s Minium Essential Medium – Môi trường EMEM GFP: Green fluorescent protein – Protein huỳnh quang xanh HBV: Hepatitis B virus – Viêm gan B HCTN: Hợp chất tự nhiên HCV: Hepatitis C virus – Viêm gan C Hela: Human cervical cancer cells – Tế bào ung thư cổ tử cung Hep-G2: Hepatocellular carcinoma – Tế bào ung thư gan HPV: Human papilloma virus – Virus u nhú người IC50: Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế 50% cá thể KHCNVN: Khoa học công nghệ Việt Nam MTT: Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide NF-κB: Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – Yếu tố nhân kappa B OD: Optical density – Mật độ quang học PBS: Phosphate buffer saline – Đệm muối phosphate TB: Tế bào Tp: Thành phố UTCTC: Ung thư cổ tử cung UTG: Ung thư gan Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Danh sách mẫu hóa học sử dụng nghiên cứu sàng số hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 23 Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào số mẫu hợp chất thiên nhiên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa 30 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết bệnh ung thư toàn giới năm 2018 hai giới Hình 1.3: Sự phát triển tế bào ung thư Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan bệnh viêm 13 Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang 21 Hình 2.1: Cấu trúc phân tử tetrazolium formazan 26 Hình 3.1: Biểu đồ khả ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa nồng độ khác mẫu tinh có biểu hoạt tính 32 Hình 3.3: Tương quan nồng độ chất cảm ứng chuyển vị NF-κB dòng tế bào HeLa Các chất tiền viêm cytokine: IL-1 (─●─) TNF ( ▲ ) 33 Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa kênh lọc DAPI theo peak chỉnh tinh (Fine) chỉnh thô (Coarse) trục Z 34 Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65 (GFP-p65), DNA nhân tế bào (DAPI) chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE) Hình ảnh ghi thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR 35 Hình 3.6: Lựa chọn thơng số xác định viền kích thước hình ảnh đối tượng phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 36 Hình 3.7: Tạo thơng số xác định đường viền đối tượng phân tích Main Object (kênh DAPI) phần Sub-Object (tương ứng vùng tế bào chất “CytoI”, kênh GFP) Hình ảnh đường viền phân tách tốt với khoảng cách (distance) = -1 37 Hình 3.8: Phân tích hình ảnh thực phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB IL-110 ng/mL 30 phút 38 Hình 3.9: Phân tích chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang protein p65 vùng tế bào chất nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 39 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn viii Hình 3.10: Xác định hệ số Z' nhóm đối chứng (control) tế bào HeLa kích hoạt với cytokine (hình-bảng trên) Biểu đồ phân tán cường độ tín hiệu vùng tế bào chất nhân với đối chứng Control (-) kích hoạt với IL-1 (hình dưới) 41 Hình 3.11: Hợp chất SHTN-Zer4 điều hịa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB) tế bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa chuyển vị NF-κB (p65 gắn GFP) Nhân xác định đồng thời với nhuộm DAPI 42 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 34 Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa kênh lọc DAPI theo peak chỉnh tinh (Fine) chỉnh thô (Coarse) trục Z Từ hình ảnh lấy nét Autofocus thu cho thấy việc thu nhận phân tích hình ảnh tự động kính hiển vi huỳnh quang đạt đủ điều kiện để thực phân tích Để phát NF-κB kích hoạt TNF-, sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang với kháng thể sơ cấp anti-p65 NF-κB liên kết huỳnh quang xanh phát kênh GFP, kích thích λ=488nm Đồng thời, nhân tế bào nhuộm với huỳnh quang DAPI, kích thích λ=405nm Kết thu hình ảnh rõ, đủ chất lượng phân tích (Hình 3.5) Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 35 GFP-p65 DAPI MERGE Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65 (GFPp65), DNA nhân tế bào (DAPI) chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE) Hình ảnh ghi thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR 3.2.3 Thiết lập thơng số phân tích hình ảnh Tương tự phương pháp đề cập trên, sau thu nhận hình ảnh huỳnh quang, kết phân tích off-line sử dụng phần mềm scanˆR Analysis ver.2.7.2 Phần mềm cho phép phân tích tự động dựa thông số thiết lập cho đối tượng phân tử đích cần đánh giá Để xác định phân tích hình ảnh huỳnh quang, đối tượng định dạng dựa công thức đẳng chu: Trong : fcirc: hệ số định dạng đối tượng phân tích (dạng cầu hình sao); A: diện tích; P: chu vi Từ sổ Modify Object Boundaries Assay Settings đặt thơng số lựa chọn viền hình ảnh (Selectivity) theo hình ảnh thực từ tín hiệu huỳnh quang thu Đồng thời xác định kích thước tối đa khung đối tượng phân tích (Max object size) cho xác định tối đa đối tượng, mặt khác loại bỏ nhiễu tín hiệu khơng đủ chất lượng phân tích Như thể thông số viền phù hợp (Selectivity: 0,45) kích thước tối đa