BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ KHÁNH HUYỀN XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC KỶ CÚC ĐỊA HỒNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ KHÁNH HUYỀN Mã sinh viên: 1401281 XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC KỶ CÚC ĐỊA HOÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành khóa luận, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Bùi Hồng Cường - người thầy ln nhiệt tình dạy dỗ, định hướng, tạo điều kiện tốt trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn chị Bùi Thị Duyên, học viên cao học khóa 22, Trường Đại học Dược Hà Nội chia sẻ, giúp đỡ hướng dẫn thời gian nghiên cứu thực khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn DS Đỗ Trung Hiếu Công ty cổ phần thương mại dược phẩm Quốc tế WINSACOM, DS Trần Văn Cương Công ty cổ phần dược phẩm VCP cung cấp mẫu cốm thuốc, chất chuẩn hỗ trợ kinh phí giúp chúng tơi thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô giáo, chị kỹ thuật viên, cán công tác Bộ môn Dược học cổ truyền giúp đỡ tơi nhiều q trình thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phịng đào tạo Đại học tồn thể Thầy Cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội ln tận tình dạy dỗ bảo suốt năm học qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln ủng hộ, động viên khích lệ tơi suốt trình học tập Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân hạn chế, nên khóa luận có điểm thiếu xót Tơi mong nhận góp ý thầy cô, bạn bè để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2019 Sinh viên Đặng Thị Khánh Huyền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng 1.1.1 Xuất xứ 1.1.2 Thành phần 1.1.3 Công năng, chủ trị phương thuốc 1.1.4 Giải thích phương thuốc 1.1.5 Định tính, định lượng 1.2 Thông tin vị thuốc 1.2.1 Thục địa (Radix Rehmanniae glutinosae praeparata) 1.2.2 Hoài sơn (Rhizoma Dioscoreae persimilis) 1.2.3 Sơn thù (Fructus Corni officinalis) 1.2.4 Mẫu đơn bì (Cortex Paeoniae suffruticosae) 1.2.5 Bạch linh (Poria) 1.2.6 Trạch tả (Rhizoma Alisma plantago) 1.2.7 Câu kỷ tử (Fructus Lycii) 10 1.2.8 Cúc hoa vàng (Flos Chrysanthemi indici) 11 1.3 Các yêu cầu chung thuốc cốm 12 1.4 Tổng quan SKLM hiệu cao sắc ký lỏng hiệu cao 13 1.4.1 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) 13 1.4.2 Sắc ký lỏng hiệu cao 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1 Cốm 14 2.1.2 Dược liệu chuẩn 14 2.1.3 Thiết bị, máy móc 14 2.1.4 Hóa chất, chất chuẩn 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Nghiên cứu định tính số thành phần hóa học cốm thuốc vị thuốc 15 2.2.2 Định lượng loganin cốm thuốc HPLC 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Định tính số thành phần hóa học cốm thuốc vị thuốc 15 2.3.2 Định lượng loganin cốm thuốc HPLC 16 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 17 3.1 Định tính số thành phần hóa học cốm thuốc vị thuốc 17 3.1.1 Định tính số nhóm chất mẫu nghiên cứu phản ứng hóa học 17 3.1.2 Định tính so sánh cốm thuốc, dược liệu chuẩn chất chuẩn sắc ký lớp mỏng 19 3.2 Xác định hàm ẩm cốm thuốc 34 3.3 Định lượng loganin cốm thuốc HPLC 34 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn 34 3.3.2 Định lượng loganin cốm thuốc 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37 4.1 Định tính số thành phần hóa học cốm thuốc vị thuốc 37 4.2 Định lượng loganin cốm thuốc HPLC 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile BL Bạch linh BT Bài thuốc CH Cúc hoa vàng CKT Câu kỷ tử DB Mẫu đơn bì DC Dịch chiết DĐVN Dược điển Việt Nam DĐTQ Dược điển Trung Quốc EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HS Hoài sơn HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao MeOH Methanol MNC Mẫu nghiên cứu Pư Phản ứng SKLM Sắc ký lớp mỏng ST Sơn thù TD Thục địa TLC Sắc ký lớp mỏng TNHH Trách nhiệm hữu hạn TrT Trạch