ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ TẠO AUTOVACCINE PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ TẠO AUTOVACCINE PHÒNG BỆNH Ngành: Ký sinh trùng Vi sinh vật học thú y Mã số : 9.64.01.04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Tô Long Thành TS Nguyễn Văn Quang THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi; số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc hoàn thành luận án cảm ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Mạnh Cường Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trong trình triển khai thực đề tài hồn thành luận án, tơi ln nhận quan tâm, giúp đỡ thày, cô, bạn đồng nghiệp, quan công tác gia đình Tơi xin trân trọng cảm ơn Khoa Chăn ni - Thú y, Phòng Đào tạo, Trường đại học Nông Lâm, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y, Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y, Chi cục Chăn nuôi - Thú y tỉnh Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực đề tài luận án Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thày hướng dẫn khoa học là: PGS.TS Tô Long Thành - Giám đốc Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y TS Nguyễn Văn Quang - Nguyên Trưởng Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thiện luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo tập thể cán Bộ môn Vi trùng - Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y, Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Công nghệ Phân tử - Viện Khoa học Sự sống Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện, giúp đỡ hướng dẫn thực thí nghiệm đề tài luận án Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thày, cô, bạn đồng nghiệp, học viên cao học, em sinh viên đặc biệt gia đình giúp đỡ, động viên, hỗ trợ thời gian qua để hoàn thành luận án Thái Nguyên, tháng 12 năm 2019 Tác giả Nguyễn Mạnh Cường Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i CẢM LỜI ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ vii VIẾT TẮT VÀ DANH KÝ HIỆU MỤC BẢNG ix CÁC DANH MỤC CÁC HÌNH xi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết tài đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học tài thực tiễn Những đóng góp tài: Chương 1: TỔNG LIỆU đề đề QUAN TÀI 1.1 Bệnh vi khuẩn Streptococcus suis (S suis) gây lợn người .4 1.1.1 Bệnh vi khuẩn .4 1.1.2 Bệnh vi khuẩn người Streptococcus suis Streptococcus gây suis gây lợn 1.2 Vi khuẩn suis S 1.2.1 Phân loại suis .9 S Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN khuẩn http://lrc.tnu.edu.vn 1.2.2 Hình thái tính suis chất ni 1.2.3 Đặc tính sinh hoá suis .11 cấy của vi vi khuẩn S khuẩn S 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên suis .11 vi khuẩn S 1.2.5 Các yếu tố độc lực suis .12 vi khuẩn S 1.3 Bệnh liên cầu khuẩn 14 lợn vi khuẩn S 1.3.1 Đặc điểm dịch 14 suis gây tễ học 1.3.2 Cơ chế bệnh 17 1.3.3 Triệu chứng lâm tích 19 1.3.4 Miễn dịch lợn suis .21 sàng chống Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN sinh vi khuẩn bệnh S http://lrc.tnu.edu.vn 1.3.5 Chẩn đoán 25 1.3.6 Phòng bệnh 29 1.3.7 Điều trị kháng sinh .33 Chương 2: NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Nội dung nghiên cứu .38 2.1.1 Nghiên cứu tình hình bệnh viêm phổi, viêm khớp lợn nuôi Thái Nguyên vi khuẩn S suis gây .38 2.1.