BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THANH HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ Δ9-TETRAHYDROCANNABINOL TỪ CÂY CẦN SA LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THANH HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ Δ9-TETRAHYDROCANNABINOL TỪ CÂY CẦN SA LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:1 TS Trần Nguyên Hà PGS.TS Nguyễn Xuân Trƣờng HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Nguyễn Xuân Trƣờng – Giám đốc Trung tâm giám định ma túy, Viện Khoa học hình TS.Trần Nguyên Hà – Trƣởng Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc Độc chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Kiểm nghiệm Thuốc Độc chất- Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp tơi áp dụng vào thực nghiệm để hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Đức Trọng anh chị Trung tâm Giám định ma túy- Viện Khoa học hình hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi phối hợp giúp trình thực đề tài Những kinh nghiệm kỹ học hỏi đƣợc góp phần giúp tơi thực nghiệm xác thực tế Cuối tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ngƣời thân ln bên động viên, cổ vũ giúp tơi hồn thành đƣợc khóa học Hà Nội, ngày 06 tháng 04 năm 2019 Dƣợc sĩ Phạm Thanh Hiền MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Tên khoa học đặc điểm thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học cần sa 1.1.3 Sử dụng cần sa 1.2 Tổng quan phƣơng pháp chiết xuất, phân lập tinh chế 1.2.1 Các phƣơng pháp chiết xuất, phân lập tinh chế 1.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất, phân lập THC 10 1.2.3 Các nghiên cứu tinh chế THC 15 1.3 Phân tích định tính, định lƣợng cannabinoids cần sa 16 1.4 Một số phƣơng pháp hóa lý dùng đề tài 18 1.4.1 Sắc kí lớp mỏng 18 1.4.2 Sắc kí cột 19 1.4.3 Sắc kí lỏng khối phổ 19 1.4.4 Sắc kí khí 20 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu 22 2.2 Phƣơng tiện, dụng cụ 22 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 22 2.2.2 Chất chuẩn dung mơi hóa chất 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.3.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế 23 2.3.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng THC tinh chế đƣợc 23 2.3.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lƣợng THC tinh chế LC-MS/MS 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phƣơng pháp chiết xuất THC từ nguyên liệu cần sa 23 2.4.2 Phân lập, tinh chế THC 24 2.4.3 Định tính, xác định cấu trúc THC tinh chế đƣợc 26 2.4.4 Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng THC tinh chế LC-MS/MS 26 2.4.5 Xử lí kết 27 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng THC LC-MS/MS 29 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 29 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí 31 3.1.3 Kết luận điều kiện sắc kí 34 3.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất 34 3.2.1 Khảo sát nhiệt độ sấy 34 3.2.2 Khảo sát thời gian sấy 38 3.2.3 Khảo sát dung môi chiết 39 3.2.4 Kết luận điều kiện chiết xuất 40 3.3 Phân lập THC từ dịch chiết cần sa 41 3.3.1 Khảo sát lựa chọn hệ dung mơi sắc kí mỏng 41 3.3.2 Phân lập CBD khỏi hỗn hợp THC, CBN 43 3.3.3 Phân lập THC khỏi hỗn hợp THC, CBN 45 3.3.4 Tinh chế THC sắc kí lỏng điều chế (PHPLC) 47 3.4 Xác định cấu trúc THC tinh chế NMR, MS, IR 49 3.4.1 Kết phổ NMR 49 3.4.2 Kết phổ IR 52 3.4.3 Kết phổ MS 53 3.5 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng THC mẫu tinh chế LC-MS/MS.53 3.5.1 Chuẩn bị mẫu 53 3.5.2 Độ thích hợp hệ thống 54 3.5.3 Độ đặc hiệu 54 3.5.4 Khoảng tuyến tính 56 3.5.5 Độ chụm 58 3.5.6 Giới hạn định lƣợng 60 3.6 Xác định tạp liên quan mẫu THC tinh chế 61 Chƣơng BÀN LUẬN 66 4.1 Về qui trình chiết xuất, phân lập tinh chế THC từ dƣợc liệu 66 4.