tả TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp định tính sắc ký lớp mỏng Bảng 2.1 Cơng thức cốm thuốc Kỷ cúc địa hồng 14 Bảng 3.1 Kết định tính thành phần hóa học cốm thuốc cốm thành phần 17 Bảng 3.2 Kết SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc TD chuẩn bước sóng 254 nm 21 Bảng 3.3 Kết SKLM định tính dịch chiết cloroform từ cốm thuốc HS chuẩn bước sóng 254 nm 22 Bảng 3.4 Kết SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc DB chuẩn bước sóng 254 nm 24 Bảng 3.5 Kết SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc TrT chuẩn bước sóng 254 nm 26 Bảng 3.6 Kết SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc CKT chuẩn bước sóng 254 nm 27 Bảng 3.7 Kết SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc BL chuẩn bước sóng 254 nm 29 Bảng 3.8 Kết SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc CH chuẩn bước sóng 254 nm 31 Bảng 3.9 Kết SKLM định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc, ST chuẩn loganin ánh sáng trắng sau phun thuốc thử 33 Bảng 3.10 Kết xác định hàm ẩm cốm thuốc 33 Bảng 3.11 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 34 Bảng 3.12 Kết định lượng loganin cốm thuốc 36 Bảng 4.1 Một số tiêu đề xuất tiêu chuẩn kỹ thuật cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1 Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc TD chuẩn bước sóng 254 nm 21 Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính dịch chiết cloroform từ cốm thuốc HS chuẩn bước sóng 254 nm 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc DB chuẩn bước sóng 254 nm 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc TrT chuẩn bước sóng 254 nm 26 Hình 3.5 Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc CKT chuẩn bước sóng 254 nm 27 Hình 3.6 Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc BL chuẩn bước sóng 254 nm 29 Hình 3.7 Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc CH chuẩn bước sóng 254 nm 31 Hình 3.8 Sắc ký đồ định tính dịch chiết methanol từ cốm thuốc, ST chuẩn loganin ánh sáng trắng sau phun thuốc thử 33 Hình 3.9 Đường chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính loganin 34 Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn loganin mẫu thử cốm thuốc 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý mắt ngày phổ biến đối tượng như: đau mắt đỏ, khô mắt, hoa mắt, chảy nước mắt,… ảnh hưởng đến công việc chất lượng sống người bệnh Đặc biệt, môi trường ngày bị ô nhiễm bụi, sinh hoạt không hợp lý … nên rối loạn thị lực bệnh lý mắt có xu hướng xảy sớm Trên thị trường có nhiều sản phẩm thuốc tân dược để điều trị phòng bệnh lý mắt Các sản phẩm có thể có tác dụng nhanh nó kèm theo nhiều tác dụng phụ Do đó, người ta muốn sử dụng thuốc cổ truyền từ dược liệu tự nhiên thân thiện với sức khỏe, tác dụng khơng mong muốn so với thuốc tân dược để điều trị bệnh nói chung bệnh mắt nói riêng Bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng gồm vị Thục địa, Hoài sơn, Sơn thù, Mẫu đơn bì, Câu kỷ tử, Trạch tả, Cúc hoa vàng, Bạch linh có tác dụng tư thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt dùng để điều trị cho bệnh nhân can thận âm hư, từ đó điều trị bệnh mắt Trong phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng, Thục địa quân dược, Sơn thù vị thần, đó loganin glycoside iridoid Sơn thù, lựa chọn làm marker định lượng hàm lượng hoạt chất thuốc Phương pháp sử dụng thông thường thuốc phương pháp sắc truyền thống, nhiên, cách sử dụng tốn nhiều thời gian phải sử dụng thời gian ngắn Vì thế, việc nghiên cứu để đưa cách sử dụng dễ dàng thuận tiện mà phát huy tốt tác dụng thuốc cần thiết Cốm thuốc dạng bào chế dễ sử dụng sử dụng bệnh nhân không dùng thuốc dạng viên Dạng cốm từ thuốc Kỷ cúc địa hồng Cơng ty cổ phần dược phẩm VCP bào chế Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dạng cốm