ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS Đặng Tiến Trường TS Trần Đức Long Hà Nội – 10/2019 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu thực nghiệm để hồn thành luận văn, tơi may mắn nhận hỗ trợ vật chất tinh thần từ thầy cô, cộng bạn bè Tôi trân trọng giúp đỡ q báu Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS Đặng Tiến Trường – Phó Chủ nhiệm Bộ mơn Giải Phẫu, Học viện Qn Y, người trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, kĩ chuyên ngành tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu ngày hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Đức Long – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người hỗ trợ, động viên, bảo tơi khắc phục thiếu sót truyền cho kinh nghiệm quý báu suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đặc biệt thầy cô Bộ môn Di truyền học - người giảng dạy cho tơi q trình học tập; cán Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y, đặc biệt ThS.BS Nguyễn Minh Tâm, cán Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW Bệnh viện Nam Học Hiếm muộn Hà Nội tận tình hỗ trợ tơi suốt q trình thu mẫu Cuối tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới người bạn, người anh chị em Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN – chỗ dựa tinh thần vững bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ, cổ vũ giúp tơi vượt qua giai đoạn khó khăn sống nói chung q trình hồn thiện luận văn nói riêng Một lần tơi xin chân thành cảm ơn ghi nhớ Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2019 Học viên Nguyễn Kim Ngân Nguyễn Kim Ngân – K26 CH MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh hemophilia A 1.1.1 Tổng quan hemophilia A 1.1.2 Cơ sở phân tử bệnh 1.1.3 Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A 11 1.2 Chẩn đốn trước chuyển phơi Hemophilia A 15 1.2.1 Kỹ thuật chẩn đốn trước chuyển phơi 15 1.2.2 Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A 16 1.3 Phân tích di truyền liên kết 19 1.3.1 Ứng dụng phân tích di truyền liên kết 19 1.3.2 Chỉ thị phân tử STR 21 1.3.3 Các số đa hình di truyền 22 1.4 Kỹ thuật PCR đa mồi 22 1.5 Kỹ thuật điện di mao quản 24 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 26 2.2.2 Cơng thức tính cỡ mẫu nghiên cứu đa hình gen 27 2.2.3 Sơ đồ nghiên cứu 28 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 29 2.4 Các kỹ thuật sử dụng 29 2.4.1 Giai đoạn tối ưu xác định tính đa hình 29 2.4.2 Giai đoạn áp dụng phân tích di truyền trước chuyển phôi 38 2.4.3 Giai đoạn xác nhận kết chẩn đoán trước sinh 39 2.5 Các tiêu nghiên cứu 40 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 2.6 Địa điểm thời gian nghiên cứu 40 2.7 Vấn đề y đức đạo đức nghiên cứu 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT-M hemophilia A Việt Nam 41 3.1.1 Các STR nằm cách gen F8 1Mb 41 3.1.2 Kết tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại STR 42 3.1.3 Chỉ số đa hình số dị hợp tử STR 48 3.1.4 Chuẩn hóa quy trình PGT-M mẫu tế bào phơi 52 3.2 Áp dụng thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A 56 3.2.1 Áp dụng quy trình PGT-M gia đình bệnh nhân 56 3.2.2 Kết mang thai chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 Kết luận 68 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu lâm sàng Bảng Các phương pháp phát đột biến gây bệnh hemophilia 10 Bảng Một số STR sử dụng chẩn đoán Hemophilia A .18 Bảng Thành phần D2 32 Bảng Thành phần Mastermix 33 Bảng Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 34 Bảng Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi 34 Bảng Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang 35 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang 35 Bảng 10 Thông tin mồi huỳnh quang .36 Bảng 11 Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản 36 Bảng 12 Chu trình nhiệt biến tính DNA 36 Bảng 13 Thông tin STR sử dụng nghiên cứu 42 Bảng 14 Trình tự mồi khuếch đại thị STR 43 Bảng 15 Kết nồng độ độ tinh DNA tách từ mẫu máu 44 Bảng 16 Nồng độ mồi phản ứng PCR đa mồi 47 Bảng 17 Kết tính tốn số Ho, He, PIC 49 Bảng 18 Kết nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phôi bào phục vụ tối ưu hóa 52 Bảng 19 Kết phân tích đột biến gen F8 phơi IVF 63 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu biến dạng khớp Hình Vị trí gen tổng hợp FVIII Hình Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Việt Nam .6 Hình Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 Hình Cơ chế đột biến đảo đoạn intron Hình Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A 11 Hình Vị trí mồi A, B, P, Q Long-range PCR phát đảo đoạn int22 gen F8 12 Hình Kết LD-PCR phát đảo đoạn int22 gen F8 .13 Hình Vị trí cắt giới hạn enzyme BclI 14 Hình 10 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen 16 Hình 11 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 24 Hình 12 Sơ đồ nghiên cứu 28 Hình 13 Phần mềm Tandem Repeat Finder số thiết đặt để sàng lọc 30 Hình 14 Giao diện phân tích kết phần mềm Genemapper 4.0 .37 Hình 15 Sơ đồ vị trí STR sử dụng nghiên cứu NST X .41 Hình 16 Kết tối ưu hóa mồi X1 đến X5 dải nhiệt độ 55, 60, 65 44 Hình 17 Kết tối ưu hóa mồi X6 đến X10 dải nhiệt độ 55, 60, 65oC 44 Hình 18 Kết tối ưu hóa mồi X11 đến X15 dải nhiệt độ 55, 60, 65oC 45 Hình 19 Kết điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có .46 Hình 20 Kết điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có nồng độ phản ứng hiệu chỉnh 48 Hình 21 Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho quần thể nghiên cứu 50 Hình 22 Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He quần thể nghiên cứu 50 Hình 23 Biểu đồ số đa hình PIC quần thể nghiên cứu .51 Hình 24 Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử thị STR bên gen F8 52 Hình 25 Kết tối ưu hóa phôi bào .53 Hình 26 Kết tối ưu hóa phơi bào .54 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Hình 27 Kết tối ưu hóa phơi bào .54 Hình 28 Kết tối ưu hóa phơi bào .55 Hình 29 Kết tối ưu hóa phơi bào .55 Hình 30 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q1 57 Hình 31 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q2 58 Hình 32 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q3 59 Hình 33 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q4 60 Hình 34 Kết phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A gia đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu 62 Hình 35 Kết chẩn đốn trước sinh Longrange PCR Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực 64 Hình 36 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, dịch ối 65 Hình 37 Kết chẩn đốn trước sinh phân tích di truyền liên kết sử dụng STR thiết kế 66 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADO Bp CGH CSGE DHPLC DNA DOP F8 Nghĩa tiếng Anh Allele drop out Mất allele base pair Cặp bazơ nitơ Comparative genomic hybridization Lai so sánh hệ gen Conformation sensitive gel Điện di phân biệt cấu hình phân electrophoresis tử Denaturing high pressure Sắc ký lỏng biến tính hiệu liquid chromatography cao Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Degenerate oligonucleotide primed F8 gene Khuếch đại mồi thối hóa Gen quy định yếu tố VIII Yếu tố VIII FVIII FISH Nghĩa tiếng Việt Fluorescence in situ hybridization Lai huỳnh quang chỗ Ho Observed Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử quan sát He Expected Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử lý thuyết Int1 Intron Intron Int22 Intron 22 Intron 22 I-PCR Inversion PCR PCR phát đảo đoạn