Nghiên cứu thủy phân bã mía bằng hỗn hợp enzyme làm nguyên liệu để sản xuất cồn sinh học

74 5 0
  • Loading ...
1/74 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 07/05/2020, 23:23

BỘ GIÁO D DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN VI ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN LU VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC NGHIÊN CứU THủY TH PHÂN BÃ MÍA BằNG HỗN HợP P ENZYME LÀM NGUYÊN LI LIệU Để SảN XUấT CồN SINH HọC NGUYỄN NGUY HỒNG TRANG HÀ NỘI, 2017 BỘ Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN VI ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN LU VĂN THẠC SỸ NGHIÊN CứU THủY Y PHÂN BÃ MÍA BằNG B HỗN HợP P ENZYME LÀM NGUYÊN LIệU LI Để SảN XUấT CồN SINH HọC C NGUYễN HồNG TRANG CHUYÊN NGÀNH MÃ NGÀNH : CÔNG NGHệ SINH HọọC : 8420201 NGƯ ƯờI HƯớNG DẫN KHOA HọC TS Đỗ HữU NGHị HÀ NỘI, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu khoa học riêng hướng dẫn Tiến sĩ Đỗ Hữu Nghị Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Học viên Nguyễn Hồng Trang LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, nhận nhiều động viên, giúp đỡ cá nhân tập thể Trước tiên xin gửi lời biết ơn chân thành tới TS Đỗ Hữu Nghị – Trưởng phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm khoa học công nghệ, hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho nghiên cứu thực luận văn phòng Sinh học thực nghiệm Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới NCS Vũ Đình Giáp chú, anh chị cơng tác phòng SHTN ln nhiệt tình giúp đỡ, tạo cho môi trường nghiên cứu làm việc nghiêm túc Tôi xin gửi lời biết ơn tới ban lãnh đạo trường Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện tốt cho học tập phát triển Đồng thời xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy mơn giúp đỡ tơi suốt q trình tơi học tập trường Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, người thân, người sát cánh tôi, chia sẻ động viên không ngừng nỗ lực vươn lên học tập sống Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nguyễn Hồng Trang MỤC LỤC CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sản xuất sử dụng bã mía giớivà Việt Nam 1.1.1 Tình hình sản xuất bã mía Việt Nam 1.1.2 Hiện trạng sử dụng bã mía Việt Nam 1.2 Thành phần cấu trúc sinh khối thực vật chuyển hóa sinh khối enzyme thủy phân 1.2.1 Thành phần cấu trúc sinh khối thực vật 1.2.2 Hỗn hợp enzyme thủy phân 15 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất Bioethanol giới Việt Nam 17 1.3.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol giới 17 1.3.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol Việt Nam 19 CHƯƠNG II MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 2.2 Đối tượng nghiên cứu 21 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.4 Vật liệu nghiên cứu 22 2.4.1 Thiết bị 22 2.4.2 Hóa chất 22 2.5 Các phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Tối ưu tiền xử lý bã mía hỗn hợp enzyme thủy phân phương pháp quy hoạch thực nghiệm 23 2.5.2 Tiền xử lý bã mía phương pháp hóa học, kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân để nâng cao hiệu suất chuyển hóa đường 24 2.5.3 Phương pháp định lượng đường khử acid dinitrosalicylic (DNS) 25 2.5.4 Phương pháp kiểm tra thành phần đường có mẫu (TLC, HPLC) 27 2.5.5 Xác định hàm lượng cồn phương pháp chuẩn độ 28 2.5.6 Phương pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men 30 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Khảo sát nguồn chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa thành đường đơn xúc tác sinh học 32 3.2 Tối ưu tiền xử lý bã mía hỗn hợp enzyme thủy phân 33 3.3 Tiền xử lý bã mía phương pháp hóa học, kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân để nâng cao hiệu suất chuyển hóa đường 40 3.3.1 Tiền xử lý NaOH kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân 40 3.3.2 Tiền xử lý H2SO4 kết hợp sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân 43 3.4 Đánh giá hiệu chuyển hóa sử dụng hệ HPLC 45 3.5 Lên men sinh tổng hợp bioethanol 46 3.4.1 Khảo sát môi trường lên men 46 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình lên men 48 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình lên men 51 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men 53 3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nấm men đến trình lên men 55 3.4.6 Quy trình sản xuất Bioethanol từ bã mía Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần số nguyên liệu giàu lignocellulose Bảng Công thức môi trường A môi trường B 30 Bảng Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử phản ứng chuyển hóa bã mía hỗn hợp enzyme thủy phân 33 Bảng Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson 37 Bảng Kết thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson 37 Bảng Ma trận kế hoạch kết thực nghiệm 38 Bảng Hàm lượng đường khử sau tiền xử lý NaOH enzyme cocktail 40 Bảng Hàm lượng đường khử sau tiền xử lý H2SO4 enzyme cocktail 43 Bảng 10 Sản phẩm carbohydrate từ bã mía sau xúc tác chuyển hóa “enzyme cocktail” 46 Bảng 11 Hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành hai môi trường A B 46 Bảng 12 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng đường khử lại nồng độ ethanol tạo thành 49 Bảng 13 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành 51 Bảng 14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành 53 Bảng 15 Ảnh hưởng nồng độ nấm men đến hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành 55 DANH MỤC HÌNH Hình Hiện trạng sản xuất mía đường vùng Việt Nam Hình Cấu trúc lignocellulose Hình Mơ hình Fringed fibrillar mơ hình chuỗi gập Hình Các đơn vị lignin 10 Hình Cấu trúc lignin gỗ mềm với nhóm chức 12 Hình Hệ enzyme cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose 15 Hình Cấu trúc xylan công enzyme thủy phân khác 16 Hình Bã mía 21 Hình 10 Phương trình phản ứng tạo màu đường khử với dung dịch DNS 26 Hình 11 Sắc ký mỏng (TLC) chất rơm rạ (M1), bã mía (M2), bã cà phê( M3), mùn gỗ (M4), rong túi (M5) Các chất chuẩn đường khử có khả lên men: glucose (Rf (Glu) = 0,34), galactose (Rf(Gla)= 0,28), xylose (Rf(Xyl) = 0,48) mannose (Rf(Man) = 0,325) 32 Hình 12 So sánh hàm lượng đường khử sau thủy phân NaOH (GD1) sau xử lý phối hợp với hỗn hợp enzyme (GD2) 41 Hình 13 Bã mía sau tiền xử lý NaOH 42 Hình 14 Các mẫu bã mía sau tiền xử lý bổ sung hỗn hợp enzyme thủy phân 42 Hình 15 Đồ thị so sánh hàm lượng đường khử sinh mẫu GD1 GD2 43 Hình 16 Bã mía sau tiền xử lý H2SO4 44 Hình 17 Các mẫu bã mía sau tiền xử lý bổ sung hỗn hợp enzyme 45 Hình 18 Đồ thị so sánh hàm lượng đường khử ethanol tạo thành hai công thức môi trường 47 Hình 19 Hai môi trường A B trước lên men 48 Hình 20 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành theo thời gian 49 Hình 21 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành theo pH 52 Hình 22 Thí nghiệm sau lên men điều kiện pH khác 53 Hình 23 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử ethanol tạo thành theo nhiệt độ 54 Hình 24 Thí nghiệm sau lên men nhiệt độ khác 55 Hình 25 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử ethanol tạo thành theo nồng độ nấm men 56 Hình 26 Thí nghiệm sau lên men nồng độ nấm men khác 57 Thật vậy, nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng phát triển nấm men hoạt động enzyme chuyển hóa Các muối khống tham gia vào q trình trao đổi chất nấm men chất hoạt hóa enzyme, phần enzyme, phần trung tâm hoạt động enzyme Bảng kết cho ta thấy việc bổ sung muối khoáng thành phần dinh dưỡng làm tăng hiệu trình lên men, đạt giá trị tốt thời điểm 24 (4.6% chất) Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước thành phần môi trường lên men (trong nấm men công nghiệp – Lương Đức Phẩm sổ tay cơng nghệ lên men) Hình 19 Hai mơi trường A B trước lên men Với kết thu bước khảo sát này, kết luận môi trường lên men cần phải bổ sung thêm thành phần dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt cho q trình lên men Cơng thức mơi trường tối ưu mơi trường B trình bày bảng 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình lên men Tiến hành khảo sát thời gian cho q trình lên men Các thí nghiệm tiến hành điều kiện: 5% giống so với thể tích lên men, nhiệt độ 280C, pH 4.8 Đo hàm lượng đường khử hàm lượng ethanol tạo thành mốc thời gian trình bày mục 2.5.6 Thơng số kết trình bày bên 48 Bảng 12 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng đường khử lại nồng độ ethanol tạo thành STT 10 11 Thời gian (giờ) 12 24 30 36 48 54 60 72 78 81 OD620 0,243 0,440 0,960 1,045 1,059 1,235 1,296 1,357 1,694 1,702 1,679 Hàm lượng đường khử lại (mg/g) 83,36 81,76 79,81 78,56 77,23 76,24 74,34 73,85 72,01 71,22 70,36 16.00 Hàm lượng ethanol (g/l) 0,55 1,10 1,66 2,76 3,31 4,42 4,97 5,52 6,07 6,62 4,97 Hiệu suất (%) 1,2 2,3 3,5 5,8 6,9 9,2 10,4 11,5 12,7 13,8 10,4 85.000 13.800 14.00 80.000 12.00 10.00 75.000 8.00 Đường khử (mg/g) 70.000 6.00 4.00 Ethanol (%) 65.000 2.00 00 60.000 6h 12h 24h 30h 36h 48h 54h 60h 72h 78h 81h Thời gian Hình 20 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành theo thời gian Mật độ tế bào xác định bước sóng OD620 Thời gian tăng, mật độ tế bào lớn, chứng tỏ lượng sinh khối cao Trong 24 đầu, hàm lượng đường khử lại cao lượng ethanol sinh tương đối thấp Tại thời điểm 24 giờ, lượng cồn tạo thành 1.66 g/l, dung dịch lại 79.81 mg/g đường khử Trong khoảng thời gian 49 hiệu suất lên men không đáng kể Đây giai đoạn nấm men thích nghi với mơi trường, bắt đầu q trình sinh trưởng phát triển tăng sinh khối Từ 30 đến 54 giờ, hàm lượng đường khử lại giảm (từ 78.56 mg/g xuống 74.34 mg/g) Trong giai đoạn này, nấm men thích ứng với mơi trường tích lũy lượng sinh khối đáng kể Quá trình lên men diễn ra, nhiên, tốc độ lên men không cao, dẫn đến hiệu suất lên men tương đối thấp Hàm lượng ethanol tạo thành cao thời điểm 54 (10.4%) có xu hướng tiếp tục tăng thêm Trong giai đoạn 72 đến 78 giờ, hàm lượng đường khử lại tương đối tiếp tục giảm, hàm lượng ethanol tạo thành tăng mạnh, cao thời điểm 78 (6.62 g/l) Hiệu suất lên men thời điểm đạt giá trị cực đại (13.8%) giảm thời điểm 81 với hàm lượng