thuốc Từ lý trên, đề tài “Xây dựng số tiêu chất lượng cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng” thực nhằm giải mục tiêu sau: - Định tính số thành phần hóa học cốm thuốc vị thuốc phản ứng hóa học sắc ký lớp mỏng - Định lượng loganin cốm thuốc CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng 1.1.1 Xuất xứ Phương thuốc Kỷ cúc địa hồng có xuất xứ từ “Y CẤP” [8] 1.1.2 Thành phần Thành phần phương thuốc Kỷ cúc địa hoàng bao gồm vị: [8] Thục địa 24 g Sơn thù 12 g Hoài sơn 12 g Trạch tả 9g Bạch linh 9g Mẫu đơn bì 9g Câu kỷ tử 9g Cúc hoa vàng 9g 1.1.3 Công năng, chủ trị phương thuốc - Công năng: Tư thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt [8] - Chủ trị: Can thận âm hư hai mắt hoa mờ khơng nhìn rõ vật, lịng mắt khơ sáp gặp gió chảy nước mắt [8] 1.1.4 Giải thích phương thuốc - Trong lý luận Y học cổ truyền, can khai khiếu mắt, khí can biểu mắt Khí can tốt thị lực tốt, ngược lại, mắt mờ thị lực suy giảm Nhìn vào mắt biết trạng thái can Nếu mắt khô sáp, thâm cuồng can huyết bất túc, đỏ sung huyết can hỏa thịnh, mắt vàng (âm hoàng dương hoàng) can nhiệt, mắt trắng dã can huyết hư Theo thuyết ngũ hành, can thuộc mộc, thận thuộc thủy, thủy sinh mộc nên can mộc sinh từ thận thủy Khi thận thủy suy lâu can mộc khơng ni dưỡng đầy đủ nên can huyết, can âm dần khô kiệt mà làm phát sinh chứng bệnh mắt hoa mắt, khô mắt, nhức mắt, mắt đỏ, chảy nước mắt… Vì thế, để điều trị bệnh lý mắt, người ta sử dụng thuốc bổ can thận để có thể điều trị từ bên trong, từ nguyên bệnh Bài thuốc Kỷ cúc địa hoàng với vị Thục địa, Hoài sơn, Sơn thù, Mẫu đơn bì, Câu kỷ tử, Trạch tả, Cúc hoa vàng, Bạch linh sử dụng để chữa bệnh can thận âm hư, từ đó điều trị bệnh lý mắt - Trong thuốc Thục địa, Câu kỷ tử bồi bổ thận âm, ích tinh tủy; Sơn thù bồi dưỡng thận ích can; Hồi sơn bồi dưỡng thận bổ tỳ; Trạch tả lợi thấp giáng trọc; Mẫu đơn bì tả can hỏa; Bạch linh thấm tỳ thấp; Cúc hoa vàng can minh mục; toàn hợp dụng có cơng hiệu tư thận dưỡng can, ích tinh sáng mắt [8] Sắc ký đồ định tính cốm thuốc Câu kỷ tử 254 nm 366 nm Ánh sáng thường sau phun TT Sắc ký đồ định tính cốm thuốc Bạch linh 254 nm 254 nm 254 nm 366 nm 366 nm 366 nm Ánh sáng thường sau phun TT Ánh sáng thường sau phun TT Ánh sáng thường sau phun TT Ánh sáng thường sau phun TT 254 nm 366 nm 366 nm Sắc ký đồ định tính cốm thuốc Cúc hoa vàng 254 nm 366 nm Ánh sáng thường sau phun TT Sắc ký đồ định tính cốm thuốc, Sơn thù loganin Ánh sáng thường sau phun TT 254 nm 254 nm 254 nm 366 nm 366 nm Ánh sáng thường sau phun TT Ánh sáng thường sau phun TT 366 nm Ánh sáng thường sau Phụ lục Định tính số nhóm chất mẫu nghiên cứu phản ứng hóa học ❖ Định tính flavonoid ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc: Cân g cốm thuốc cho vào bình nón, pha loãng 50 ml nước cất Đun bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc Dịch lọc đem lắc với n-hexan để loại tạp, lắc lần, lần 15 ml n-hexan Dịch chiết nước thu lắc với EtOAc lần, lần 15 ml Gộp dịch chiết EtOAc lại, bốc dung môi, cắn thu hòa tan 10 ml ethanol 900 làm phản ứng định tính - Cốm thành phần: Cân g cốm loại cho vào bình nón, thêm 50 ml EtOH 900 Đun cách thủy sôi vài phút Lọc nóng Dịch lọc tiến hành phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm ml dịch chiết, thêm bột Mg kim loại (khoảng 20 mg) Nhỏ giọt HCl đậm đặc (3 - giọt), để yên vài phút Phản ứng dương tính dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ - Phản ứng với dung dịch NaOH 10 %: Cho vào ống nghiệm ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10 % Phản ứng dương tính thấy xuất tủa vàng, thêm ml nước cất, tủa tan màu vàng dung dịch tăng thêm - Phản ứng diazo hóa: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa dung dịch kiềm (NaOH), thêm vài giọt thuốc thử diazo pha, lắc (hoặc đun nóng nồi cách thủy vài phút) Phản ứng