BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN MUC1 VÀ PSCA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ========== NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN MUC1 VÀ PSCA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY Chuyên ngành : Hóa sinh Y học Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung HÀ NỘI - 2020 LỜI CÁM ƠN Trong suốt trình thực đề tài nhận nhiều giúp đỡ Lãnh đạo quan, đơn vị, Thầy Cô, đồng nghiệp, bệnh nhân, bạn bè gia đình thân u Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới GS TS Tạ Thành Văn PGS TS Đặng Thị Ngọc Dung, người thầy, người hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập, trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy cô, đồng nghiệp, người tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực luận án: - Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại Học - Trường Đại học Y Hà Nội - PGS TS Phạm Thiện Ngọc - Ngun trưởng Bộ mơn Hóa - Trường Đại học Y Hà Nội - PGS TS Trần Huy Thịnh, Phó trưởng Bộ mơn Hóa sinh – Trường Đại học Y Hà Nội - Các em học viên bác sỹ nội trú Ngô Diệu Hoa, Nguyễn Văn Tân, Trần Văn Chức, Đặng Thị Nga, em học viên cao học Đinh Thị Thảo, Nguyễn Thị Phương Thảo em học viên Sau đại học khác giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu - Tập thể cán nhân viên Bộ mơn Hóa sinh Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Y học – Trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ suốt trình nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến bệnh nhân gia đình họ giúp tơi có số liệu luận án Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp học trò thân u giúp đỡ tơi trình học tập, nghiên cứu thực luận án Cuối cùng, xin ghi nhớ công ơn sinh thành, dưỡng dục bố mẹ tôi, bố mẹ chồng ủng hộ, động viên chồng, hai bên tôi, chỗ dựa vững để tơi n tâm học tập hồn thành luận án Hà Nội, tháng 04 năm 2020 Nguyễn Thị Ngọc Lan LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Ngọc Lan, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy GS.TS Tạ Thành Văn Cô PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 06 tháng 04 năm 2020 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Ngọc Lan DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên viết tắt Ý nghĩa ASIR AUC Age – Standardised Incidence Rate Tỷ lệ mắc theo tuổi Area Under Curver Diện tích đường cong bp base pair cs CDC Cặp base nito Cộng Centers for Disease Control and Trung tâm kiểm soát Prevention phòng chống bệnh tật CDH1 Cadehin -1 CI Confidence Interval DNA Deoxyribose Nucleic Acid GWAS Genome – Wide Association Study Nghiên cứu mối liên quan Khoảng tin cậy bệnh tật gen H.pylori Helicobacter pylori HR Hazard Ratio Tỷ suất nguy IARC International Agency for Research Tổ chức nghiên cứu ung thư on Cancer quốc tế MUC1 Mucin – n Số lượng NST Nhiễm Sắc Thể OR Odds Ratio Tỷ suất chênh PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi PGI Pepsinogen I PGII Pepsinogen II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT (tiếp) Chữ viết tắt Tên viết tắt Ý nghĩa PGI/II PSCA Pepsinogen I/II Prostate Stem Cell Antigen Tỷ lệ PepsinogenI/II RFLP Restriction Đa hình chiều dài đoạn giới ROC Fragment Length Polymorphism hạn Receiver Operating Characteristic Đồ thị đường cong mơ hình biến nhị phân RR Relative Ratio Tỷ suất nguy SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình đơn nucleotid TB SD Trung Bình Standard Deviation Độ lệch chuẩn UTDD Ung Thư Dạ Dày UTBMDD Ung Thư Biểu Mô Dạ Dày WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐÊ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương ung thư dày 1.1.1 Dịch tễ học ung thư dày .3 1.1.2 Phân loại ung thư dày 1.1.3 Chẩn đoán ung thư dày 1.1.4 Điều trị tiên lượng ung thư dày 11 1.2 Cơ chế bệnh sinh ung thư dày 12 1.2.1 Các yếu tố nguy ung thư dày .13 1.2.2 Cơ chế phân tử ung thư dày 18 1.3 Đa hình gen MUC1 gen PSCA 23 1.3.1 Cấu trúc chức gen MUC1 23 1.3.2 Cấu trúc chức gen PSCA 26 1.3.3 Đa hình đơn nucleotid gen MUC1 gen PSCA ung thư dày 28 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.4 Các biến số nghiên cứu cách thức thu thập số liệu 33 2.5 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 35 2.5.1 Trang thiết bị dụng cụ .35 2.5.2 Hóa chất .36 2.5.3 Các cặp mồi enzym cắt giới hạn nghiên cứu 36 2.6 Quy trình kỹ thuật phân tích đa hình đơn nucleotid gen MUC1 gen PSCA 38 2.7 Xử lý phân tích số liệu 44 2.8 Xây dựng mơ hình tiên lượng ung thư dày 45 2.9 Vấn đề đạo đức nghiên cứu .46 2.10 Các biện pháp tránh sai số 46 2.11 Sơ đồ nghiên cứu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49 3.1 Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu 49 3.2 Kết phân tích đa hình gen MUC1 gen PSCA 54 3.2.1 Đa hình gen rs4072037 gen MUC1 54 3.2.2 Đa hình gen rs2070803 gen MUC 58 3.2.3 Đa hình gen rs2294008 gen PSCA 62 3.2.4 Đa hình gen rs2976392 gen PSCA 65 3.3 Mối liên quan đa hình đơn yếu tố nguy 68 3.3.1 Mối liên quan đa hình gen rs4072037 yếu tố nguy cơ.68 3.3.2 Mối liên quan đa hình gen rs2070803 yếu tố nguy cơ.70 3.3.3 Mối liên quan đa hình gen rs2294008 yếu tố nguy cơ.72 3.3.4 Mối liên quan đa hình gen rs2976392 yếu tố nguy cơ.74 3.3.5 Sự kết hợp đa hình gen hai gen MUC1 gen PSCA với nguy ung thư dày 75 3.3.6 Mơ hình tiên lượng nguy ung thư dày .79 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 83 4.1 Bàn luận đặc điểm đa hình đơn gen MUC1 gen PSCA 84 4.2 Bàn luận mối liên quan yếu tố nguy biến thể đa hình gen MUC1 gen PSCA .96 KẾT LUẬN 123 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 124 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi phản ứng PCR 37 Bảng 2.2 Các enzym cắt giới hạn vị trí cắt chúng 38 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 39 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR .39 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi nhóm nghiên cứu 49 Bảng 3.2 Đặc điểm phân bố theo nhóm tuổi nhóm nghiên cứu 49 Bảng 3.3 Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu 50 Bảng 3.4 Đặc điểm tiền sử hút thuốc uống rượu nhóm nghiên cứu 50 Bảng 3.5 Đặc điểm tiền sử bệnh lý dày cá nhân, tiền sử UTDD gia đình tiền sử nhiễm H.pylori 51 Bảng 3.6 Đặc điểm nồng độ pepsinogen nhóm nghiên cứu .51 Bảng 3.7 Nồng độ PGI tỷ lệ PGI/II so với ngưỡng chẩn đoán 52 Bảng 3.8 Đặc điểm mô bệnh học bệnh nhân ung thư dày 52 Bảng 3.9 Phân tích ảnh hưởng yếu tố nguy nhóm nghiên cứu mơ hình hồi quy logistic 53 Bảng 3.10 Phân bố kiểu gen rs4072037 56 Bảng 3.11 Kiểu gen rs4072037 nguy ung thư dày .57 Bảng 3.12 Phân bố kiểu gen rs2070803 .60 Bảng 3.13 Các kiểu gen rs2070803 nguy mắc ung thư dày 61 Bảng 3.14 Phân bố kiểu gen rs2294008 .64 Bảng 3.15 Các kiểu gen rs2294008 nguy ung thư dày 64 Bảng 3.16 Phân bố kiểu gen rs2976392 .67 Bảng 3.17 Kiểu gen rs2976392 nguy ung thư dày .67 Bảng 3.18 Phân tích nguy UTDD kiểu gen AA so với AG+GG nhóm bệnh so với nhóm chứng 68 Bảng 3.19 Phân tích nguy UTDD kiểu gen GG so với AG+AA nhóm bệnh so với nhóm chứng 70 Bảng 3.20 Phân tích nguy UTDD kiểu gen TT so với CT+CC nhóm bệnh so với nhóm chứng 72 Bảng 3.21 Phân