BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN HỮU TRUNG PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ KIM CHI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN HỮU TRUNG MÃ SINH VIÊN: 1401644 PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ KIM CHI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đinh Thúy Hằng PGS.TS Phùng Thanh Hương Nơi thực hiện: Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu thực khóa luận, em ln nhận dạy dỗ, bảo tận tình thầy, cô giáo quan tâm chăm sóc từ gia đình bạn bè Đó nguồn động lực giúp em vượt qua khó khăn để hồn thành khóa luận Đặc biệt, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Đinh Thúy Hằng cán Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội dìu dắt, hướng dẫn, giúp em hòa nhập với môi trường nghiên cứu khoa học, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình làm thực nghiệm viết khóa luận Qua em biết cách tiếp cận nghiên cứu khoa học có hành trang vững cho đường sau Với lòng biết ơn sâu sắc , em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Phùng Thanh Hương - người thầy tâm huyết tận tình giúp đỡ em từ ngày đầu làm khoa học Cô truyền cảm hứng cho em khơi gợi niềm đam mê nghiên cứu em Không vậy, cô ln theo sát em suốt q trình làm khoa học, kịp thời đưa lời khuyên bổ ích học kĩ sống Từ đó, thân em trưởng thành tự tin đường làm nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Hồng Minh, cán phòng Nghiên cứu Phát triển Công nghệ cao, Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện, hướng dẫn em hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới anh chị cán Viện Vi sinh vật Cơng nghệ Sinh học, gia đình, người thân bạn bè bên giúp đỡ, động viên em vượt qua khó khăn học tập suốt năm vừa qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2019 Sinh viên Đoàn Hữu Trung MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) 1.1.1 Khái niệm môi trường sống LAB 1.1.2 Đặc điểm sinh học di truyền LAB 1.1.3 Khả ức chế vi khuẩn LAB 1.1.4 Ứng dụng LAB lĩnh vực y dược 1.2 Định danh LAB 1.2.1 So sánh trình tự 16S rADN 1.2.2 Xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh 1.3 Biofilm 1.3.1 Khái niệm cấu trúc 1.3.2 Sự hình thành vai trò biofilm vi khuẩn 1.3.3 Khả hình thành biofilm lồi vi khuẩn 13 1.3.4 Tác dụng ức chế hình thành biofilm vi khuẩn có lợi ứng dụng 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định 15 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phân lập LAB từ kim chi 19 2.3.2 Định danh chủng LAB dựa so sánh trình tự 16S rADN 20 2.3.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 22 2.3.4 Đánh giá khả LAB ức chế hình thành biofilm 22 2.3.6 Xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ kim chi 25 3.2 Định danh vi khuẩn lactic 28 3.2.1 Kết tách ADN tổng số 28 3.2.2 Kết khuếch đại 16S rADN, giải trình tự dựng phân loại 30 3.3 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chủng LAB phân lập 34 3.4 Kết đánh giá khả ức chế hình thành biofilm 35 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú giải tiếng Anh Chú giải tiếng Việt ADN Acid deoxyribonucleic AHLs N-acyl-homoserin lactons API CH Analytical Profile Index Carbohydrat ARN Acid ribonucleic ATP Adenosine triphosphate BK Bán kính BSA Bovine serum albumin CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EPS Extracellular polymeric substances Các hợp chất polymer ngoại bào GLP-1 Glucagon-like peptide Peptid có cấu trúc giống glucagon HACCP Hazard analysis and critical control points LAB Lactic acid bacteria LB Lysogeny broth LPS Lipopolysaccharid MQ Mili Q MRS Man, Rogosa, Sharpe OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase QS Quorum sensing Cảm biến mật độ tới hạn SDS Sodium dodecyl sulfate