dương tính xuất màu đỏ - Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 % Phản ứng dương tính xuất tủa xanh đen ❖ Định tính saponin ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc: Cân g cốm thuốc cho vào bình nón, pha loãng 20 ml nước cất Đun bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc Dịch lọc đem lắc với n-hexan để loại tạp, lắc lần, lần 10 ml n-hexan Dịch chiết nước thu lắc với n-butanol lần, lần 10 ml Gộp dịch chiết n-butanol lại, bốc dung môi, cắn thu hòa tan 10 ml ethanol 900 làm phản ứng định tính - Cốm thành phần: Cân g cốm loại cho vào bình nón riêng biệt, thêm 50 ml EtOH 90 % Đun cách thủy sơi vài phút Lọc nóng Dịch lọc tiến hành phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Hiện tượng tạo bọt: Cho MNC vào ống nghiệm lớn, thêm khoảng 10 ml nước cất, lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm khoảng phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Phản ứng dương tính cột bọt bền vững sau 15 phút - Phản ứng Salkowski: Lấy ml DC vào ống nghiệm, bốc đến cắn, hòa tan cắn ml cloroform Nghiêng ống nghiệm 45°, nhỏ từ từ đồng lượng dung dịch acid sulfuric đặc theo thành ống Phản ứng dương tính xuất vùng màu đỏ tím hai lớp ❖ Định tính glycoside tim ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại sau đó chiết hồi lưu với ethanol 90 % bình cách thủy 30 phút, lọc Dịch lọc loại tạp chì acetat 30 %, khuấy kỹ lọc bỏ tủa Thêm vào dịch lọc lượng vừa đủ natri sulfat để loại chì thừa Lọc, thu lấy dịch chiết Cất loại phần dung môi cồn chiết với dung môi cloroform Lấy dịch chiết cloroform đem bốc tới cắn, để làm phản ứng định tính glycoside tim ✓ Tiến hành: - Phản ứng Lieberman – Burchardat: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ml anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Phản ứng dương tính mặt tiếp xúc hai lớp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp có màu xanh - Phản ứng Legal: Chuẩn bị ống chứng Cho vào ống nghiệm chứa cắn chuẩn bị ống chứng ống 0,5 ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5 % giọt dung dịch NaOH 10 % Lắc Phản ứng dương tính xuất màu đỏ cam Khi so sánh màu sắc với ống chứng ống khơng có cắn glycoside tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm ống chứng - Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90 % Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric % phần dung dịch NaOH 10 %) pha Phản ứng dương tính xuất màu đỏ da cam Khi so sánh màu sắc với ống chứng ống cắn glycoside tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm ống chứng - Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90 % Lắc cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid % pha acid acetic Lắc Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Phản ứng dương tính mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ Khi lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía có màu xanh ❖ Định tính tanin ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại cho vào bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất Đun sôi phút Để nguội, lọc Dịch chiết thu làm phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Phản ứng với dung dịch FeCl3 %: Lấy ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch FeCl3 % Phản ứng dương tính xuất màu tủa màu xanh đen xanh nâu nhạt - Phản ứng với dung dịch gelatin %: Lấy ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch gelatin % Phản ứng dương tính xuất tủa bơng trắng - Phản ứng với chì acetat 10 %: Lấy ml dịch lọc, thêm giọt chì acetat 10 % Phản ứng dương tính xuất tủa bơng ❖ Định tính alkaloid ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại cho vào bình nón dung tích 50 ml có nút mài riêng biệt Thêm 25 ml dung dịch H2SO4 đun đến sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc Cho dịch lọc vào bình gạn 100 ml Kiềm hóa