BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH TUYỀN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH TUYỀN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài Luận văn thạc sĩ dược học, thầy cơ, gia đình, bạn bè đồng nghiệp người động viên, hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài cách hoàn thiện Lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người tận tình hướng dẫn ln tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt đề tài Tơi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Xn Trường anh chị cán Trung tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình - Bộ Công an hỗ trợ cho thiết bị LC-MS/MS để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths Trần Thúy Hạnh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – Trường Đại học Y Dược Huế giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu, thực luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt thầy Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất truyền đạt cho kiến thức cần thiết, tảng để tơi xây dựng, thực hoàn thành đề tài nghiên cứu Đồng thời xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Traphaco giúp đỡ trình tạo mẫu nghiên cứu, xin cảm ơn Ban lãnh đạo anh chị cán Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia tạo điều kiện trang thiết bị, máy móc để hỗ trợ tơi suốt trình thực đề tài Lời cuối tơi xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp ln khích lệ, tạo động lực cho tơi q trình học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, tháng năm 2019 Học viên Phạm Thị Thanh Tuyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 1.1.2 Nhóm thuốc glucocorticoid 1.1.3 Dược liệu chế phẩm đông dược điều trị hỗ trợ điều trị dị ứng 1.2 Một số nghiên cứu phát thuốc chống dị ứng trộn trái phép chế phẩm đông dƣợc 10 1.2.1 Trên giới 10 1.2.2 Tại Việt Nam 12 1.3 Tổng quan sắc ký lỏng khối phổ 14 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tƣợng nghiên cứu 18 2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn 18 2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 18 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Xử lý mẫu 20 2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích LC-MS/MS 20 2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích xây dựng 21 2.2.4 Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thực 21 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 22 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1 Xây dựng phƣơng pháp phân tích 23 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 23 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện khối phổ 23 3.1.3 Khảo sát lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 29 3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 35 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 35 3.2.2 Độ đặc hiệu 36 3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 38 3.2.4 Độ độ xác 40 3.2.5 Giới hạn phát giới hạn định lượng 43 3.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực 45 Chƣơng BÀN LUẬN 50 4.1 Về mẫu 50 4.2 Về phƣơng pháp phân tích 50 4.3 Về xử lý mẫu 52 4.4 Về thẩm định phƣơng pháp phân tích 52 4.5 Ứng dụng 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AOAC AR BET Chuẩn DĐVN Chuẩn PTN CLO CYP DEX H HPLC HPTLC ICH LC – MS/MS LOD LOQ LOR m/z PA RSD S/N TLC TOF UHPLC Tiếng anh tên khoa học Association of Official Analytical Chemists Analytical Reagent Betamethason Tiếng việt Hiệp hội nhà hóa phân tích thống Thuốc thử phân tích Chuẩn Dược điển Việt Nam Chuẩn phòng thí nghiệm Chlorpheniramin maleat Cyproheptadin hydroclorid Dexamethason acetat Hiệu suất High Performance Liquid Chromatography High Performance Thin Layer Chromatography International Conference on Harmonisation Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry Limit of Detection Limit of Quantitation Loratadin Pure Analysis Relative Standard Deviation Signal/Noise Thin Layer Chromatography Time Of Flight Ultra High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Hội nghị hòa hợp quốc tế Sắc ký lỏng hai lần khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Khối lượng/ điện tích Tinh khiết phân tích Độ lệch chuẩn tương đối Tín hiệu/Nhiễu Sắc ký lớp mỏng Thời gian bay Sắc ký lỏng hiệu suất siêu cao DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng Bảng 1.2 Một số chế phẩm đông dược điều trị hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng lưu hành thị trường Bảng 1.3 Một số nghiên cứu phân tích thuốc chống dị ứng trộn trái phép chế phẩm đông dược 11 Bảng 2.4 Các nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 18 Bảng 3.5 Các thông số máy khối phổ 24 Bảng 3.6 Điều kiện khối phổ chất phân tích 24 Bảng 3.7 Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient 26 Bảng 3.8 Kết khảo sát dung môi chiết (n=3) 31 Bảng 3.9 Kết khảo sát thời gian siêu âm (n = 3) 33 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS (n=6) 35 Bảng 3.11 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp 38 Bảng 3.12 Sự phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic chất phân tích 39 Bảng 3.13 Kết độ độ xác ngày mẫu (n=7) 40 Bảng 3.14 Kết độ độ xác khác ngày mẫu (n=7) 41 Bảng 3.15 Kết độ độ xác mẫu (n=14) 42 Bảng 3.16 Kết LOD LOQ mẫu 44 Bảng 3.17 Kết định tính mẫu thực 48 Bảng 3.18 Kết đánh giá mẫu thực dương tính 49 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 15 Hình 1.2 Sơ đồ tạo thành ion dương ESI 16 Hình 1.3 Bộ phân tích tứ cực 16 Hình 1.4 Mơ hình phân tích tứ cực chập ba 16 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký 25 Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động 27 Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động 28 Hình 3.8 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc loại dung môi (nền N3) 32 Hình 3.9 