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng S suis gây viêm phổi viêm khớp lợn Thái Nguyên 38 2.1.3 Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ chủng S suis phân lập 38 2.1.4 Nghiên cứu thử nghiệm biện pháp phòng, trị bệnh S suis gây lợn 38 2.2 Đối tượng, nguyên liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 39 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 39 2.2.2 Nguyên vật liệu .39 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 40 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 40 2.3.2 Thời gian nghiên cứu 40 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2.4 Phương pháp nghiên cứu .40 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 40 2.4.2 Phương pháp thu thập mẫu 42 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn S suis 42 2.4.4 Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn nhuộm Gram 43 2.4.5 Phương pháp thực phản ứng sinh hóa (Nhận biết cấp I) 43 2.4.6 Phương pháp thực Kit sinh hóa API 20 Strep (Nhận biết cấp II) .44 2.4.7 Phương pháp PCR để xác định serotype gây bệnh thơng thường gen mã hố số yếu tố độc lực vi khuẩn S suis .45 2.4.8 Phương pháp tính liều gây chết 50% (LD50) vi khuẩn S suis 45 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2.4.9 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 45 2.4.10 Phương pháp xác định độc lực chủng vi khuẩn S suis phân lập động vật thí nghiệm .46 2.4.11 Phương pháp xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn S suis phân lập .46 2.4.12 Xây dựng phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp .46 2.4.13 Phương pháp chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ chủng vi khuẩn S suis phân lập 47 2.4.14 Kiểm tra vô trùng, an tồn hiệu lực Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh liên cầu khuẩn (chi tiết trình bày phụ lục 11) 48 2.4.15 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch lợn sau tiêm Autovaccine 48 2.4.16 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể lợn tiêm Autovaccine phản ứng IHA .49 2.5 Phương pháp xử lý số liệu .50 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Tình hình lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 – 2017 tỉnh Thái Nguyên 51 3.1.1 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 - 2017 51 3.1.2 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp huyện, thành thuộc tỉnh Thái Nguyên 55 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 3.1.3 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp theo mùa vụ 58 3.1.4 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi 62 3.2 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng S suis phân lập 69 3.2.1 Kết phân lập vi khuẩn S suis từ lợn mắc viêm phổi viêm khớp Thái Nguyên 69 3.2.2 Kết giám định số đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn S suis phân lập 71 3.2.3 Kết xác định số đặc tính sinh vật, hoá học chủng vi khuẩn S suis phân lập Kit sinh hóa API 20 Strep 73 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC Phương pháp xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn S suis Cách tiến hành: vi khuẩn S suis nuôi cấy môi trường thạch TSA qua đêm Các khuẩn lạc vi khuẩn tạo huyền phù nước muối sinh lý 0,9% để độ đục tương đương ống McFarland (3 x 108 CFU/ml) Dùng tăm vô trùng, tẩm dung dịch pha loãng dàn lên thạch đĩa Muller Hinton, đặt khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt đĩa thạch Nuôi vi khuẩn 37oC/18 24 (5% CO2) Đọc kết cách đo đường kính vòng vơ khuẩn so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh chủng vi khuẩn kiểm tra bảng sau Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) TT Loại kháng sinh Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) Hàm lượng Mẫn cảm Mẫn cảm Kháng cao trung bình thuốc Ceftiofur 30 µg ≥ 21 18 - 20  17 Ampicillin 10 µg ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 Amoxicillin 20 µg ≥ 20 - ≤ 19 Neomycin 30 µg ≥ 17 13 - 16 ≤ 12 Ofloxacin µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Gentamicin 10 µg ≥ 19 - ≤ 15 Lincomycin 15 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Colistin 10 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Tetracyclin 30 µg ≥ 29 26 - 28 ≤ 25 10 Erythromycin 15 µg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 11 Florphenicol 30 µg ≥ 23 - ≤ 20 12 Penicillin G 10 µg ≥ 22 19 - 21 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN ≤ 18 http://lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC Giống vi khuẩn S suis Thạch Columbia Tủ ấm CO2/37oC/24h Chọn khuẩn lạc điển hình 10 ml nước thịt BHI Lắc 300 - 500 lần/phút Tủ ấm 37oC/24h Đạt tiêu chuẩn khiết Lắc 300 - 500 lần/phút Tủ ấm 37oC/24h Sản xuất giống cấp II (100 ml BHI), sau giống cấp III (1000 ml BHI) Đếm số lượng vi khuẩn Đạt tiêu chuẩn khiết Bổ sung fomalin tỷ lệ 0,3% Lắc 300 - 500 lần/phút Tủ ấm 37oC/24h Đạt tiêu vô trùng Trộn lẫn loại canh trùng theo tỷ lệ 1:1:1 Bổ sung keo phèn tỷ lệ 1/5 (20%) Đạt tiêu vô trùng Ra chai Kiểm tra Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn An tồn Vơ trùng Hiệu lực Sơ đồ 2: Tóm tắt quy trình chế tạo vaccine (Viện Thú y) (Theo quy trình sản xuất vaccine vơ hoạt bổ trợ keo phèn ni cấy tĩnh) Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP TÍNH LIỀU LD50 THEO REED-MUENCH (1938) TRÊN CHUỘT BẠCH Liều gây chết 50% (LD50) serotype 2, tính theo cơng thức sau: LgLD50 Trong đó: a  50  LgA   d a b A nồng độ pha loãng gây chết sát 50% chuột a tỷ lệ chuột chết liều A gây (%) b tỷ lệ chuột chết liều B gây (%) (cộng dồn), d lg nồng độ pha loãng Liều LD50 vi khuẩn S suis serotype Bảng 1: LD50 vi khuẩn S suis serotype Các giá trị tích lũy Độ pha lỗng canh khuẩn (CFU/ml) Số Số chuột chuột Chuột Tỷ lệ chết chuột chuột chuột chết sống thí cộng dồn tiêm chết sống cộng cộng nghiệm (%) (con) (con) (con) dồn dồn (con) (con) (con) (A) (B) (A+B) A/(A+B)x100 Số Số Số 10-1 5 36 36 100 10-2 5 31 31 100 10-3 5 26 26 100 10-4 5 21 21 100 10-5 5 16 16 100 10-6 11 12 91,66 10-7 10 70,0 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 10-8 10 40,0 - Xác định LD50 chủng S suis serotype 2: Ở độ pha lỗng 10-7 gây chết 70,0 % chuột thí nghiệm, giá trị cận gây chết 50%, giá trị cận 50% độ pha lỗng 10-8, gây chết 40,0 % chuột thí nghiệm Thay vào cơng thức ta có: 70 - 50 Lg LD50 = Lg 10-7 + xd 70 - 40 d Lg hệ số pha loãng = Lg10 Lg LD50 = Lg 10-7 + 0,66 x Lg 10 Vì Lg10 = nên ta suy Lg LD50 = -7 + 0,66 x = - 6,34 Tra máy tính: bấm số 10 nhấn vào X y, nhập -6,34 kết là: 4,57 x 10-7 Như giá trị LD50 chủng S suis serotype 4,5 x 107CFU/0,2ml Liều LD50 vi khuẩn S suis serotype Bảng 2: LD50 vi khuẩn S suis serotype Các giá trị tích lũy Độ pha loãng canh khuẩn (CFU/ml) Tỷ lệ chết cộng dồn Số Số (%) Số chuột chuột chuột Số chuột Số chuột Chuột tiêm chết sống chết cộng sống thí (con) (con) (con) dồn (con) cộng dồn nghiệm (con) (con) (A) (B) (A+B) A/(A+B)x100 10-1 5 37 37 100 10-2 5 32 32 100 10-3 5 27 27 100 10-4 5 22 22 100 -5 10 17 thông tin – ĐHTN Số hóa Trung tâm5Học liệu0và Cơng nghệ 17http://lrc.tnu.edu.vn 100 10-6 12 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN 13 92,30 http://lrc.tnu.edu.vn 10-7 5 87,50 10-8 33,33 - Xác định LD50 chủng S suis serotype 7: Ở độ pha loãng 10-7 gây chết 87,50 % chuột thí nghiệm, giá trị cận gây chết 50%, giá trị cận 50% độ pha loãng 10-8, gây chết 33.33 % chuột thí nghiệm Thay vào cơng thức ta có: Lg LD50 = Lg 10-7 + 87,50 - 50 xd 87,50 – 33,33 d Lg hệ số pha loãng = Lg10 Lg LD50 = Lg 10-7 + 0,69 x Lg 10 Vì Lg10 = nên ta suy Lg LD50 = -7 + 0,69 x = - 6,31 Tra máy tính: bấm số 10 nhấn vào X y, nhập -6,31 kết là: 4,9 x 10-7 Như giá trị LD50 chủng S suis serotype 4,9 x 107CFU/0,2ml Liều LD50 vi khuẩn S suis serotype Bảng 3: LD50 vi khuẩn S suis serotype Các giá trị tích lũy Độ pha Số Số Số Số chuột lỗng chuột chuột chuột Số chuột Chuột chết canh tiêm chết sống sống thí cộng khuẩn (con) (con) (con) cộng dồn nghiệm dồn (CFU/ml) (con) (con) (con) Tỷ lệ chết cộng dồn (%) (A) (B) (A+B) A/(A+B)x100 10-1 5 36 36 100 10-2 5 31 31 100 -3 10 5 26 26 100 10-4 5 21 21 100 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 10-5 5 16 16 100 10-6 5 11 11 100 10-7 85,71 10-8 33,33 - Xác định LD50 chủng S suis serotype 9: Ở độ pha loãng 10-7 gây chết 