dịch lọc dung dịch amoniac đặc đến pH = - 10 (thử thị màu vạn năng) Chiết alkaloid base CHCl3 (3 lần x 10 ml), gạn lấy lớp CHCl3, bốc đến cách thủy tới khô, thu cắn Hòa tan cắn ml H2SO4 1N Dùng dịch chiết để định tính ✓ Tiến hành: - Phản ứng với TT Mayer: Nhỏ - giọt TT Mayer Phản ứng dương tính xuất kết tủa trắng đến vàng - Phản ứng với TT Bouchardat: Nhỏ 2- giọt TT Bouchardat Phản ứng dương tính xuất tủa nâu đến đỏ nâu - Phản ứng với TT Dragendorff: Nhỏ - giọt TT Dragendorff Phản ứng dương tính xuất tủa vàng cam đến đỏ ❖ Định tính polysaccharide ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại cho vào bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất Đun sôi 10 phút Để nguội, lọc Dịch chiết thu làm phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Đun cách thủy ml dịch lọc với 0,5 ml dung dịch Lugol (TT) vài phút Phản ứng dương tính dung dịch chuyển sang màu tím đỏ - xanh tím ❖ Định tính acid amin ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại cho vào bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất Đun sôi 10 phút Để nguội, lọc Dịch chiết thu làm phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Đun cách thủy ml dịch lọc với giọt TT Ninhydrin - phút Phản ứng dương tính xuất màu tím ❖ Định tính acid hữu ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại cho vào bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất Đun sôi 10 phút Để nguội, lọc Dịch chiết thu làm phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Cho ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vào bột Na2CO3 Phản ứng dương tính thấy có bọt khí bay lên ❖ Định tính đường khử ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại cho vào bình nón riêng biệt, thêm 30 ml nước cất Đun sôi 10 phút Để nguội, lọc Dịch chiết thu làm phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Đun cách thủy ml dịch lọc với 0,5 ml TT Fehling A 0,5 ml Fehling B vài phút Phản ứng dương tính xuất tủa đỏ gạch ❖ Định tính sterol ✓ Mẫu nghiên cứu: - Cốm thuốc cốm thành phần: Cân g cốm thuốc, g cốm thành phần loại cho vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 10 ml ether dầu hỏa, lọc kín, ngâm 12 Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc Dịch chiết thu làm phản ứng định tính ✓ Tiến hành: - Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng ml dịch chiết ether dầu hỏa dược liệu, cô cách thủy đến cắn Thêm vào ống nghiệm khoảng ml anhydride acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn Để nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính mặc phân cách có vịng tím đỏ, lớp chất lỏng phía có màu xanh Phụ lục Phương pháp định tính định lượng vị thuốc thuốc Kỷ cúc đia hoàng theo Dược điển Việt Nam V, tập Thục địa ✓ Định tính SKLM: - Bản mỏng: Silica gel GF254 - Dung môi khai triển: Ethyl acetat - methanol - acid formic (16:0,5:2) - Dung dịch thử: Lấv g dược liệu cắt nhỏ, thêm 50 ml methanol (TT) 80 %, lắc siêu âm 30 min, lọc Cô dịch lọc cách thủy đến cắn, hòa cắn ml nước Lắc với n-butanol bão hòa nước (TT) lần, lần 10 ml Gộp dịch chiết n-butanol, cô đến cắn Hòa cắn ml methanol (TT) làm dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Hòa tan verbascosid chuẩn methanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng mg/ml - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai, để khô mỏng nhiệt độ phòng, phun dung dịch 'aminoethyl diphenylorinat % methanol (TT), sấy mỏng 105 oC Quan sát mỏng ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ✓ Định lượng phương pháp sắc ký lỏng: - Pha động: Acetonitrile - dung dịch acid acetic 0,1 % (16:84) - Dung dịch thử: Cắt lượng dược liệu thành mảnh nhỏ (kích thước khoảng mm x mm), sấy 80 oC, áp suất giảm 24 h nghiền thành bột thơ Cân xác khoảng g bột dược liệu vảo bình nón nút mài, thêm xác 100 ml methanol (TT), đậy nút, cân