In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm Intra-cytoplasmic sperm Tiêm tinh trùng vào bào tương injection trứng IVF ICSI MDA Mbp Multiple displacement amplification Mega base pair Khuếch đại đa điểm thay Triệu cặp bazơ nitơ Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Multiplex ligation dependent Nhân đoạn đầu dò phụ probe amplification thuộc vào phản ứng nối NST Chromosome Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase Preimplantation genetic Chẩn đoán di truyền trước chuyển diagnosis phôi Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing chuyển phôi Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing for Aneuploidies chuyển phôi phát dị bội MLPA PGD PGT PGT – A PIC Polymorphism Information Content Hàm lượng thơng tin tính đa hình Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing for monogenic/single chuyển phôi phát bệnh đơn gene disorders gen Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing for chromosome chuyển phôi phát rối loạn cấu structural rearrangements trúc nhiễm sắc thể STR Short tandem repeat Trình tự lặp WGA Whole genome amplification Khuếch đại tồn hệ gen µl Microliter Micro lít µM Micromole Micro mol PGT – M PGT – SR Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 10 Butler J M (2006), "Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing", Journal of forensic sciences 51(2), pp 253-265 11 Butler J M (2007), "Short tandem repeat typing technologies used in human identity testing", Biotechniques 43(4), pp Sii-Sv 12 Castaldo G., V D'Argenio, P Nardiello, F Zarrilli, V Sanna, A Rocino, A Coppola, G Di Minno and F Salvatore (2007), "Haemophilia A: molecular insights", Clinical Chemical Laboratory Medicine 45(4), pp 450-461 13 Chamberlain J S., R A Gibbs, J E Rainer, P N Nguyen and C Thomas (1988), "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification", Nucleic acids research 16(23), pp 11141-11156 14 Cooke H (1976), "Repeated sequence specific to human males", Nature 262, pp 182-186 15 Cora N I R., F I Delgado, S M M Ramírez and J V Quiđones (2017), "Acquired Hemophilia A in an advanced age patient of hispanic origin: a case report", BMC research notes 10(1), pp 438 16 Cumming A (2004), "The factor VIII gene intron inversion mutation: prevalence in severe hemophilia A patients in the UK", Journal of Thrombosis and Haemostasis 2(1), pp 205-206 17 Ding Q., Y Lu, J Dai, X Xi, X Wang and H Wang (2012), "Characterisation and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for genetic counselling in Chinese haemophilia A pedigrees", Haemophilia 18(4), pp 621-625 18 Eaton D., H Rodriguez and G A Vehar (1986), "Proteolytic processing of human factor VIII Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity", Biochemistry 25(2), pp 505-512 19 EL‐MAARRI O., U Herbiniaux, J Graw, J Schröder, A Terzic, M Watzka, H Brackmann, W Schramm, P Hanfland and R Schwaab (2005), "Analysis of mRNA in hemophilia A patients with undetectable mutations reveals normal splicing in the factor VIII gene", Journal of Thrombosis and Haemostasis 3(2), pp 332-339 70 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 20 Fisch E., E Fricke, S Baedker, U Deutsch, R Ahmed, D Loeffert and C Korfhage (2014), "Accurate Genome Analysis of Single Cells", Journal of Biomolecular Techniques : JBT 21 Forman E J., K H Hong, K M Ferry, X Tao, D Taylor, B Levy, N R Treff and R T Scott Jr (2013), "In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial", Fertility and sterility 100(1), pp 100-107 e1 22 Franchini M., M Montagnana, G Targher, D Veneri, M Zaffanello, G L Salvagno, F Manzato and G Lippi (2009), Interpatient phenotypic inconsistency in severe congenital hemophilia: a systematic review of the role of inherited thrombophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr 307-312 23 Ganguly A., T Dunbar, P Chen, L Godmilow and T Ganguly (2003), "Exon skipping caused by an intronic insertion of a young Alu Yb9 element leads to severe hemophilia A", Human genetics 113(4), pp 348-352 24 Gawad C., W Koh and S R Quake (2016), "Single-cell genome sequencing: current state of the science", Nature Reviews Genetics 17(3), pp 175 25 Goodeve A (2008), Molecular genetic testing of hemophilia A, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr 491-501 26 Goodeve A C., I Williams and G L Bray (2000), "Relationship between factor VIII mutation type and inhibitor development in a cohort of previously untreated patients treated with recombinant factor VIII (Recombinate™)", Thrombosis and haemostasis 83(6), pp 844-848 27 Graw J., H.-H Brackmann, J Oldenburg, R Schneppenheim, M Spannagl and R Schwaab (2005), "Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies", Nature Reviews Genetics 6(6), pp 488-501 28 Griffin D K., L J Wilton, A H Handvside, R M Winston and J D Delhanty (1992), "Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific probes for the sexing of human preimplantation embryonic nuclei", Human genetics 89(1), pp 18-22 71 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 29 Griffin D K., L J Wilton, A H Handyside, G Atkinson, R Winston and J Delhanty (1993), "Diagnosis of sex in preimplantation embryos by fluorescent in situ hybridisation", BMJ: British Medical Journal 306(6889), pp 1382 30 Grifo J A., B Hodes-Wertz, H.-L Lee, E Amperloquio, M Clarke-Williams and A Adler (2013), "Single thawed euploid embryo transfer improves IVF pregnancy, miscarriage, and multiple gestation outcomes and has similar implantation rates as egg donation", Journal of assisted reproduction and genetics 30(2), pp 259-264 31 Guo X and R J H h Elston (1999), "Linkage information content of polymorphic genetic markers" 49(2), pp 112-118 32 Harton G., M De Rycke, F Fiorentino, C Moutou, S SenGupta, J TraegerSynodinos and J J H r Harper (2010), "ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD" 26(1), pp 33-40 33 High K A (2012), "The gene therapy journey for hemophilia: are we there yet?", ASH Education Program Book 2012(1), pp 375-381 34 Hoffbrand V and P A Moss (2011), Essential haematology, Vol 28, John Wiley & Sons 35 Huang J., J Pang, T Watanabe, H.-K Ng and H Ohgaki (2009), "Whole genome amplification for array comparative genomic hybridization using DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded histological sections", The Journal of Molecular Diagnostics 11(2), pp 109-116 36 Jayandharan G R and A Srivastava (2008), The phenotypic heterogeneity of severe hemophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr 128-141 37 Justice U D o (2002), Using DNA to Solve Cold Cases, National Commission on the Future of DNA Evidence 38 Keeney S., M Mitchell and A Goodeve (2010), Practice Guidelines for the Molecular Diagnosis of Haemophilia A, chủ biên, UK Haemophilia Centre Doctors’ Organisation, CMGS Website 72 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 39 Kemball-Cook G., E G Tuddenham and A I Wacey (1998), "The factor VIII structure and mutation resource site: HAMSTeRS version 4", Nucleic acids research 26(1), pp 216-219 40 Kogan S C., M Doherty and J Gitschier (1987), "An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences", New England Journal of Medicine 317(16), pp 985-990 41 Lakich D., H H Kazazian, S E Antonarakis and J Gitschier (1993), "Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A", Nature genetics 5(3), pp 236-241 42 Laurie A., A Hill, J Harraway, A Fellowes, G Phillipson, P Benny, M Smith and P George (2010), "Preimplantation genetic diagnosis for hemophilia A using indirect linkage analysis and direct genotyping approaches", Journal of Thrombosis and Haemostasis 8(4), pp 783-789 43 Liu J., Q Liu, Y Liang, L Wang, G Nozary, B Xiao, Z Zhu, Y Zhou, L Liu and Y Guan (1999), "PCR assay for the inversion causing severe Hemophilia A and its application", Chinese medical journal 112(5), pp 419-423 44 Liu Q., G Nozari and S S Sommer (1998), "Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in hemophilia A", Blood 92(4), pp 1458-1459 45 Liu Q and S S Sommer (1998), "Subcycling-PCR for multiplex long-distance amplification of regions with high and low GC content: application to the inversion hotspot in the factor VIII gene", Biotechniques 25(6), pp 1022-1028 46 Lodish H (2004), Molecular Cell Biology, 5th, ed 47 Machado F and E MEDINA‐ACOSTA (2009), "High‐resolution combined linkage physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect haemophilia A carrier detection", Haemophilia 15(1), pp 297-308 48 Mannucci P M., R E Schutgens, E Santagostino and E P Mauser-Bunschoten (2009), "How I treat age-related morbidities in elderly persons with hemophilia", Blood 114(26), pp 5256-5263 73 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 49 Mansouritorghabeh H., L Manavifar, A Banihashem, A Modaresi, A Shirdel, M Shahroudian, G Shoja-e-Razavi, H Pousti and H Esmaily (2013), "An investigation of the spectrum of common and rare inherited coagulation disorders in North-Eastern Iran", Blood Transfusion 11(2), pp 233 50 Massaro J., C Wiezel, Y Muniz, E Rego, L De Oliveira, C MENDES‐JUNIOR and A Simões (2011), "Analysis of five polymorphic DNA markers for indirect genetic diagnosis of haemophilia A in the Brazilian population", Haemophilia 17(5), pp e936-e943 51 Mirchandani G G., J H Drake, S L Cook, B C Castrucci, H S Brown and C P Labaj (2011), "Surveillance of bleeding disorders, Texas, 2007", American journal of preventive medicine 41(6), pp S354-S359 52 MRC-Holland (2008), MRC-Holland,, truy cập ngày 29/9-2016, trang 53 Mühle C., M Zenker, N Chuzhanova and H Schneider (2007), "Recurrent inversion with concomitant deletion and insertion events in the coagulation factor VIII gene suggests a new mechanism for X‐chromosomal rearrangements causing hemophilia A", Human mutation 28(10), pp 1045-1045 54 Myrin‐Westesson L., F Baghaei and F Friberg (2013), "The experience of being a female carrier of haemophilia and the mother of a haemophilic child", Haemophilia 19(2), pp 219-224 55 Nakaya S., T C Hsu, S Geraghty, M Manco‐Johnson and A Thompson (2004), "Severe hemophilia A due to a 1.3 kb factor VIII gene deletion including exon 24: homologous recombination between 41 bp within an Alu repeat sequence in introns 23 and 24", Journal of Thrombosis and Haemostasis 2(11), pp 1941-1945 56 Nei M and A K Roychoudhury (1974), "Sampling variances of heterozygosity and genetic distance", Genetics 76(2), pp 379-390 57 Oldenburg J., V Ivaskevicius, S Rost, A Fregin, K White, E Holinski-Feder, C R Müller and B H Weber (2001), "Evaluation of DHPLC in the analysis of hemophilia A", Journal of biochemical and biophysical methods 47(1), pp 39-51 74 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 58 Oldenburg J., J Schröder, H H Brackmann, C Müller-Reible, R Schwaab and E Tuddenham (2004), Environmental and genetic factors influencing inhibitor development, Seminars in hematology, Elsevier, tr 82-88 59 Oldenburg J., J Schröder, J Graw, V Ivaskevicius, H Brackmann, W Schramm, C Müller, E Seifried and R Schwaab (2003), "[Significance of mutation analysis in patients with haemophilia A]", Hamostaseologie 23(1), pp 6-12 60 Peng W., H Takabayashi and K Ikawa (2007), "Whole genome