85,71 % chuột thí nghiệm, giá trị cận gây chết 50%, giá trị cận 50% độ pha loãng 10 -8, gây chết 33.33 % chuột thí nghiệm Thay vào cơng thức ta có: Lg LD50 = Lg 10-7 + 85,71 - 50 85,71 – 33,33 x d d Lg hệ số pha loãng = Lg10 Lg LD50 = Lg 10-7 + 0,68 x Lg 10 Vì Lg10 = nên ta suy Lg LD50 = -7 + 0,68 x = - 6,32 Tra máy tính: bấm số 10 nhấn vào X y, nhập -6,32 kết là: 4,8 x 10-7 Như giá trị LD50 chủng S suis serotype 4,8 x 107CFU/0,2ml Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC 10 MỘT SỐ LOẠI KHÁNG SINH VÀ THUỐC SỬ DỤNG CEFANEW- LA (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Ceftiofur : 10.000 mg Tá dược đặc biệt vừa đủ : 100ml Công dụng: Đặc trị viêm màng phổi, phổi dính sườn, hen suyễn viêm vú, viêm tử cung, viêm con, bệnh Tụ huyết trùng, Phó thương hàn, E coli sưng phù đầu, viêm ruột tiêu chảy, phân trắng lợn con, viêm da, viêm đa khớp, nhiễm trùng huyết, kế phát LMLM, kế phát hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản Các vi khuẩn Gram (+) Gram (-) nhạy cảm với Ceftiofur Cách dùng: Tiêm bắp thịt da, mũi tiêm tác dụng kéo dài 72 Liều lượng: Lợn: 1ml/20-25 kg TT Trâu, bò, dê: 1ml/45-60 kg TT Lợn con, chó, mèo: 1ml/12-18 kg TT MARFLO - 45% (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Florfenicol: Tá dược, dung môi đặc biệt vừa đủ: 45.000 mg 100ml Công dụng: Đặc trị ho hen, suyễn, lepto, viêm phổi hóa mủ, viêm phổi dính sườn, phó thương hàn, tụ huyết trùng, hồng lỵ, E coli sưng phù đầu, viêm ruột tiêu chảy, viêm vú, viêm tử cung, nhiễm trùng huyết gây liệt sau sinh Bệnh sốt vẹt, Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn bỏ ăn không rõ nguyên nhân Trị bệnh kế phát tai xanh… nhiều loại vi trùng bội nhiễm Tiêu chảy phân xanh, phân trắng gà, vịt, ngan, cút Cách dùng: Tiêm bắp thịt da Một mũi tiêm tác dụng kéo dài 72 Liều lượng: Lợn: 1ml/27-35kg TT Trâu, bò, dê, cừu: 1ml/45-47kg TT Gia cầm: 1ml/8-10kg TT MARPHAMOX - LA (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Amoxicilline : 15.000 mg Tá dược đặc biệt (axit Clavulalic ) dung môi hữu vừa đủ :100ml Công dụng: Đặc trị nhiễm khuẩn kế phát bệnh truyền nhiễm như: Sốt đỏ, bỏ ăn khơng rõ ngun nhân, viêm phổi, khó thở, lepto, phó thương hàn, tụ huyết trùng, nhiễm trùng huyết sau sinh Bệnh viêm vú sữa, viêm tử cung, an tồn cho nái ni con, viêm khớp, viêm da, đóng dấu Thuốc hiệu với bệnh phân trắng lợn con, phân nhớt vàng E coli, Clostridium, xoắn khuẩn lỵ Cách dùng: Tiêm bắp thịt da; Một mũi tiêm tác dụng kéo dài 48 Liều lượng: Lợn, bê, nghé: Trâu, bò, ngựa: 1ml/8-10kg TT 1ml/10-12kg TT GLUCO - K - C - NAMIN (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Gluconate canxi : 25.000 mg Vitamin K : 1.000 mg Vitamin C : 4.000 mg Tolfenamic acid : 4.000 mg Methyparaben : 140 mg Tá dược, dung môi đặc biệt vừa đủ : 100 ml Công dụng: Thuốc trợ sức, trợ lực, giảm sốt, hỗ trợ tăng cường sức đề kháng Phục hồi sức vật nuôi bệnh, mang thai, sau sinh, suy nhược Cung cấp lượng, Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn hỗ trợ điều trị bệnh truyền nhiễm hiệu tối ưu Tăng cường sức đề kháng, chống xuất huyết phủ tạng thể Cách dùng: Tiêm bắp thịt, da cho uống thời gian điều trị Sản phẩm đặc biệt hiệu hỗ trợ điều trị bệnh truyền nhiễm kế phát lợn mắc tai xanh, sốt đỏ, nhiễm trùng, bệnh Gumboro, ký sinh trùng đường máu gà… Liều lượng: Gia súc bệnh: Ngày lần với liều: 1ml/7-10 kg TT/ngày Gia cầm bệnh: Ngày lần với liều: 1ml/4-6 kg TT/ngày PHỤ LỤC 11 Kiểm tra vô trùng, an tồn hiệu lực Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh liên cầu khuẩn Kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011 [37] Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn: Cấy Autovaccine ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thiolycolat, môi trường trypticaza đậu tương đĩa môi trường thạch máu, lượng Autovaccine cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với mơi trường kiểm tra Ủ môi trường cấy Autovaccine tủ 37oC, theo dõi từ đến 10 ngày Mẫu Autovaccine xem đạt tiêu chuẩn khơng có vi sinh vật mọc môi trường kiểm tra thời gia theo dõi Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc: Mẫu Autovaccine ria cấy môi trường thạch Sabouraud môi trường thủy phân casein đậu tương Theo dõi 14 ngày nhiệt độ phòng từ 20 oC đến 25 oC Mẫu Autovaccine xem đạt tiêu chuẩn khơng có tạp khuẩn nấm mốc mọc môi trường kiểm tra thời gia theo dõi Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma: Mẫu Autovaccine cấy kiểm tra môi trường canh thang PPLO vơi nồng độ từ 1% đến 2% Autovaccine 100 ml mơi trường thạch đĩa PPLO có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Autovaccine đĩa Theo dõi môi trường lỏng 14 ngày nhiệt độ từ 33 oC đến 37 oC Tại Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn thời điểm ngày, ngày, 10 ngày 14 ngày, lấy canh khuẩn môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa) Ủ tủ ấm 37 oC có 5% khí CO2, theo dõi 28 ngày Mẫu Autovaccine xem đạt khơng có khuẩn lạc Mycoplasma mọc môi trường kiểm tra Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella: Mẫu Autovaccine cấy môi trường kiểm tra, dùng loại môi trường sau: thạch MacConkey, thạch Salmonella-Shigella, thạch Brilliant Green, thạch Desoxycholat xitrat XLD, với nồng độ từ 1% đến 2% dung tích môi trường kiểm tra Ủ môi trường cấy Autovaccine tủ 37 oC, theo dỗi từ 18 h đến 20 h sau cấy chuyển tiếp sang mơi trường nước, dùng môi trường sau: canh thang selenit canh thang tetrathionat Ủ tủ 37 oC, theo dõi từ 48h đến 72h Mẫu Autovaccine xem đạt khơng có vi khuẩn Salmonella mọc môi trường kiểm tra Ở lô autovaccine lấy chai theo phương pháp ngẫu nhiên, lắc cấy 0,2 ml vào ống môi trường nước thịt, nước thịt TYE nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch MacConkey, thạch PPLO, thạch Sabouraud Mỗi loại môi trường cấy kiểm tra ống Các ống môi trường sau cấy bồi dưỡng tủ ấm có bổ sung 5% CO2, riêng thạch nấm để nhiệt độ phòng, ngày kiểm tra kết lần Theo dõi kết hàng ngày, ngày đọc kết lần, sau ngày (riêng môi trường nấm theo dõi 14 ngày) loại vi khuẩn mọc mơi trường autovaccine coi đạt tiêu chuẩn vơ trùng Kiểm tra tiêu an tồn theo QCVN 01:187-2018 [27] TCVN 8685:2018 [38] Mỗi lô Autovaccine sử dụng lợn khoẻ mạnh, khơng có kháng thể S suis sertype 2, 7, Lợn tiêm liều Autovaccine (Autovaccine keo phèn tiêm da, Autovaccine nhũ dầu tiêm bắp) Sau tiêm theo dõi từ 14 đến Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 21 ngày Autovaccine xem đạt tất lợn sống không gây phản ứng cục hay toàn thân cho lợn Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Kiểm tra tiêu hiệu lực theo QCVN 01:187-2018 [27] Tiến hành kiểm tra hiệu lực Autovaccine thử nghiệm phương pháp thay chuột bạch Mỗi lô Autovaccine gây miễn dịch cho 10 chuột bạch khỏe mạnh đường tiêm da với liều 0,2 ml/con tiêm lặp lại mũi sau ngày với liều 0,2 ml/con Lô đối chứng: chuột không tiêm Autovaccine Sau tiêm 21 ngày tiến hành thử thách cường độc với canh khuẩn S suis chủng chế Autovaccine chứa 10 LD50 (LD50: liều gây chết 50% chuột bạch) có 0,2 ml cho tất chuột thí nghiệm chuột đối chứng Theo dõi chuột 10 ngày đánh giá Autovaccine thử nghiệm đạt u cầu hiệu lực lơ chuột thí nghiệm số chuột sống ¾, chuột lơ đối chứng chết 100% Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ... Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh lợn tỉnh Thái Nguyên chế tạo Autovaccine phòng bệnh Mục tiêu đề tài - Xác định số đặc điểm sinh học vi khuẩn S suis gây bệnh. .. HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ... 1.1 Bệnh vi khuẩn Streptococcus suis (S suis) gây lợn người .4 1.1.1 Bệnh vi khuẩn .4 1.1.2 Bệnh vi khuẩn người Streptococcus suis Streptococcus gây suis gây lợn 1.2 Vi khuẩn suis