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế đƣợc 67 4.3 Về định tính, định lƣợng THC tinh chế đƣợc LC-MS/MS 67 4.4 Về xây dựng phƣơng pháp xác định tạp liên quan LC-MS/MS 68 4.5 Ý nghĩa thực tiễn đề tài 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Δ8- Tetrahydrocannabinol Δ -THC AOAC Tiếng Việt/Tên khoa học Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội phân tích hóa học CBC Cannabichromene CBCA Acid cannabichromenic CBD Cannabidiol CBDA Acid cannabidiolic CBG Cannabigerol CBGA Acid cannabigerolic CBN Cannabiniol CBNA Acid cannabinolic DAD Diode Array Detector Đầu dò diod mảng GC Gas chromatography Sắc kí khí HPLC High-performance liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao IR Infrared Spectroscopy Quang phổ hồng ngoại LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lƣợng MS Mass spectrometry Khối phổ LLE TB Trung bình THC Δ -Tetrahydrocannabinol THCA Acid tetrahydrocannabinolic A THCB Acid tetrahydrocannabinolic B USP United States Pharmacopoeia Dƣợc điển Mỹ PHPLC Preparative High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng điều chế PA Pure Analysis Tinh khiết phân tích S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu nhiễu SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các thành phần Cannabinoids có ý nghĩa khoa học hình Bảng 1.2 Điều kiện phân lập sắc kí cột 12 Bảng 1.3 Điều kiện decarboxyl hóa 14 Bảng 1.4 Điều kiện tinh chế sắc kí lỏng điều chế .16 Bảng 1.5 Một số điều kiện chạy LC/MS .17 Bảng 1.6 Một số hệ dung môi chạy sắc kí lớp mỏng 18 Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ chất phân tích 29 Bảng 3.2 Điều kiện khảo sát pha động rửa giải THC 31 Bảng 3.3 Kết hàm lƣợng THC khảo sát nhiệt độ sấy .35 Bảng 3.4 Kết hàm lƣợng THC khảo sát thời gian sấy 38 Bảng 3.5 Kết hàm lƣợng THC khảo sát dung môi chiết 39 Bảng 3.6 Kết phân lập CBD giai đoạn .44 Bảng 3.7 Kết phân lập THC giai đoạn .46 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ THC tinh chế Δ9-tetrahydrocannabinol 50 Bảng 3.9 Kết sắc ký thẩm định độ thích hợp hệ thống 54 Bảng 3.10 Kết sắc ký thẩm định khoảng tuyến tính 56 Bảng 3.11 Kết tính độ chệch điểm 57 Bảng 3.12 Kết hàm lƣợng mẫu thử thẩm định độ lặp lại 58 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ thu hồi 60 Bảng 3.14 Điều kiện khối phổ chất CBD, CBN 61 Bảng 3.15 Các tạp liên quan dung dịch thử 64 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1Mối quan hệ thành phần cần sa Hình 1.2 Hệ thống máy UPLC-MS/MS Brucker 20 Hình 3.1 Phổ khối MS/MS với mảnh mẹ 315.2 30 Hình 3.2 Phổ khối MS/MS với mảnh ion định lƣợng THC 30 Hình 3.3 Phổ khối MS/MS với mảnh ion định tính THC .31 Hình 3.4 Chƣơng trình pha động 33 Hình 3.5 Chƣơng trình 33 Hình 3.6 Chƣơng trình pha động 33 Hình 3.7 Chƣơng trình pha động 33 Hình 3.8 Chƣơng trình pha động 33 Hình 3.9 Sắc kí đồ THCA mẫu (tR=5,4) 36 Hình 3.10 Sắc kí đồ CBN nhiệt độ sấy .37 Hình 3.11 Sắc ký đồ Thành phần dịch chiết n-hexan 40 Hình 3.12 Biểu đồ phân lập CBD giai đoạn .45 Hình 3.13 Biểu đồ phân lập THC giai đoạn 46 Hình 3.14 Thành phần dịch phân lập cuối .47 Hình 3.15 Sắc kí đồ tinh chế 48 Hình 3.16 Quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế THC từ cần sa 49 Hình 3.17 Phổ IR chất chuẩn THC 52 Hình 3.18 Phổ IR mẫu tinh chế 52 Hình 3.19 Sắc ký đồ LC-MS mẫu tinh chế bắn phá mức lƣợng 10eV 53 Hình 3.20 Sắc ký đồ LC-MS mẫu chuẩn bắn phá mức lƣợng 10eV 53 Hình 3.21 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu 55 Hình 3.22 Đƣờng chuẩn phƣơng trình hồi qui khoảng tuyến tính 57 Hình 3.23 Sắc kí đồ thẩm định giới hạn định lƣợng .61 Hình 3.24 Sắc kí đồ CBN dung dịch thử 62 Hình 3.25 Sắc kí đồ CBN dung dịch đối chiếu 62 Hình 3.26 Sắc kí đồ CBD dung dịch thử .63 Hình 3.27 Sắc kí đồ tạp liên quan dung dịch thử 65 PHỤ LỤC THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THANH HIỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ Δ9 -TETRAHYDROCANNABINOL TỪ CÂY CẦN SA LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LUẬN VĂN THẠC... đòi hỏi có chất chuẩn phục vụ cho công tác giám định nên tiến hành đề tài: Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế Δ9 -tetrahydrocannabinol từ cần sa làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn với... chiết xuất, phân lập tinh chế 1.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất, phân lập THC 10 1.2.3 Các nghiên cứu tinh chế THC 15 1.3 Phân tích định tính, định lƣợng cannabinoids cần sa