amplification from single cells in preimplantation genetic diagnosis and prenatal diagnosis", European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 131(1), pp 13-20 61 Peyvandi F., G Jayandharan, M Chandy, A Srivastava, S Nakaya, M Johnson, A Thompson, A Goodeve, I Garagiola and S Lavoretano (2006), "Genetic diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders", Haemophilia 12(s3), pp 82-89 62 Piyamongkol W., M G Bermúdez, J C Harper and D Wells (2003), "Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop‐out in single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis", Molecular Human Reproduction 9(7), pp 411-420 63 Poláková H., I Zmetáková and L Kádasi (2003), "Long distance PCR in detection of inversion mutations of F8C gene in hemophilia A patients", General physiology and biophysics 22(2), pp 243-254 64 QIAGEN (2017), NGS using Whole Genome Amplified DNA, chủ biên 65 Radal K (1995), Structure and Biology of factor VIII, Hematology: Basic principles and practice, Vol 66 Ray P., R Winston and A Handyside (1995), Single cell analysis for diagnosis of cystic fibrosis and Lesch-Nyhan syndrome in human embryos before implantation, Nucleic Acids Symposium Series, [London]: Information Retrieval Ltd., c1979c2000., tr 46 75 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 67 Rosenthal A and D Jones (1990), "Genomic walking and sequencing by oligocassette mediated polymerase chain reaction", Nucleic acids research 18(10), pp 3095 68 Rossetti L C., A Goodeve, I B Larripa and C D De Brasi (2004), "Homeologous recombination between AluSx‐sequences as a cause of hemophilia", Human mutation 24(5), pp 440-440 69 Rossetti L C., C P Radic, I B Larripa and C D De Brasi (2005), "Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR", Clinical chemistry 51(7), pp 1154-1158 70 Santacroce R., M Acquila, D Belvini, G Castaldo, I Garagiola, S Giacomelli, A Lombardi, B Minuti, F Riccardi and R Salviato (2008), "Identification of 217 unreported mutations in the F8 gene in a group of 1,410 unselected Italian patients with hemophilia A", Journal of human genetics 53(3), pp 275-284 71 Santagostino E., M Mancuso, A Tripodi, V Chantarangkul, M Clerici, I Garagiola and P Mannucci (2010), "Severe hemophilia with mild bleeding phenotype: molecular characterization and global coagulation profile", Journal of Thrombosis and Haemostasis 8(4), pp 737-743 72 Shrestha S., S Dong, Z Li, Z Huang and F Zheng (2016), "Evaluation of factor VIII polymorphic short tandem repeat markers in linkage analysis for carrier diagnosis of hemophilia A", Biomedical Reports 5(2), pp 228-232 73 Stern H (2014), "Preimplantation genetic diagnosis: prenatal testing for embryos finally achieving its potential", Journal of clinical medicine 3(1), pp 280-309 74 Stonebraker J S., P H BOLTON‐MAGGS, J Michael Soucie, I Walker and M Brooker (2010), "A study of variations in the reported haemophilia A prevalence around the world", Haemophilia 16(1), pp 20-32 75 Sukarova E., A Dimovski, P Tchacarova, G Petkov and G Efremov (2001), "An Alu insert as the cause of a severe form of hemophilia A", Acta haematologica 106(3), pp 126-129 76 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 76 Thornhill A R and K Snow (2002), "Molecular diagnostics in preimplantation genetic diagnosis", The Journal of molecular diagnostics: JMD 4(1), pp 11 77 Van de Water N., R Williams, P Ockelford and P Browett (1998), "A 20.7 kb deletion within the factor VIII gene associated with LINE-1 element insertion", Thrombosis and haemostasis 79(5), pp 938-942 78 Weir B., J Reynolds and K Dodds (1990), "The variance of sample heterozygosity", Theoretical population biology 37(1), pp 235-253 79 Witt M and R P Erickson (1989), "A rapid method for detection of Ychromosomal DNA from dried blood specimens by the polymerase chain reaction", Human genetics 82(3), pp 271-274 80 Zhang L., X Cui, K Schmitt, R Hubert, W Navidi and N Arnheim (1992), "Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis", Proceedings of the National Academy of Sciences 89(13), pp 5847-5851 81 Zhao M., M Chen, A S Tan, F S Cheah, J Mathew, P.