ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********************** ĐOÀN THỊ DẬU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI CẤY VÀ PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỨC NĂNG TY THỂ CỦA TẾ BÀO CƠ TIM CHUỘT H9C2 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** ĐOÀN THỊ DẬU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI CẤY VÀPHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỨC NĂNG TY THỂ CỦA TẾ BÀO CƠ TIM CHUỘT H9C2 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ THỊ THU Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu, người quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập thực đề tài luận văn cao học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô giáo, bạn học viên, sinh viên làm việc học tập phòng thí nghiệm ni cấy tế bào, Bộ môn Sinh lý học Sinh học người, Trung tâm Khoa học sống, Khoa sinh học, bạn học viên lớp K25 cao học Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đặc biệt Ths Ngô Thị Hải Yến, người đồng hành giúp đỡ, hỗ trợ tơi nhiều q trình học tập, làm việc thực luận văn Tôi xin cảm ơn anh, chị, bạn bè đồng nghiệp khoa Truyền máu Bệnh viện Nhi Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt qúa trình học tập thực luận văn Luận văn thực với hỗ trợ kinh phí đề tài Nafosted, mã số 106-YS.06-2016.23 trang thết bị, sở vật chất phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, Bộ môn Sinh lý học Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Trân trọng! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Đoàn Thị Dậu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tim mạch 1.2 Các dòng tế bào tim sử dụng nghiên cứu bệnh tim 1.3 Tế bào tim chuột H9C2 .5 1.3.1 Nguồn gốc, đặc điểm tế bào H9C2 .5 1.3.2 Tình hình sử dụng tế bào H9C2 nghiên cứu bệnh tim 1.4 Ty thể bệnh tim .8 1.4.1 Cấu trúc chức ty thể .8 1.4.2 Rối loạn chức ty thể bệnh tim mạch .9 1.4.3 Nghiên cứu ty thể dòng tế bào H9C2 11 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Mẫu nghiên cứu .14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Phòng ni, thiết bị 14 2.2 Phƣơng pháp 15 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 15 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .16 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Quy trình ni cấy tế bào H9C2 điều kiện thƣờng .22 3.1.1 Hoạt hóa tế bào H9C2 .22 3.1.2 Cấy chuyển tế bào H9C2 25 3.1.3 Bảo quản tế bào H9C2 28 3.2 Quy trình gây mơ hình TMTTMCT (HR) tế bào H9C2 31 3.2.1 Mơ hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 31 3.2.2 Mơ hình TMTTMCT sử dụng buồng thiếu oxy (buồng hypoxia) 35 3.3 Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2 42 3.3.1 Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2 42 3.3.2 Kết thử nghiệm quy trình phân tích ty thể .43 KẾT LUẬN .47 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tế bào tim Hình 1.2 Hình thái tế bào H9C2 Hình 1.3 Cấu trúc ty thể Hình 1.4 Ty thể chế bệnh sinh nhiều bệnh tim mạch Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 15 Hình 2.2 Quy trình chung ni cấy tế bào H9C2 theo hướng dẫn ATCC 16 Hình 3.1 Các bước hoạt hóa tế bào H9C2 nghiên cứu 24 Hình 3.2 Ảnh tế bào H9C2 sau hoạt hóa 24h 25 Hình 3.3 Ảnh tế bào H9C2 phát triển tốt sau hoạt hóa thời gian 26 Hình 3.4 Các bước cấy chuyển tế bào H9C2 nghiên cứu 27 Hình 3.5 Ảnh đại diện ghi nhận phát triển tế bào sau cấy chuyển số mốc thời gian 29 Hình 3.6 Các bước bảo quản tế bào H9C2 nghiên cứu 30 Hình 3.7 Các bước gây mơ hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 tế bào H9C2 nghiên cứu 32 Hình 3.8 Ảnh hưởng CoCl2 lên tế bào H9C2 34 Hình 3.9 Ảnh hưởng CoCl2 lên khả sống tế bào H9C2 35 Hình 3.10 Nguyên vật liệu cần thiết để tạo buồng hypoxia 37 Hình 3.11 Buồng hypoxia sau hồn thành 37 Hình 3.12 Các bước sử dụng buồng hypoxia 39 Hình 3.13 Các bước gây mơ hình HR sử dụng buồng hypoxia tế bào H9C2 Hình 3.14 Tỷ lệ tế bào sống thử nghiệm buồng hypoxia 41 Hình 3.15 Tế bào H9C2 điều kiện thiếu oxy/tái cung cấp oxy 42 Hình 3.16 Các bước phân tích ty thể tế bào H9C2 44 Hình 3.17 Mật độ huỳnh quang NAO ty thể tế bào H9C2 nuôi điều kiện khác 45 Hình 3.18 Mật độ ty thể tế bào H9C2 điều kiện khác 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các môi trường, hóa chất sử dụng nghiên cứu 144 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu 155 Bảng 3.1 Ảnh hưởng CoCl2 nồng độ tới khả sống tế bào H9C2… 345 Bảng 3.2 Tỷ lệ tế bào H9C2 sống thử nghiệm buồng hypoxia……………… 40 Bảng 3.3 Tỷ lệ mật độ huỳnh quang NAO ty thể tế bào H9C2 nuôi điều kiện khác ……………………………………………………………… 45 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CAD Coronary artery disease (Bệnh xơ vữa động mạch) CS Cộng CVD Cardiovascular diseases (Bệnh tim mạch) CCK-8 Cell-counting kit-8 ESCs Tế bào gốc phôi chuột HR Hypoxia/reoxygenation (Thiếu oxy/tái cung cấp oxy) iPSCs Tế bào gốc đa cảm ứng LDH Lactate dehydrogenase MTG MitoTracker Green NAO 10-N-nonyl-acridine orange ROS Reactive oxygen spicies (Gốc tự oxy hóa) TMTTMCT Thiếu máu tái tƣới máu tim ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch bệnh lý có khả gây tử vong cao giới nói chung Việt Nam nói riêng Dữ liệu khoa học cho thấy, tổn thƣơng bệnh lý tim mạch có liên quan nhiều đến thay đổi cấu trúc chức ty thể tế bào tim [2, 75] Vì vậy, nghiên cứu phƣơng pháp phòng chống bệnh tim mạch hƣớng đích ty thể thu hút quan tâm đặc biệt nhà khoa học Thực tế, nhiều nghiên cứu tập trung phân tích thay đổi cấu trúc chức bào quan nhƣ khả tổng hợp lƣợng ATP, thành phần lipid màng, giá trị điện lớp màng ty thể hay hoạt động chuỗi hô hấp ty thể [40, 53] Việc phân tích số chức ty thể sở để đánh giá ảnh hƣởng thuốc chất lên ty thể nhƣ tế bào tim Tế bào H9C2 dòng tế bào có nguồn gốc từ mơ tim phôi thai chuột BDX1 [41] thƣờng đƣợc sử dụng mơ hình nghiên cứu bệnh tim nhƣ thiếu máu cục tim, phì đại tim, nghiên cứu ảnh hƣởng độc tố, nghiên cứu sàng lọc tạo thuốc Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu sử dụng tế bào để thiết kế mơ hình bệnh tim mạch Do vậy, việc xây dựng hoàn thiện quy trình ni cấy tế bào ổn định, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam nhằm phục vụ nghiên cứu chuyên sâu cần thiết Với định hƣớng phát triển nghiên cứu thực nghiệm bệnh tim, đặc biệt bệnh thiếu máu cục tim sở sử dụng dòng tế bào H9C2 Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình ni cấy phân tích số số chức ty thể tế bào tim chuột H9C2” đƣợc thực với hai mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình ni cấy dòng tế bào tim chuột H9C2 - Phân tích số số chức ty thể tế bào tim chuột H9C2 Đề tài nằm khuôn khổ nội dung nghiên cứu đề tài Nafosted “Nghiên cứu, sàng lọc chất c tác dụng bảo vệ tim hƣớng đích ty thể sử dụng mơ hình thiếu máu cục tim tim chuột cô lập tế bào tim chuột nuôi cấy”, mã số 106-YS.06-2016.23 Nghiên cứu đƣợc thực phòng Thí nghiệm thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, Bộ môn Sinh lý học Sinh học ngƣời, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tim mạch Bệnh tim mạch (cardiovascular diseases - CVD) gồm nhóm bệnh liên quan đến hệ thống tim mạch nhƣ: bệnh động mạch vành, đau thắt ngực, đột qụy, bệnh tim bẩm sinh, bệnh van tim, phình động mạch chủ….[10] Bệnh lý có nguy gây tử vong cao có tính chất đột ngột Trên giới, năm 2016 c khoảng 17,6 triệu ngƣời chết bệnh tim mạch [10] Tỷ lệ tử vong sớm bệnh tim mạch dao động từ 4% (ở nƣớc thu nhập cao) đến 42% (ở nƣớc thu nhập thấp) [63] Mặc dù CVD thƣờng ảnh hƣởng đến ngƣời trƣởng thành giai đoạn sau đời, triệu chứng nhƣ xơ vữa động mạch thƣờng bắt đầu sớm hơn, việc phòng ngừa sớm quan trọng [48] Những tiến khoa học gần giúp làm sáng tỏ nguyên nhân bệnh tim Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu thƣờng sử dụng mơ hình khác hƣớng tập trung vào sinh lý bệnh ứng dụng điều trị bệnh Bên cạnh vấn đề đạo đức nghiên cứu, việc thực nghiệm phân tích bệnh lý tim cấp độ tế bào, mô tim ngƣời bệnh gần nhƣ thực Để giải vấn đề này, nhiều loài động vật nhƣ lợn, thỏ, chuột trở thành đối tƣợng nghiên cứu mức độ tƣơng đồng chúng so với ngƣời thƣờng đƣợc lựa chọn để thay Từ nguồn động vật này, nhiều dòng tế bào tim đƣợc lập, ni cấy trì với yêu cầu kỹ thuật không phức tạp, giúp chúng trở thành đối tƣợng lý tƣởng cho nghiên cứu chế sinh bệnh lý tim phân tích dƣợc lý liên quan [51] 1.2 Các dòng tế bào tim sử dụng nghiên cứu bệnh tim Nghiên cứu bệnh tim dùng loại tế bào đƣợc phân lập trực tiếp từ tim ni cấy (primary cultural cells), dòng tế bào tim (cardiomyocyte cell lines) dòng tế bào mang số đặc điểm tế bào tim (cardiomyogenic cell lines) Tuy nhiên, việc phân lập tế bào từ mô tim nuôi cấy tƣơng đối phức tạp, phải chịu áp lực mặt thời gian tế bào có thời gian sống ngắn, nên chúng thƣờng đƣợc sử dụng sau giai đoạn thử nghiệm dòng tế bào ni cấy ổn định Do vậy, giai đoạn thử nghiệm nghiên cứu bệnh tim mạch cấp độ tế bào, dòng tế bào tim ni ổn định hay A B Hình 3.34 Tỷ lệ tế bào sống thử nghiệm buồng hypoxia HR1: Tế bào nuôi điều kiện thiếu oxy 6h tái cung cấp oxy 36h; HR2: Tế bào nuôi điều kiện thiếu oxy 10h tái cung cấp oxy 36h; A)Mật độ 5000 tế bào/giếng; B) Mật độ 10000 tế bào/giếng; thí nghiệm lặp lại lần; *(p