Taq Thermus aquaticus UV Ultraviolet Chỉ số hồ sơ phân tích Carbohydrat Albumin huyết bò Các điểm kiểm sốt tới hạn phân tích nguy Vi khuẩn lactic Tia cực tím DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất hydratcarbon sử dụng kit API CH50 Bảng 1.2 Một số thành phần biofilm Bảng 1.3 Một số vai trò màng biofilm Bảng 2.1 Các mẫu kim chi Hàn Quốc sử dụng để phân lập vi khuẩn lactic Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS Bảng 2.3 Thành phần môi trường LB Bảng 2.4 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR khuyếch đại 16S rADN Bảng 3.1 Kết phân lập vi khuẩn lactic từ kim chi Bảng 3.2 Kết tách chiết ADN tổng số Bảng 3.3 Kết so sánh trình tự 16S rADN chủng LAB phân lập với liệu GenBank Bảng 3.4 Kết đo mật độ quang chủng kiểm định môi trường DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại chi vi khuẩn lactic Hình 1.2 Sơ đồ bước hình thành biofilm vi sinh vật Hình 2.1 Thiết kế thí nghiệm Hình 3.1 Hình ảnh phân lập LAB kỹ thuật ống thạch bán lỏng Hình 3.2 Hình ảnh tinh LAB kỹ thuật cấy trải đĩa thạch MRS Hình 3.3 Ví dụ hình ảnh hình thái tế bào số chủng phân lập chụp kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần Hình 3.4 ADN tổng số chủng LAB khiết sau tách chiết Hình 3.5 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 16S rADN chủng LAB Hình 3.6 Cây phân loại 12 chủng LAB phân lập dựa so sánh trình tự 16S rADN Hình 3.7 Thí nghiệm đánh giá khả kháng khuẩn S aureus P aeruginosa thuộc nhóm ESKAPE chủng LAB phân lập Hình 3.8 Kết đánh giá khả ức chế hình thành biofilm chủng LAB phân lập P.aeruginosa Hình 3.9 Kết đánh giá khả ức chế hình thành biofilm chủng LAB phân lập S.aureus ĐẶT VẤN ĐỀ Kim chi sản phẩm truyền thống Hàn Quốc sản xuất cách lên men rau củ với vi khuẩn có lợi Theo đó, kim chi coi nguồn thực phẩm cung cấp probiotic góp phần vào việc nâng cao sức khỏe người Kim chi có hàm lượng lớn vitamin, chất khoáng, chất xơ số thành phần khác Theo nhiều nghiên cứu cơng bố, kim chi có hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, nâng cao sức khỏe tăng cường hệ miễn dịch [51] Bên cạnh đó, hệ vi sinh vật kim chi vô phong phú, bao gồm nhiều lồi vi khuẩn có lợi như: Leuconostoc sp, Lactobacillus sp, Weissella sp Lactococcus sp Theo đó, vi khuẩn lactic chiếm phần lớn hệ vi sinh vật chúng góp phần vào đặc tính kim chi [35] Nhiều nghiên cứu trước cho thấy tác dụng có lợi vi khuẩn lactic tiềm ứng dụng chúng ngành y dược Nghiên cứu tác dụng vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi chứng minh chúng có hoạt tính chống oxi hóa, chống béo phì, chống đái tháo đường hoạt tính ức chế sinh trưởng Helicobacter pylori [35] Nghiên cứu Abreu cộng (2012) rằng, so với người khỏe mạnh, vi khẩn lactic bao gồm Lactobacillus sakei suy giảm hệ vi sinh vật xoang mũi người mắc viêm xoang mạn tính [1] Thêm vào đó, theo kinh nghiệm dân gian Hàn Quốc, cách nhỏ trực tiếp dịch kim chi làm giảm triệu chứng viêm xoang mạn tính Trong đó, chưa có cơng bố thức chứng minh sở khoa học cách điều trị dân gian Với lí trên, để góp phần cung cấp thêm thơng tin tác dụng có lợi vi khuẩn lactic từ kim chi tiềm ứng dụng chúng lĩnh vực y dược Việt Nam, đề tài “Phân lập, định danh nghiên cứu số hoạt tính sinh học vi khuẩn lactic từ kim chi” triển khai với mục tiêu sau: Phân lập định danh vi khuẩn lactic từ kim chi Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh tác dụng kháng biofilm vi khuẩn lactic từ kim chi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) 1.1.1 Khái niệm môi trường sống LAB Vi khuẩn lactic (LAB) nhóm vi khuẩn đặc trưng trình sinh acid lactic - sản phẩm chuyển hóa cuối vi khuẩn lên men đường glucose Trong nhóm vi khuẩn LAB, lồi lên men đồng hình tạo acid lactic sản phẩm lên men (