Đun sôi hồi lưu 30 min, để nguội cân lại Bổ sung khối lượng methanol (TT), lắc đều, lọc Lấy xác 50 ml dịch lọc, cất thu hồi dung môi chân không đến gần khơ Dùng pha động để hịa tan chuyển tồn cắn vào bình định mức 10 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µl - Dung dịch chuẩn: Hịa tan verbascosid chuẩn pha động để dung dịch có nồng độ xác khoảng 10 µl/ml - Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µl) Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 334 nm Tốc độ dịng: 0,8 ml/min Thể tích tiêm: 20 µl - Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn Tính số đĩa lý thuyết cột Số đĩa lý thuyết cột tính pic verbascosid phải không 5000 Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn dung dịch thử Tính hàm lượng verbascosid dược liệu dựa vào diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C29H36O15 verbascosid chuẩn Dược liệu phải chứa khơng 0,02 % verbascosid (C29H36O15) tính theo dược liệu khơ kiệt Hồi sơn ✓ Định tính SKLM: - Bản mỏng: Silica gel 60GF254 - Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (9:1) - Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm ml hỗn hợp chloroform methanol (4 : 1), đun sôi ống sinh hàn hồi lưu khoảng 10 Để nguội, lọc, cô dịch lọc đến cắn, hòa cắn ml ethanol (TT) làm dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Củ mài (mẫu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 15 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, phun dung dịch vanillin (TT) % hỗn hợp acid phosphoric - methanol (1:1) Sấy mỏng 120 oC đến rõ vết Quan sát ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ✓ Định lượng: chưa có tiêu định lượng Sơn thù: ✓ Định tính SKLM: ➢ Phương pháp 1: - Bản mỏng: Silica gel G - Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat - acid formic (20:4:0,5) - Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethyl acetat (TT), siêu âm 15 min, lọc, bốc dịch lọc cách thủy đến cắn Hòa cắn ml ethanol (TT) dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Hòa tan acid ursolic chuẩn ethanol (TT) để dung dịch chứa mg/ml Nếu khơng có chất chuẩn, dùng 0,5 g bột Sơn thù (mẫu chuẩn) chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí, phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol (TT), sấy 105 oC tới vết xuất rõ Quan sát ánh sáng ban ngày Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải xuất vết màu đỏ tím có màu giá trị Rf với vết acid ursolic phải có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đổ dung dịch đối chiếu Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải xuất vết có huỳnh quang màu vàng cam có màu giá trị Rf với vết acid ursolic sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ➢ Phương pháp 2: - Dung môi khai triển: Ethyl acetat - ethanol - acid acetic băng (50:10:1) - Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol (TT), lắc siêu âm 15 min, lọc, bốc dịch lọc cách thủy đến cắn Hòa cắn ml ethanol (TT) dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Hòa tan lượng loganin chuẩn ethanol (TT) để dung dịch chứa mg/ml Nếu khơng có loganin chuẩn, lấy 0,5 g bột Sơn thù (mẫu chuẩn) chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí, phun dung dịch vanillin % acid sulfuric (TT), sấy 105 oC tới vết xuất rõ Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải xuất vết có màu giá trị với vết loganin có vết màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ✓ Định lượng phương pháp sắc ký lỏng: - Pha động: Acetonitrile - nước (15:85) - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,1 g bột dược liệu (qua rây số 355) vào bình nón nút mài, thêm xác 25 ml methanol 80 % (TT), đậy nút, cân Đun hồi lưu h, để nguội, cân lại Bổ sung khối lượng methanol 80 % (TT), lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µl - Dung dịch chuẩn: Hịa tan loganin chuẩn methanol 80% (TT) để dung dịch có nồng độ xác khoảng 40 µl /ml - Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C (5 µl) Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 240 nm Tốc độ dịng: ml/min Thể tích tiêm: 10 µl Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn Tiến hành sắc ký tính số đĩa lý thuyết cột Số đĩa lý thuyết cột tính pic loganin phải khơng 3000 Tiêm dung dịch chuẩn dung dịch thử Tính hàm lượng loganin dược liệu dựa vào diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C17H26O10 loganin chuẩn Dược liệu phải chứa không 0,6 % loganin (C17H26O10) tính theo dược liệu khơ kiệt Mẫu đơn bì ✓ Định tính SKLM: - Bản mỏng: Silica gel G - Dung môi khai triển: Cyclohexan - ethyl acetat (3:1) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 10 ml ether ethylic (TT), lắc kỹ, để yên 10 min, lọc Bốc dịch lọc cách thủy đến khô, thêm ml aceton (TT) để hòa tan cắn, dung dịch thử - Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan paeonol chuẩn aceton (TT) để dung dịch có nồng độ mg/ml - Dung dịch dược liệu đối chiếu: Nếu khơng có paeonol, lấy g bột Mẫu đơn bì (mẫu chuẩn), chiết mơ tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô khơng khí, phun dung dịch sắt (III) clorid % trọng ethanol (TT) Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch chất đối chiếu Hoặc có vết màu sắc giá tri Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu ✓ Định lượng phương pháp đo quang: Cân xác khoảng 0,2 g bột dược liệu (qua rây số 355) cho vào bình cầu, cất kéo nước dịch cất khoảng 450 ml, thêm nước vừa đủ 500 ml, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 274 nm Tính hàm lượng paeonol dược liệu theo A (1 %, cm) Lấy 862 giá trị A (1 %, cm) paeonol bước sóng 274 nm Dược liệu phải chứa paeonol (C9H10O3) khơng 1,2 % tính theo dược liệu khơ kiệt Bạch linh ✓ Định tính SKLM: - Bản mỏng: Silica gel G - Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat - acid formic (20:5:0,5) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 50 ml ether (TT), siêu âm 10 min, lọc, bay dịch lọc đến cắn, hòa cắn ml methanol (TT) - Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Bạch linh (mẫu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng khoảng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng đề khô nhiệt độ phòng Phun dung dịch vanillin % hỗn hợp acid sulfuric - ethanol (4:1), sấy mỏng 105 oC đến vết rõ Quan sát ánh sáng thường Các vết sắc ký đồ dung dịch thử phải tương ứng màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ✓ Định lượng: chưa có tiêu định lượng Trạch tả: ✓ Định tính SKLM: - Bản mỏng: Silica gel G - Dung môi khai triển: Cyclohexan - ethyl acetat (1:1) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 20 ml ethyl acetat (TT), siêu âm 30 min, lọc Chuyển tồn dịch lọc vào cột (đường kính cm, nhồi g bột nhơm oxyd trung tính dùng cho sắc ký cột phương pháp nhồi khô, kích thước hạt nhồi khoảng 200 mesh đến 300 mesh) Rửa giải 10 ml ethỵl acetat (TT) Thu dịch rửa giải bay tới khơ Hịa tan cắn thu ml ethyl acetat (TT) dịch chấm sắc ký - Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan 23-acetat alisol B chuẩn ethyl acetat (TT) để dung dịch có nồng độ mg/ml - Dung dịch dược liệu đối chiếu: Nếu khơng có chất chuẩn trên, dùng g bột Trạch tả (mẫu chuẩn) chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng để khơ nhiệt độ phịng Phun dung dịch natri tungstat % acid sulfuric 10 % ethanol (TT) Sấy mỏng nhiệt độ 105 oC đến rõ vết Quan sát ánh sáng ban ngày Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Hoặc sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu sắc vá giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu ✓ Định lượng phương pháp sắc ký lỏng: - Pha động: Acetonitrile - nước (73:27) - Dung dịch chuẩn: Hòa tan 23-acetat alisol B chuẩn acetonitrile (TT) để dung dịch có nồng độ xác khoảng 20 µg/ml - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,5 g bột dược liệu (qua rây số 180) vào bình nón nút mài, thêm xác 25 ml acetonitrile (TT), đậy nút cân Siêu âm (công suất 250 W, tần số 50 kHz) 30 min, để nguội cân lại Bổ sung acetonitrile (TT) để khối lượng ban đầu, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µl - Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm) Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 208 nm Tốc độ dịng: ml/min Thể tích tiêm: 10 µl Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn tính số đĩa lý thuvết cột Số đĩa lý thuyết cột tính theo pic 23-acetat alisol B phải không 3000 Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn dung dịch thử Tính hàm lượng 23-acetat alisol B dược liệu dựa vào diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C32H50O5 23acetat alisol B chuẩn Dược liệu phải chứa không 0,050 % 23-acetat alisol B (C32H50O5), tính theo dược liệu khơ kiệt Câu kỷ tử ✓ Định tính SKLM: - Bản mỏng: Silica gel G - Dung môi khai triển: Cloroform - ethyl acetat - acid formic (2:3:1 ) - Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón 50 ml thêm 20 ml nước, đun cách thủy 20 min, để nguội, lọc lấy dịch lọc Lắc dịch lọc với ethyl acetat (TT) lần, lần ml Gộp chung dịch chiết ethyl acetat, bay đến cắn cách thủy Hòa tan cắn với ml ethyl acetat (TT), dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 0,5 g bột Câu kỷ tử (mẫu chuẩn), chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai xong, lấy mỏng để khơ nhiệt độ phịng, quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ✓ Định lượng: chưa có tiêu định lượng Cúc hoa vàng ✓ Định tính SKLM: ➢ Phương pháp 1: - Bản mỏng: Silica gel G - Dung môi khai triển: Ethyl acetat - acid formic - nước (8:1:1) - Dung dịch thử: Lấy 10 ml dịch lọc A, bốc tới cắn, hòa tan cắn 20 ml nước nóng, lọc, dịch lọc lắc lần với ethyl acetat (TT), lần 10 ml, tập trung dịch chiết ethyl acetat, cô cách thủy tới cắn, hòa cắn ml ethanol (TT) dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Cúc hoa vàng (mẫu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 15 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, màu amoniac (TT) Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết (6 vết, đó có vết màu vàng nâu vết màu vàng xanh) có giá trị Rf màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ➢ Phương pháp 2: - Bản mỏng: Silica gel 60F254 - Dung môi khai triển: Ethyl acetat - 2-butanol - nước – acid formic (25:3:1:1) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 20 ml methanol (TT), lắc siêu âm 10 min, lọc Cô dịch lọc cách thủy đến cắn Hòa cắn ml ethanol (TT) dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Cúc hoa vàng (mẫu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần Dung dịch thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau khai triển, lấy mỏng khỏi bình sắc ký, để bay hết dung mơi nhiệt độ phịng Phun dung dịch sắt (III) clorid % ethanol (TT) đến rõ vết Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu ✓ Định lượng: chưa có tiêu định lượng ...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ KHÁNH HUYỀN Mã sinh viên: 1401281 XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC KỶ CÚC ĐỊA HỒNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS... cứu tiêu chuẩn hóa dạng cốm thuốc Từ lý trên, đề tài ? ?Xây dựng số tiêu chất lượng cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng? ?? thực nhằm giải mục tiêu sau: - Định tính số thành phần hóa học cốm thuốc vị thuốc. .. cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng 0,0383 % ❖ KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu: ➢ Hoàn thiện tiêu chuẩn kiểm nghiệm cốm thuốc Kỷ cúc địa hoàng ➢ Xây dựng phương pháp định lượng số thành phần khác cốm thuốc