-C Wong and S S Chong (2017), "Single‐tube tetradecaplex panel of highly polymorphic microsatellite markers< Mb from F8 for simplified preimplantation genetic diagnosis of hemophilia A", Journal of Thrombosis and Haemostasis 15(7), pp 1473-1483 Tài liệu tham khảo trang web: 82 Hối rối loạn đông máu Việt Nam (2017), Việt Nam có khoảng 30.000 người phụ nữ mang gen bệnh "Rối loạn chảy máu", Viện Huyết học Truyền máu TW, truy cập ngày 13/8-2019, trang web https://www.nihbt.org.vn/hemophilia/viet-nam-cokhoang-30-000-nguoi-phu-nu-mang-gen-benh-roi-loan-chay-mau/p205i19234.html 83 Viện Y học ứng dụng Việt Nam Bệnh ưa chảy máu - Hemophilia, truy cập ngày 04/09-2019, trang web http://vienyhocungdung.vn/benh-ua-chay-mau- hemophilia-20161027112625228.htm 84 Bệnh viện Nam học muộn Hà Nội Thụ tinh ống nghiệm (IVF), truy cập ngày 28/9-2019, trang web https://afhanoi.com/thu-tinh-ong-nghiem 85 Silas H Haemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, https://www.slideshare.net/HelaoSilas/haemophilia-76369646 77 trang web Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 86 Bệnh viện Nhi trung ương Phác đồ chẩn đoán điều trị bệnh Hemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, trang web http://benhviennhitrunguong.org.vn/phac-do-chandoan-dieu-tri-benh-hemophilia.html 87 Bệnh viện Phụ sản trung ương, Các phương pháp chẩn đoán trước sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung Ương, truy cập ngày 13/8-2019, trang web http://benhvienphusantrunguong.org.vn/news/tin-tuc-su-kien/cac-phuong-phapchan-doan-truoc-sinh.html 88 Viện huyết học - Truyền máu Trung Ương Xét nghiệm ối loại trừ bệnh máu khó đơng Hemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, trang web https://www.nihbt.org.vn/hemophilia/xet-nghiem-oi-loai-tru-benh-mau-kho-donghemophilia/p205i15521.html 78 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH PHỤ LỤC Tần số allele STR 50 mẫu không mang gen bệnh (1): F8Int21 116-128 Allele Tần suất 114 117 119 120 13 121 122 15 123 124 40 125 126 127 DXS1073 152-172 Allele Tần suất 151 153 154 13 155 156 35 158 26 159 160 162 164 166 167 168 169 171 HEMA154130.5 179-215 Allele Tần suất 166 168 190 191 192 193 194 16 195 196 25 197 198 200 208 11 209 210 11 211 212 213 217 HEMA154498.9 235-267 Allele Tần suất 210 236 17 237 238 26 239 240 255 256 257 258 12 259 260 261 262 263 264 265 266 F8Int13.2 309-321 Allele Tần suất 308 309 22 310 311 35 312 313 19 314 315 316 317 REN90682 129-143 Allele Tần suất 126 13 127 128 35 129 130 132 134 21 135 136 138 F8Int25.2 175-181 Allele Tần suất 173 174 175 10 176 177 33 179 45 180 181 211 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR 50 mẫu không mang gen bệnh (2): F8Int22 207-217 Allele Tần suất 206 208 40 209 210 34 211 212 213 THLMEInt2 234-256 Allele Tần suất 247 248 249 12 250 251 23 252 13 253 12 254 255 11 256 260 261 F8Int1 188-198 Allele Tần suất 194 15 195 196 45 197 198 26 201 stSG604486 226-238 Allele Tần suất 232 233 234 235 36 236 237 239 20 240 241 245 REN90833 251-275 Allele Tần suất 256 260 38 261 264 267 268 271 15 272 276 279 THLMEInt1.1 289-319 Allele Tần suất 297 298 301 24 302 16 303 305 11 306 17 310 315 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR 103 mẫu mang gen bệnh (1): F8Int21 116-128 Allele Tần suất 119 120 25 121 50 122 123 124 