ethanol tạo thành 10.4% Thật vậy, mật độ nấm men tăng, lượng sinh khối tích lũy lớn, q trình lên men diễn nhanh hàm lượng ethanol tạo thành cao Tuy nhiên, phát triển diễn giới hạn định Giai đoạn đầu, nấm men cần thời gian thích nghi tăng mật độ, tích lũy sinh khối Hàm lượng đường dung dịch giảm nấm men sử dụng cho trình sinh trưởng tăng sinh khối, trình lên men chưa diễn ra, lượng ethanol tạo thành không đáng kể Khi đạt giới hạn định, sinh khối đủ lớn, q trình lên men bắt đầu Lượng đường khử lại tỉ lệ nghịch với hàm lượng ethanol tạo thành Enzyme bắt đầu chuyển hóa glucose tạo ethanol CO2 Khi lượng ethanol tạo thành nhiều, ức chế phát triển tế bào nấm men, gây chết tế bào tạo sản phẩm phụ, thúc đẩy q trình chuyển hóa ethanol tạo thành hợp chất khác Do đó, hàm lượng ethanol lại có xu hướng giảm Với kết thu bước khảo sát này, kết luận 78 thời gian tốt để lên men tạo ethanol 50 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình lên men Thực khảo sát ảnh hưởng pH đến q trình lên men Các thí nghiệm tiến hành điều kiện: 5% giống, nhiệt độ 280C, thời gian 78 Điều chỉnh pH dung dịch lên men giá trị trình bày mục 2.5.6 Thơng số kết trình bày bên Bảng 13 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành Hàm lượng STT pH OD620 đường khử lại (mg/g) Hàm lượng ethanol (g/l) Hiệu suất (%) 1,395 78,21 3,31 6,9 4,3 1,467 76,43 4,42 9,2 4,6 1,559 74,53 4,97 10,4 4,9 1,573 73,42 5,52 11,5 5,2 1,607 71,77 6,07 12,7 5,5 1,393 72,63 4,97 10,4 1,070 75,08 3,31 6,9 14.00 80.000 12.650 12.00 78.000 10.00 76.000 8.00 74.000 6.00 71.768 72.000 4.00 70.000 2.00 00 68.000 4.3 4.6 4.9 5.2 5.5 pH 51 Đường khử (mg/g) Ethanol (%) Hình 21 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành theo pH Ở điều kiện pH khác nhau, lượng sinh khối tích lũy nấm men khả lên men khác Hàm lượng đường khử lại thấp hiệu suất ethanol cao giá trị pH = 5.2 (71.77 mg/g đường 12.7%) pH thấp,khả tích lũy sinh khối nấm men thấp, hiệu lên men khơng cao Khi tăng độ pH hàm lượng ethanol tạo thành mật độ tế bào giảm, thấp pH = (3.31 g/l ethanol OD620 = 1.070) Dựa vào kết trên, thấy, khoảng pH thuận lợi cho lên men 4.6 – 5.2, đó, nồng độ ethanol tạo thành hiệu suất lên men pH = 4.9 pH = 5.2 chênh lệch khơng nhiều Kết hồn tồn phù hợp với cơng trình nghiên cứu trước Thật vậy, hầu hết enzyme tế bào nấm men hoạt động vùng pH acid, enzyme có pH tối ưu riêng, enzyme alcohol dehydrogenase (enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa glucose thành ethanol) có giá trị pH tối ưu Khi pH bên ngồi mơi trường lệch so với pH tối ưu tế bào, nấm men cần lượng để bơm ion H+ vào hay để giữ pH tế bào ln ổn định Nếu pH ngồi môi trường lệch nhiều so với pH tối ưu, tế bào nấm men khó giữ ổn định, enzyme khơng hoạt động bình thường Một enzyme bị bất hoạt, nấm men khơng thể phát triển tạo ethanol hiệu quả.Thông thường, trình lên men diễn tốt khoảng pH 4.8 – 5.5 pH cao tạo điều kiện sản sinh chất phụ làm giảm hiệu suất trình lên men pH thấp ngăn cản hoạt động nấm men 52 Hình 22 Thí nghiệm sau lên men điều kiện pH khác Với kết thu bước khảo sát này, kết luận pH 5.2 giá trị pH tốt cho trình lên men 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men Mỗi vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu cho phát triển chúng Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm giới hạn 28 – 320C Tuy nhiên bắt đầu