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc thời gian siêu âm (nền N3) 34 Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu 34 Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu N1 37 Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu N2 37 Hình 3.13 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu N3 37 Hình 3.14 Sắc ký đồ chất phân tích nồng độ LOD N3 44 Hình 3.15 Sắc ký đồ phổ định danh cyproheptadin hydroclorid mẫu H05 46 Hình 3.16 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H05 để định lượng 46 Hình 3.17 Sắc ký đồ phổ định danh dexamethason acetat mẫu B13 47 Hình 3.18 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B13 47 Hình 3.19 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B13 để định lượng 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Dị ứng ngày coi bệnh sống đại, giới có tỉ người mắc bệnh Việt Nam tỉ lệ mắc khoảng 20% dân số nước [36], [39] Các nhóm thuốc hóa dược để điều trị dị ứng bao gồm nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 glucocorticoid Tuy nhiên hai nhóm gây tác dụng phụ nghiêm trọng như: buồn ngủ, khô mắt, dị ứng, lệ thuộc thuốc; loãng xương, giữ nước gây phù, tăng huyết áp, viêm loét dày, đái tháo đường, rối loạn tâm thần, đục thủy tinh thể, suy thượng thận [5] Đặc biệt trộn lẫn vào chế phẩm đông dược dùng thời gian dài làm trầm trọng tác dụng không mong muốn Gần chế phẩm đông dược ngày sử dụng rộng rãi để phòng bệnh, cải thiện sức khỏe điều trị bệnh mãn tính Nhiều chế phẩm đơng dược đưa vào thị trường để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe người dân Tuy nhiên, để tăng cường ngụy tạo tác dụng chế phẩm mà số nhà sản xuất pha trộn với thuốc hóa dược khơng khai báo [17] Các thuốc hóa dược tìm thấy điển hình thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid…[16], [24], [26], [32] Trong đó, có số cơng bố thuốc chống dị ứng bao gồm nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 chlorpheniramin, cetirizin, diphenhydramin, loratadin…[24], [27], [34] glucocorticoid dexamethason, betamethason [14], [23] Với tình hình trên, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ban hành số hướng dẫn nhằm giám sát an toàn thuốc thảo dược tăng cường quan quản lý thuốc quốc gia thành viên khác Ví dụ, năm 2007, Cơ quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm (FDA) ban hành quy định thực hành sản xuất tốt (GMP) cho thực phẩm chức ghi nhãn thích hợp cho sản phẩm thảo dược [22] Các nước thành viên EU (Liên minh Châu Âu) có quy tắc để kiểm sốt sản phẩm thảo dược Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu phát thuốc hóa dược trộn lẫn đơng dược, chủ yếu thuộc nhóm giảm đau chống viêm không steroid, hạ huyết áp, hạ đường máu, glucocorticoid [8], [9], [10], [12], chưa có nghiên cứu việc trộn lẫn thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 chế phẩm đông dược công bố Các phương pháp hay sử dụng phát thuốc hóa dược trộn trái phép chế phẩm đơng dược bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) Tuy nhiên phương pháp hạn chế cho kết âm tính giả dương tính giả Hiện nay, sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ kỹ thuật mà gắn kết tiềm phân tích lý học sắc ký lỏng (LC) với khả phân tích khối (m/z) phận khối phổ (MS) Thiết bị LC-MS kỹ thuật ứng dụng ngày nhiều có độ nhạy độ đặc hiệu cao, phù hợp để phân tích mẫu phức tạp chế phẩm đơng dược Để góp phần vào công tác kiểm tra phát chất cấm trộn lẫn chế phẩm đông dược, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phƣơng pháp xác định số thuốc chống dị ứng trộn trái phép chế phẩm đông dƣợc LC-MS/MS” Với mục tiêu: Xây dựng phương pháp xác định đồng thời betamethason, dexamethason acetat, chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid, loratadin trộn trái phép chế phẩm đông dược dạng rắn LC-MS/MS Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định dược chất trộn trái phép số chế phẩm đông dược lưu hành thị trường Hình PL6.5 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H21 để định lượng Hình PL6.6 Mẫu dương tính H21 6.3 Mẫu B11 Hình PL6.7 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B11 Hình PL6.8 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B11 để định lượng Hình PL6.9 Mẫu dương tính B11 6.4 Mẫu H12 Hình PL6.10 Sắc ký đồ phổ định danh dexamethason acetat mẫu H12 Hình PL6.11 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu H12 Hình PL6.12 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H12 để định lượng Hình PL6.13 Mẫu dương tính H12 6.5 Mẫu B13 Hình PL3.14 Sắc ký đồ phổ định danh dexamethason acetat mẫu B13 Hình PL3.15 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B13 Hình PL3.16 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B13 để định lượng Hình PL6.17 Mẫu dương tính B13 6.6 Mẫu B23 Hình PL6.18 Sắc ký đồ phổ định danh dexamethason acetat mẫu B23 Hình PL6.19 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B23 Hình PL6.20 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B23 để định lượng Hình PL6.21 Mẫu dương tính B23 6.7 Mẫu B24 Hình PL6.22 Sắc ký đồ phổ định danh dexamethason acetat mẫu B24 Hình PL6.23 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B24 Hình PL6.24 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B24 để định lượng Hình PL6.25 Mẫu dương tính B24 ... TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH TUYỀN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN... trộn lẫn chế phẩm đông dược, tiến hành đề tài nghiên cứu: Xây dựng phƣơng pháp xác định số thuốc chống dị ứng trộn trái phép chế phẩm đông dƣợc LC- MS/MS” Với mục tiêu: Xây dựng phương pháp xác. .. phát thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 trộn trái phép chế phẩm đông dược hạn chế Vì vậy, nghiên cứu phát triển phương pháp xác định thuốc hóa dược chống dị ứng trộn trái