tích nguy UTDD kiểu gen AA so với AG+GG nhóm bệnh so với nhóm chứng 74 Bảng 3.22 Tổng hợp mơ hình hồi quy logistic đa biến 79 Bảng 4.1 Tổng hợp kết nghiên cứu từ Tokyo, Aichi Korea kiểu gen nguy GG rs2070803 89 C C1 TIỀN SỬ BỆNH TẬT GIA ĐINH Gia đình anh/chị có mắc UTDD chưa? Rồi C2 Có người mắc? người C3 C4 C5 C6 → D1 Chưa 1 2 người Trên người Là ai: …………………………………………… Tuổi mắc bệnh thành viên gia đình? Trên 40 tuổi Dưới 40 tuổi Thành viên mắc bệnh chẩn đoán điều trị cách bn lâu? Gia đình anh/chị có mắc bệnh UT khơng phải (#)UTDD ? Rồi Chưa Liệt kê: (quan hệ gia đình/ bệnh lý ung thư/tuổi mắc/tình trạng tại) D SỬ DỤNG RƯỢU D1 Trong thời gian gần đây, anh/ chị uống rượu lần? Không →E1 Hàng tháng Hàng tuần 2-3 lần tuần >= lần tuần Thông thường lần uống rượu, anh/ chị thường uống chén/ ly? …………… chén/ ly Bao lâu lại có lần anh/ chị uống từ chén/ ly rượu trở lên? Không Vài tháng lần Hàng tháng Hàng tuần Hàng ngày SỬ DỤNG THUỐC LÁ D2 D3 E E1 …………… Lần anh/chị hút thuốc vào năm tuổi? …… tuổi Chưa hút 99 → F1 E2 Anh/chị hút thuốc thường xuyên hàng ngày năm? Chưa hút thuốc thường xuyên Không nhớ …………… …… năm 98 99 E3 Trước phát bệnh, anh/chị hút điếu thuốc ngày? Sau phát bệnh, anh/chị hút điếu thuốc ngày? …………… …điếu ……………… điếu E4 Từ trước đến giờ, anh/chị hút tổng cộng 100 điếu thuốc nhiều không?(100 điếu thuốc = bao thuốc) Có Khơng → F1 E5 Trong vòng 30 ngày trở lại đây, anh/chị có hút thuốc khơng? Có Khơng E6 E7 E8 E9 E10 E11 Trung bình ngày tại, anh/chị hút điếu thuốc? (1 bao thuốc = 20 điếu thuốc) Ít 10 điếu thuốc/ngày 11-20 điếu thuốc/ngày 21-30 điếu thuốc/ngày Trên 31 điếu thuốc/ngày Không nhớ Trung bình tháng, anh/chị chi hết tiền cho thuốc lá? Khoảng sau thức dậy buổi sáng, anh/chị hút điếu thuốc ngày? Trong vòng phút 6-30 phút 31-60 phút Sau 60 phút Khơng biết Anh/chị có thấy khó chịu hút thuốc nơi cấm hút thuốc (bệnh viện, trường học, xe bt….) khơng? Có Khơng Anh chị thấy khó chịu khơng hút thuốc vào thời điểm ngày? Điếu thuốc vào buổi sáng Các thời điểm khác Sau bữa ăn Khơng thấy khó chịu Lúc thức dậy buổi sáng, anh/chị có hút thuốc nhiều so với thời điểm khác ngày khơng? Có Khơng 99 ……………… nghìn đồng 99 2 E12 Khi bị ốm nặng phải nằm giường ngày, anh/chị có hút thuốc khơng? Có Khơng E13 E14 Hiện tại, dự định anh/chị việc cai thuốc nào? Khơng có ý định cai thuốc Nghĩ nên cai thuốc chưa sẵn sàng Dự định sử dụng biện pháp để cai thuốc Đang sử dụng biện pháp để cai thuốc Khác (Ghi rõ:……………………………………………………… ) Trong vòng 12 tháng trở lại đây, lần anh/chị thử cai thuốc kiêng hút thuốcít 24 giờ? E15 Anh/ chị dự định cai thuốc lá? E16 Anh/ chị dự định đangsử dụng biện pháp để cai thuốc lá? (nhiều lựa chọn) Hỗ trợ từ nhân viên y tế Hỗ trợ từ người thân Hỗ trợ từ bạn bè Dùng dược phẩm thay nicotin Dùng thuốc nam thuốc bắc Châm cứu Nhắc nhở điện thoại di động Tự cai Khác (Ghi rõ:……………………………………………………… ) Anh/ chị thấy khó khăn lớn cho việc cai thuốc gì? 1.…………………………………………………………………………………… 2…………………………………………………………………………………… 3…………………………………………………………………………………… ……………… ………….lần ……………… Đang cai …tháng Không cai 98 → 99 E17 K (Liệt kê tối đa lý do) TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG Triệu chứng lâm sàng bệnh nhân? Đau thượng vị Gầy sút cân Buồn nôn/nôn Chán ăn Nôn máu và/hoặc ngồi phân đen Khó nuốt Thiếu máu Vàng da, vàng mắt Gan lớn Bụng chướng Ấn thượng vị đau Hạch nách Hạch thượng đòn F1 10 11 12 13 L HÌNH ẢNH NỘI SOI DẠ DÀY: L1 Hình ảnh nội soi bệnh nhân? L2 Vị trí tổn thương? L3 M M1 Ngày nội soi: ………………………………… Bình thường 1→M1 Có tổn thương Hang vị Tiền mơn vị Hang mơn vị Tâm vị Phình vị Thân vị Bờ cong nhỏ Bờ cong lớn Khác ……………… ……… 3cm Khác ……………… ……… Kích thước tổn thương? KẾT QUẢ MƠ BỆNH HỌC Mã tiêu bản……………………………………………………………… Bác sĩ đọc……………………………………………………………… Nơi đọc………………………………………………………………… Phân loại theo Lauren? Thể ruột Thể lan tỏa M2 Phân loại theo WHO? Ung thư biểu mô tuyến thể nhú Ung thư biểu mô tuyến thể ống nhỏ Ung thư biểu mô tuyến thể nhầy Ung thư biểu mô tế bào nhẫn Ung thư biểu mô tuyến vảy Ung thư biểu mô tế bào vảy Ung thư biểu mô thể tế bào nhỏ Ung thư biểu mô thể không biệt hóa Các ung thư biểu mơ khác M3 …………… Mức độ biệt hóa? Cao Vừa Kém M4 Kết luận: K dày thể ……………… Có tính chất gia đình Khơng có tính chất gia đình Giai đoạn: Kết Cận lâm sàng: R Kết nhóm máu A B AB O R2 Kết nồng độ pepsinogen I Nồng độ:……… ng/mL R3 Kết nồng độ pepsinogen II Nồng độ:……… ng/mL R4 Kết định lượng IgG H.pylori Nồng độ:……… ng/mL R5 Kết định lượng IGM H.pylori Nồng độ:……… ng/mL R6 Kết định lượng VacA H.pylori R7 Kết định lượng CacA H.pylori R8 Kết H.pylori test urease R9 Kết H.pylori qua nhuộm HE R10 Kết CA72-4 R11 Kết CA 19-9 R12 Kết CEA R13 P Kết xét nghiệm đa hình gen P Gen P1 SNP rs4072037 Kiểu gen GG GA AA AA AG GG CC CT TT GG GA AA MUC1 P2 rs2070803 P3 rs2294008 PSCA P4 rs2976392 PHỤ LỤC 2: Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dày Lauren (1965) Thể ruột WHO (2010) Ung thư biểu mô tuyến nhú Ung thư biểu mô tuyến ống Ung thư biểu mô tuyến nhầy Thể lan tỏa Ung thư biểu mô tế bào nhẫn Các ung ung thư biểu mơ kết dính khác Ung thư biểu mơ hỗn hợp Ung thư biểu mô tuyến vảy Ung thư biểu mô tế bào vảy Thể hỗn hợp Ung thư biểu mô tuyến dạng tế bào gan Ung thư biểu mô với chất lympho Ung thư biểu mô thai Sarcom ung thư biểu mô PHỤ LỤC 3: QUY ĐỊNH LY RƯỢU CHUẨN WHO đưa đơn vị uống chuẩn chứa 10 gam cồn Một đơn vị uống chuẩn tương đương với chén rượu mạnh (40 độ, 30 ml); ly rượu vang (13,5 độ, 100 ml); vại bia (330 ml); 2/3 chai lon bia (330 ml) Các cốc/ly rượu bia có kích cỡ khác nhau, chứa khoảng 10g cồn PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ PCR-RFLP XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID Hình ảnh PCR-RFLP xác định kiểu gen rs 4072037 Hình ảnh PCR-RFLP xác định kiểu gen rs 2070803 Hình ảnh PCR-RFLP xác định kiểu gen rs 2294008 Hình ảnh PCR-RFLP xác định kiểu gen rs 2976392 PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN Hình ảnh giải trình tự gen mẫu B20 – rs4072037: Kiểu gen GG Hình ảnh giải trình tự gen mẫu B25 – rs4072037: Kiểu gen AG Hình ảnh giải trình tự gen mẫu B17 – rs2070803: Kiểu gen GG Hình ảnh giải trình tự gen mẫu B23 – rs2070803: Kiểu gen AG TT Hình ảnh giải trình tự gen mẫu B109 – rs2294008: Kiểu gen TT Hình ảnh giải trình tự gen mẫu B119 – rs2294008: Kiểu gen TC Hình ảnh giải trình tự gen mẫu C101 – rs2976392: Kiểu gen CC (mồi ngược) Hình ảnh giải trình tự gen mẫu C100 – rs2976392: Kiểu gen CT (mồi ngược) ... Quốc, Trung Quốc Vì lý trên, đề tài Nghiên cứu đa hình thái đơn gen MUC1 PSCA bệnh nhân ung thư dày tiến hành nhằm mục tiêu sau: 1) Xác định số đa hình đơn gen MUC1 PSCA bệnh nhân ung thư dày 2)... tử ung thư dày 18 1.3 Đa hình gen MUC1 gen PSCA 23 1.3.1 Cấu trúc chức gen MUC1 23 1.3.2 Cấu trúc chức gen PSCA 26 1.3.3 Đa hình đơn nucleotid gen MUC1 gen PSCA ung thư dày. .. hợp đa hình gen hai gen MUC1 gen PSCA với nguy ung thư dày 75 3.3.6 Mơ hình tiên lượng nguy ung thư dày .79 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 83 4.1 Bàn luận đặc điểm đa hình đơn gen MUC1 gen PSCA