34 125 77 126 127 133 DXS1073 152-172 Allele Tần suất 142 144 151 152 153 155 14 156 46 157 158 34 159 44 160 161 15 163 165 166 167 168 169 14 170 171 178 HEMA154130.5 179-215 Allele Tần suất 189 190 191 192 193 194 195 13 196 22 197 49 198 199 200 203 204 206 13 207 208 31 209 10 210 14 211 212 214 215 HEMA154498.9 235-267 Allele Tần suất 232 234 28 235 11 236 57 237 238 241 246 250 252 253 254 255 256 12 257 258 16 259 16 260 261 13 262 263 265 267 273 F8Int13.2 309-321 Allele Tần suất 304 307 308 309 11 310 22 311 21 312 45 313 54 314 315 28 316 317 319 REN90682 129-143 Allele Tần suất 121 123 124 125 126 127 21 128 17 129 63 130 131 133 16 134 15 135 34 136 139 23 F8Int25.2 175-181 Allele Tần suất 161 174 13 175 25 176 32 177 178 36 179 27 180 62 191 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR 103 mẫu mang gen bệnh (2): F8Int22 207-217 Allele Tần suất 196 207 34 208 47 209 43 210 68 211 212 220 THLMEInt2 234-256 Allele Tần suất 237 243 244 245 246 247 29 248 26 249 58 250 251 21 252 253 21 254 255 257 16 258 F8Int1 188-198 Allele Tần suất 192 193 195 196 48 197 64 198 52 199 23 200 201 202 205 207 208 stSG604486 226-238 Allele Tần suất 231 18 232 31 233 42 234 235 23 236 22 237 29 238 239 11 240 REN90833 251-275 Allele Tần suất 252 257 79 258 41 261 262 265 266 269 24 270 34 273 274 THLMEInt1.1 289-319 Allele Tần suất 297 298 299 301 23 302 23 303 56 305 16 306 17 307 45 308 309 310 311 12 312 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR tổng 153 mẫu (1): F8Int21 DXS1073 HEMA154130.5 HEMA154498.9 F8Int13.2 REN90682 F8Int25.2 116-128 152-172 179-215 235-267 309-321 129-143 175-181 Allele 114 117 119 120 121 122 123 124 125 126 127 133 Tần suất 38 60 16 12 76 83 Allele 142 144 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 178 Tần suất 12 17 80 60 45 15 16 Allele 168 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 Tần suất 1 11 22 19 47 58 10 13 42 11 27 Allele 232 234 235 236 237 238 239 240 241 246 250 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 Tần suất 28 11 74 28 1 1 7 15 10 28 18 15 14 Allele 304 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 319 Tần suất 34 29 56 49 73 30 HEMA154130.5 179-215 Allele Tần suất 214 215 217 Allele Tần suất 121 123 124 125 126 14 127 24 128 52 129 68 130 131 132 133 16 134 36 135 36 136 138 139 23 HEMA154498.9 235-267 Allele Tần suất 265 266 267 273 Allele 161 173 174 175 176 177 178 179 180 181 191 Tần suất 16 35 34 40 36 74 64 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR tổng 153 mẫu (2): F8Int22 207-217 Allele Tần suất 196 206 207 34 208 89 209 46 210 104 211 14 212 13 213 220 THLMEInt2 234-256 Allele Tần suất 233 234 235 236 237 239 243 244 245 246 247 31 248 27 249 70 250 16 251 44 252 19 253 33 254 255 12 256 257 16 258 260 261 F8Int1 188-198 Allele Tần suất 192 193 194 15 195 196 96 197 69 198 79 199 23 200 201 202 205 207 208 stSG604486 226-238 Allele Tần suất 231 18 232 33 233 51 234 13 235 59 236 27 237 38 238 239 31 240 241 245 257 REN90833 251-275 Allele Tần suất 252 256 257 79 258 41 260 58 261 11 262 264 265 266 267 268 269 24 270 34 271 16 272 273 274 276 279 THLMEInt1.1 289-319 Allele Tần suất 297 298 299 301 58 302 44 303 58 305 30 306 35 307 45 309 310 311 12 312 315 ... STR phục vụ PGT ch a đề cập quần thể người Việt Nam [2] Vì vậy, chúng tơi thực nghiên cứu Thiết kế thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi với hai mục tiêu: Thiết kế thị STR phục. .. vụ chẩn đoán hemophilia A cho quần thể người Việt Nam, đảm bảo liên kết chặt với gen F8 có số a hình cao quần thể Áp dụng thị thiết kế chẩn đoán di truyền trước chuyển phơi bệnh hemophilia A. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Chuyên ngành: Di truyền