lên men nhiệt độ thấp khả lên men cao kéo dài Do đó, tiến hành khảo sát khả lên men nấm men S.cerevisiae nhiệt độ khác nhau, từ 23 – 340C (mục 2.5.6) 72h pH 5.2, nhằm tìm điều kiện tốt cho q trình lên men Thơng số kết trình bày sau Bảng 14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành STT Nhiệt độ 23 25 28 30 32 34 OD620 1,343 1,446 1,659 1,610 1,582 1,436 Hàm lượng đường khử lại (mg/g) 74,36 72,50 71,34 71,83 73,34 74,77 53 Hàm lượng ethanol (g/l) 4,42 4,97 5,52 6,07 4,97 3,86 Hiệu suất (%) 9,2 10,4 11,5 12,7 10,4 8,1 76.000 14.00 12.650 75.000 12.00 11.500 74.000 10.00 73.000 8.00 71.830 6.00 Đường khử (mg/g) 71.000 4.00 Ethanol (%) 70.000 2.00 69.000 00 72.000 71.339 23 25 28 30 32 34 Nhiệt độ Hình 23 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử ethanol tạo thành theo nhiệt độ Thông thường, tốc độ lên men tăng tăng nhiệt độ lên đến khoảng nhiệt độ tối ưu Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu khoảng nhiệt độ cho phát triển, sinh trưởng lên men phụ thuộc vào chủng vi sinh vật Từ bảng kết trên, nhận thấy, mật độ tế bào hàm lượng ethanol tạo thành nhiệt độ 280C, 300C cao (tương ứng với 11.5 % 12.7%) Hàm lượng đường khử lại so với thí nghiệm lại (71.34 mg/g 71.83 mg/g ) Tuy nhiên, hiệu suất lên men cao 300C Ở hai thí nghiệm với nhiệt độ 230C 250C, nấm men phát triển kém, lượng đường glucose sử dụng khơng nhiều, đó, hàm lượng đường khử lại cao hàm lượng ethanol tạo thành tương đối thấp Ở nhiệt độ 320C 340C, hoạt tính nấm men enzyme giảm nhanh lại tạo điều kiện thuận lợi cho số loại nấm men hoang dại phát triển Điều hoàn toàn phù hợp để giải thích độ đục tế bào sinh khối lắng xuống đáy ống nghiệm hai điều kiện nhiệt độ lại cao (hình 24) Mặt khác, nhiệt độ cao thúc đẩy tạo thành este aldehyl gây tổn thất ethanol Vì vậy, hàm lượng ethanol tạo thành hai điều kiện nhiệt độ tương đối thấp, khoảng 10.4% 8.1% 54 Hình 24 Thí nghiệm sau lên men nhiệt độ khác Với kết thu bước khảo sát này, kết luận nhiệt độ 300C giá trị tốt cho trình lên men 3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nấm men đến trình lên men Thực khảo sát ảnh hưởng nồng độ nấm men đến trình lên men Các thí nghiệm tiến hành điều kiện: nhiệt độ 300C, pH = 5.2, thời gian 78 % nấm men bổ sung mục 2.5.6 Thơng số kết trình bày bên Bảng 15 Ảnh hưởng nồng độ nấm men đến hàm lượng đường khử lại lượng ethanol tạo thành STT % nấm men 10 OD620 1,606 1,622 1,634 1,649 1,657 1,662 1,711 1,798 1,865 Hàm lượng đường khử (mg/g) 79,40 75,60 73,39 71,14 64,59 59,20 51,17 44,11 38,83 55 Hàm lượng ethanol (g/l) 4,42 4,97 6,07 6,62 6,07 5,52 4,97 3,86 2,76 Hiệu suất (%) 9,2 10,4 12,7 13,8 12,7 11,5 10,4 8,1 5,8 16.00 90.000 79.397 14.00 80.000 13.800 70.000 12.00 60.000 10.00 38.828 50.000 8.00 6.00 40.000 Đường khử (mg/g) 30.000 Ethanol (%) 4.00 20.000 2.00 10.000 00 000 10 % giống nấm men Hình 25 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử ethanol tạo thành theo nồng độ nấm men Dựa vào kết bảng trên, nhận thấy, với tỉ lệ tiếp giống 5%, hiệu suất ethanol tạo thành đạt giá trị cao với 13.8% Đối với tỉ lệ
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu thủy phân bã mía bằng hỗn hợp enzyme làm nguyên liệu để sản xuất cồn sinh học , Nghiên cứu thủy phân bã mía bằng hỗn hợp enzyme làm nguyên liệu để sản xuất cồn sinh học

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn