ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB.) MAKINO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: HDC: TS PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG HDP: PGS.TS TỪ BÌNH MINH Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phƣơng Thiện Thƣơng PGS.TS Từ Bình Minh tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu anh chị, bạn cơng tác khoa Hố phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học tập nghiên cứu mơi trƣờng với nhiều máy móc, trang thiết bị đại Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố học, đặc biệt thầy cô môn Hố Phân tích, cho em kiến thức q giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học Hố khóa K24, đặc biệt ngƣời bạn nhóm Hố phân tích khóa K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, tháng 03 năm 2016 Học viên Vũ Văn Tuấn MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 01 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 03 1.1.Tổng quan dƣợc liệu Giảo cổ lam… ………………………………… 03 1.1.1 Đặc điểm thực vật… …………………………………………… 03 1.1.2 Phân bố sinh thái.……………………………………………… 04 1.1.3 Thành phần hóa học Giảo cổ lam……………………………… 05 1.1.4 Công dụng tác dụng sinh học Giảo cổ lam…… ………… 07 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học…………… 08 1.2.1 Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học dƣợc liệu …… 08 1.2.2 Phân tích thành phần hóa học dƣợc liệu Giảo cổ lam ……… 09 1.2.3 Kiểm nghiệm dƣợc liệu Giảo cổ lam.……………………………… 12 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu…………………………………… 13 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………… 14 2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị……………………………………………… 16 2.2.1 Chất chuẩn………………………………………………………… 16 2.2.2 Hóa chất… ……………………………………………………… 16 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ… ……………………………………………… 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu.………… …………………………………… 17 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn………………… ……………… 17 2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu ………………………………………… 17 2.3.3 Phƣơng pháp phân tích…………………………………………… 18 2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu đánh giá phƣơng pháp phân tích………… 19 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện tối ƣu cho q trình phân tích HPLC……….………………………………………………………… 19 2.4.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích ………………………………… 19 2.4.3 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………… 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện đo hệ thống sắc ký…………… 22 3.1.1 Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại chất nghiên cứu….… 22 3.1.2 Khảo sát thành phần pha động…………………………………… 24 3.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột………………… 29 3.1.4 Điều kiện tối ƣu cho trình tách hai hợp chất Rutin 31 Ginsenoside Rb1………………………………………………………… 3.1.5 Định tính hợp chất Rutin Ginsenoside Rb1 mẫu Giảo 31 cổ lam…………………………………………………………………… 3.2 Đƣờng chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lƣợng………………… 32 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đƣờng chuẩn…………… 32 3.2.2 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng………………………… 34 3.2.3 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn……………………………… 36 3.3 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu………………………………………… 39 3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết……………………………………… 39 3.3.2 Khảo sát phƣơng pháp chiết siêu âm……………………………… 40 3.3.3 Khảo sát phƣơng pháp chiết hồi lƣu……………………………… 42 3.3.4 Phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam………………… 44 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích………………………………………… 45 3.4.1 Đánh giá độ phƣơng pháp……………………………… 45 3.4.2 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại…………………………………… 48 3.5 Phân tích mẫu thực tế……………………………………………………… 52 BÀN LUẬN…………………………………………………………………… 56 KẾT LUẬN…………………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Thơng tin mẫu phân tích………………………………………… 15 Bảng 2.2: Chƣơng trình dung mơi rửa giải………………………………………… 19 Bảng 3.1: Chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động MeOH–nƣớc……… 24 Bảng 3.2: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử ứng với chƣơng trình gradient………………………………………………………… 25 Bảng 3.3: Các chƣơng trình gradient thử nghiệm với pha động ACN–nƣớc… … 26 Bảng 3.4: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử ứng với chƣơng trình gradient……………………………………………………… 26 Bảng 3.5: Chƣơng trình gradient tối ƣu với pha động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric……………… 28 Bảng 3.6: Thời gian lƣu, độ phân giải hệ số đối xứng pic cấu tử với pha động ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric ……………………… …… 28 Bảng 3.7: Kết khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột…………… 30 Bảng 3.8: Nồng độ diện tích pic trung bình chất……………………… 32 Bảng 3.9: Phƣơng trình đƣờng chuẩn chất……………………………… 34 Bảng 3.10: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng chất……………… 35 Bảng 3.11: Kết so sánh giá trị a với giá trị phƣơng trình đƣờng chuẩn Rutin…………………………………………………………………… 36 Bảng 3.12: Kết so sánh b b′ phƣơng trình đƣờng chuẩn Rutin 38 Bảng 3.13: Kết khảo sát ảnh hƣởng dung môi chiết……………………… 40 Bảng 3.14: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm……………… 41 Bảng 3.15: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm……………… 42 Bảng 3.16: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết hồi lƣu……………… 43 Bảng 3.17: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết số lần chiết……… 44 Bảng 3.18: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích Rutin…………………………………………………………………… 46 Bảng 3.19: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích Ginsenoside Rb1…………………………………………………………………… 46 Bảng 3.20: Kết phân tích lặp lại mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thêm chuẩn… 47 Bảng 3.21: Các đại lƣợng thống kê………………………………………………… 47 Bảng 3.22: Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất………………… 48 Bảng 3.23: Kết hàm lƣợng Rutin Ginsenoside Rb1 tìm lại đƣợc phƣơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác nhau………….……………… 49 Bảng 3.24: Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích tiến hành ba kỹ thuật viên khác nhau……………………………………… 50 Bảng 3.25: Các kiện đánh giá độ tái lặp lại phƣơng pháp phân tích……… 51 Bảng 3.26: Kết phân tích mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam……………… ……… 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Dƣợc liệu Giảo cổ lam………………….……………………………… 03 Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo vài saponin flavonoid có Giảo cổ lam ………………………………………………………………………………… 06 Hình 2.1: Hình ảnh dƣợc liệu Giảo cổ lam sản phẩm trà Giảo cổ lam………… 15 Hình 3.1: Phổ UV-VIS hai hợp chất Rutin Ginsenoside Rb1……… …… 22 Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung mơi MeOH–nƣớc……………………………………………………… 25 Hình 3.3: Sắc ký đồ HPLC chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung mơi ACN–nƣớc………………………………………………………… 26 Hình 3.4: Sắc ký đồ HPLC cấu tử ứng với chƣơng trình gradient thử nghiệm với hệ dung môi ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric…………… 29 Hình 3.5: Sắc ký đồ định tính Rutin Ginsenoside Rb1 mẫu Giảo cổ lam 32 Vĩnh Phúc…………………………………………………………… …………… Hình 3.6: Khoảng tuyến tính……………………………………………………… 33 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn chất………………………………………………… 34 Hình 3.8: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng Rutin Ginsenoside Rb1 mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam ……………………………………… 54 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt ACN Abs AS EtOH GC HPLC HPLC-ESI-MS/MS HPLC-DAD/FLD HPLC-DADAPCI/MSn LOD LOQ MeOH PDA ppm ppb ppt R RS RP-HPLC % RSD % RSDR SD tR UV-VIS VWD IR Tên đầy đủ Acetonitril Absorbance: Độ hấp thụ quang Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic Etanol Gas chromatography: Sắc ký khí High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA phát quang Sắc ký lỏng ghép nối detector PDA khối phổ với hệ ion hóa hóa học áp suất khí Limit of Detection: Giới hạn phát Limit of Quantitation: Giới hạn định lƣợng Metanol Photo-diode-array: Mảng điot điện tử Parts per million: Phần triệu Parts per billion: Phần tỷ Parts per trillion: Phần nghìn tỷ Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan Resolution: Độ phân giải Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo % Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối % Reproducibility standard deviation: % Độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối Standard deviation: Độ lệch chuẩn Retention time: Thời gian lƣu Ultraviolet-Visible: Tử ngoại khả kiến Variable Wavelength Detector Infrared: Hồng ngoại MỞ ĐẦU Theo số liệu thống kê Viện Dƣợc liệu, nƣớc ta có gần 5000 loài thực vật đƣợc ngƣời dân sử dụng y học cổ truyền, y học dân gian, chiếm gần 1/3 tổng số loài thực vật biết Việt Nam Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, thuốc quý đƣợc ngƣời dân sử dụng việc điều trị bệnh biến chứng tim mạch, làm tan cục máu đông, chống huyết khối, hạ mỡ máu Uống nƣớc từ thuốc Giảo cổ lam hàng ngày giúp giảm căng thẳng, tăng cƣờng sức khỏe, chống lại q trình lão hóa, hạ đƣờng huyết, bảo vệ tế bào gan, tăng tiết mật, tăng cƣờng chức giải độc cho gan, hỗ trợ điều trị bệnh ung thƣ Thậm chí Nhật Bản Trung Quốc, ngƣời ta coi Giảo cổ lam nhƣ phƣơng thuốc trƣờng sinh Theo nghiên cứu cơng bố hai nhóm hoạt chất có tác dụng Giảo cổ lam flavonoid saponin Nƣớc ta có 05 lồi thuộc chi Gynostemma [3] Các lồi có đặc điểm hình thái giống Các dƣợc liệu khơng phải lồi Gynostemma pentaphyllum đƣợc thƣơng gia gọi với tên "Giảo cổ lam" quảng cáo tác dụng chữa bệnh dƣợc liệu Giảo cổ lam Trên thị trƣờng nay, vị thuốc quý chủ yếu đƣợc bán dƣới dạng túi trà, sản phẩm từ Giảo cổ lam không rõ nguồn gốc đƣợc bày bán nhiều Điều ảnh hƣởng đến hiệu điều trị, sức khỏe quyền lợi ngƣời bệnh mà gây lòng tin ngƣời tiêu dùng sử dụng thuốc từ dƣợc liệu nói chung Giảo cổ lam nói riêng Ngồi ra, thành phần hóa học, hàm lƣợng hoạt chất Giảo cổ lam vùng có điều kiện thổ nhƣỡng, khí hậu khác khác Đây vấn đề cần phải nghiên cứu Ở Việt Nam, Dƣợc điển Việt Nam IV (2009) chƣa có chuyên luận Giảo cổ lam [3] Do đó, việc kiểm soát, đánh giá chất lƣợng mẫu Giảo cổ lam sản phẩm từ dƣợc liệu gặp nhiều khó khăn Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học Giảo cổ lam cơng bố nƣớc dừng mức định tính xác định nhóm chất [9], [10], [12] Các nghiên cứu cơng bố nƣớc ngồi sử dụng kỹ Lần 1106734 14,088 918924 24,033 Giá trị trung bình 1107305 14,068 927876 24,069 RSD (%) 0,13 0,20 0,61 0,16 Kết cho thấy giá trị RSD < 1% chứng tỏ điều kiện hệ thống sắc ký HPLC lựa chọn ổn định, phù hợp cho phép phân tích định tính định lƣợng Rutin Ginsenoside Rb1 3.4.2.2 Đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp phương pháp phân tích Để xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp phân tích, chúng tơi tiến hành đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp Thông thƣờng, trình đánh giá đƣợc thực thiết bị khác cho kỹ thuật viên khác thực phép thử nghiệm (đổi tay kỹ thuật viên) Trong điều kiện phòng thí nghiệm, lựa chọn phƣơng pháp đổi tay kỹ thuật viên Kết phân tích đƣợc đánh giá dựa vào kết phân tích kỹ thuật viên phép thử nghiệm nhƣ sau: Mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam đƣợc thêm chuẩn 200 ppm Rutin 140 ppm Ginsenoside Rb1 Mẫu đƣợc xử lý nhƣ mục 3.3.4 phân tích hệ thống HPLC Q trình phân tích đƣợc thực song song với mẫu khơng thêm chuẩn Từ đó, xác định đƣợc nồng độ Rutin Ginsenoside Rb1 thêm vào dựa phƣơng trình đƣờng chuẩn Mỗi kỹ thuật viên làm lặp lại 10 lần Kết đƣợc thể bảng 3.23 Bảng 3.23 Kết hàm lƣợng tìm lại đƣợc Rutin Ginsenoside Rb1 phƣơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác KTV-1 STT Rutin (ppm) KTV-2 Ginsenoside Rb1 (ppm) Rutin (ppm) KTV-3 Ginsenoside Rutin Ginsenoside Rb1 (ppm) (ppm) Rb1 (ppm) 195,7 138,8 199,2 139,0 198,9 139,2 197,7 137,6 198,1 140,2 200,0 140,7 199,1 138,0 198,8 140,0 198,9 140,1 49 195,5 139,1 199,1 140,6 197,8 138,0 196,5 139,2 199,5 139,0 198,1 139,8 199,4 138,5 197,9 139,2 198,2 139,2 198,2 139,2 197,7 138,1 202,0 138,1 199,1 138,7 201,6 139,1 199,1 139,9 199,0 140,9 199,9 138,4 198,7 139,0 10 198,0 139,7 198,1 141,2 196,6 142,5 Từ kết trên, sử dụng phần mềm minitab 16, thu đƣợc bảng kiện thống kê nhƣ bảng 3.24 Bảng 3.24 Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích tiến hành ba KTV khác KTV-1 Đại lƣợng đánh giá Xtb Rutin KTV-2 Ginsenosid e Rb1 Rutin Ginsenosid e Rb1 KTV-3 Rutin Ginsenoside Rb1 198,6 139,0 199,0 139,5 199,1 139,7 1,128 0,914 1,175 0,986 1,310 1,311 0,568 0,658 0,590 0,707 0,607 0,938 Sai số tƣơng đối (ER) (%) -0,700 -0,714 Phƣơng sai 2,11 0,836 Độ lệch chuẩn lặp lại (SD) Độ lệch chuẩn tƣơng đối (% RSD) 0,500 1,38 -0,357 0,973 0,450 2,05 -0,214 1,72 Nhƣ vậy, vào giá trị % RSD KTV kết luận, phép định lƣợng Rutin, độ chụm (hay độ lặp lại) KTV-1 tốt KTV-3 Tuy nhiên, giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ ba KTV làm thí nghiệm cho độ chụm (độ lặp lại) tốt Dựa vào sai số tƣơng đối giá trị trung bình tìm đƣợc giá trị μ kết luận kết phân tích ba KTV mắc sai số hệ thống âm Độ 50 đánh giá qua sai số tƣơng đối cho thấy kết phân tích Rutin KTV-3 tốt KTV-1 Tuy nhiên, ba giá trị sai số tƣơng đối thấp (< 1%), chứng tỏ KTV làm Nói cách khác, kết phân tích ba KTV xác (độ chụm tốt, độ cao) Từ kết bảng 3.27, tiếp tục tính tốn độ lệch chuẩn tái lặp phòng thí nghiệm theo cơng thức: - Phƣơng sai mẫu (within-sample estimation of variance): k S r = MS within  S j 1 i k k x x j 1 i - Trung bình tập hợp - Phƣơng sai mẫu (between-sample estimation of variance): k k MS between  - k  ( x j  x) j 1 k 1 Phƣơng sai tái lặp S2R= S2L + S r = MSwithin + MSbetween - Độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối % RSDR = 100.SR/ x (%) Dùng công thức trên, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.25 Bảng 3.25 Các kiện đánh giá độ tái lặp phƣơng pháp phân tích Đại lƣợng Rutin Ginsenoside Rb1 Phƣơng sai mẫu MSwithin 1,85 1,18 Trung bình tập hợp 198,9 139,4 Phƣơng sai mẫu MSbetween 0,21 0,39 51 Phƣơng sai tái lặp 2,06 1,57 Độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối (% RSDR) 0,722 0,899 Nhận xét thấy, giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ phƣơng pháp có độ tái lặp tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích nhiều phòng thí nghiệm khác 3.5 Phân tích mẫu thực tế Áp dụng điều kiện tối ƣu đƣợc khảo sát, chúng tơi tiến hành phân tích mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thu hái số vùng khác nhƣ: Vĩnh Phúc, Quảng Bình, Hòa Bình, Lào Cai, 02 mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thu mua thị trƣờng (mua phố Lãn Ông chợ Ninh Hiệp) mẫu trà Giảo cổ lam công ty cổ phần Dƣợc phẩm Bình Minh Tại vùng chúng tơi phân tích 03 mẫu ngẫu nhiên, mẫu đƣợc phân tích lặp lại lần Kết đƣợc trình bày bảng 3.26 hình 3.8 Bảng 3.26 Kết phân tích mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam Mẫu GCLVĩnh Phúc GCLQuảng Bình Độ ẩm (%) 11,17 9,48 GCLHòa Bình 10,72 GCLLào Cai 11,56 Khối lƣợng cân (g) Diện tích pic (S) trung bình (AU.s) Hàm lƣợng Rutin (%)* 2,089 2,057 2559855 2453773 Ginsenoside Rb1 991468 963385 2,043 2639008 938199 0,394 2,015 2,077 2,065 2,075 2,044 1921727 1910122 2038113 2275871 2289331 897815 845295 886677 734237 734796 0,285 0,276 0,294 0,327 0,334 2,023 2406794 733252 0,355 2,077 2864532 559387 0,416 2,081 2978678 550125 0,432 Rutin 52 Hàm lƣợng Ginsenoside Rb1 (%)* Lặp lại TB Lặp lại 0,372 0,364 0,377± 0,175 0,172 0,015 0,285± 0,009 0,339± 0,015 0,420± 0,011 0,168 0,158 0,143 0,152 0,123 0,125 0,126 0,089 0,087 TB 0,172± 0,003 0,151 ± 0,006 0,126 ± 0,002 0,085 ± 0,004 1,989 2711126 497582 GCL-thị 12,34 trƣờng 2,085 < LOD < LOD < LOD < LOD GCL-thị 10,09 trƣờng 1,987 < LOD < LOD < LOD < LOD 2,016 < LOD < LOD < LOD < LOD GCLBM 6,08 0,411 *: Các kết tính theo dược liệu khơ tuyệt đối 53 0,080 A B Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng Rutin (A) Ginsenoside Rb1 (B) mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam 54 Kết cho thấy, hàm lƣợng Rutin mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam nằm khoảng từ 0,285%–0,420% (tính theo khối lƣợng dƣợc liệu khơ tuyệt đối) Trong đó, mẫu hà thủ đỏ thu hái Lào Cai có hàm lƣợng Rutin cao Hàm lƣợng Ginsenoside Rb1 mẫu Giảo cổ lam nằm khoảng từ 0,085% –0,172% (tính theo khối lƣợng dƣợc liệu khơ tuyệt đối) Trong mẫu thu hái Tam Đảo (Vĩnh Phúc) có hàm lƣợng Ginsenoside Rb1 cao Hai mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam thu mua thị trƣờng (một mẫu thu mua chợ Ninh Hiệp, mẫu thu mua chợ Lãn Ông) khơng có hai thành phần Rutin Ginsenoside Rb1 Mẫu trà Giảo cổ lam Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Bình Minh khơng có hai thành phần Kết sắc ký đồ HPLC (hình 3.8) cho thấy, thành phần hóa học ba mẫu khơng giống với thành phần hóa học mẫu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) thu hái tự nhiên 55 BÀN LUẬN Với kết đạt đƣợc, chúng tơi có số bàn luận nhƣ sau: Đã xây đựng đƣợc điều kiện phân tích định tính, định lƣợng hai hoạt chất Rutin Ginsenoside Rb1 dƣợc liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) phƣơng pháp HPLC Ở Việt Nam, Dƣợc điển Việt Nam IV chƣa có chuyên luận Giảo cổ lam Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học Giảo cổ lam công bố nƣớc dừng mức định tính xác định nhóm chất Vì vậy, nghiên cứu đƣợc coi cơng trình nghiên cứu phƣơng pháp phân tích, định lƣợng thành phần hóa học dƣợc liệu Giảo cổ lam Việt Nam Đã xây dựng đƣợc quy trình định lƣợng đồng thời hợp chất (Rutin Ginsenoside Rb1) mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam Qua việc tra cứu tài liệu, chƣa thấy Dƣợc điển quốc gia có tiêu chí định lƣợng hoạt chất Giảo cổ lam Dƣợc điển Hồng Kông (2012), quy định hai hợp chất Ombuoside Rutin làm hai chất đối chiếu tiêu định tính phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, bốn flavonoid bao gồm Rutin, Ombuoside, Quercetin, Ombuin đƣợc chọn làm chất đối chiếu tiêu chí định tính "dấu vân tay HPLC" Do đó, kết nghiên cứu cung cấp thêm sở liệu khoa học, gợi ý cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho dƣợc liệu Giảo cổ lam Dƣợc điển Việt Nam sau Đã lựa chọn đƣợc phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam phù hợp nhất, là: Chiết hồi lƣu 2,0 g mẫu với 50 ml MeOH 80% 700C 1h Phƣơng pháp chiết mẫu xây dựng có nhiều ƣu điểm nhƣ thời gian nhanh, thiết bị chiết xuất đơn giản, rẻ tiền, phƣơng pháp dễ thực hiện, áp dụng đơn vị kiểm nghiệm Đã tiến hành xác định đƣợc hàm lƣợng hai hoạt chất Rutin Ginsenoside Rb1 (các hợp chất có tác dụng) mẫu Giảo cổ lam theo phƣơng pháp tối ƣu xây dựng Hàm lƣợng hai hợp chất mẫu nghiên cứu cao so với mẫu Giảo cổ lam Trung Quốc (các tài liệu công bố) Tuy nhiên, điều kiện nên tiến hành định lƣợng đƣợc mẫu Giảo cổ lam thu hái 56 04 địa phƣơng bao gồm Vĩnh Phúc, Lào Cai, Quảng Bình, Hòa Bình Cần có nghiên cứu khác, thu hái định lƣợng nhiều mẫu Giảo cổ lam nhiều vùng nữa, từ đánh giá xác chất lƣợng dƣợc liệu Giảo cổ lam, tạo sở khoa học cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho dƣợc liệu Việt Nam 57 KẾT LUẬN Với mục tiêu nghiên cứu đặt ra, thu đƣợc kết nhƣ sau: Đã xây dựng đƣợc điều kiện phân tích 02 hoạt chất (Rutin Ginsenoside Rb1) phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao Các điều kiện bao gồm: - Cột tách: Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; µm) cột bảo vệ Supelguard Ascentis C18 (20 mm x 4,0 mm, μm) - Detector UV-VIS: bƣớc sóng 203 nm 257 nm - Lựa chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp cho hiệu tách tốt 02 hợp chất Khảo sát ba hệ dung môi MeOH–nƣớc, ACN–nƣớc hệ ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3) Lựa chọn đƣợc hệ dung môi ACN–nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3) cho khả tách tốt - Lƣợng mẫu tiêm vào cột phù hợp 10 μl - Khảo sát chế độ rửa giải gradient khác lựa chọn đƣợc chƣơng trình rửa giải phù hợp Đã đánh giá đƣợc phƣơng pháp phân tích về: độ lặp lại tái lặp lại (các giá trị RSD RSDR nhỏ 1); tính tuyến tính (các giá trị R đạt 0,9999); độ đúng, độ thu hồi (hiệu suất thu hồi Rutin Ginsenoside Rb1 đạt khoảng 93,1%–103,6%); giới hạn phát (LOD) Rutin Ginsenoside Rb1 lần lƣợt lầ 0,28 ppm 0,45 ppm; giới hạn định lƣợng (LOQ) Rutin Ginsenoside Rb1 lần lƣợt 0,93 ppm 1,49 ppm Dựa điều kiện tối ƣu khảo sát, tiến hành định lƣợng đồng thời 02 chất Rutin Ginsenoside Rb1 dƣợc liệu Giảo cổ lam Kết phân tích cho thấy, hàm lƣợng Rutin mẫu dƣợc liệu Giảo cổ lam nằm khoảng từ 0,285%-0,420% (tính theo khối lƣợng dƣợc liệu khô tuyệt đối) Hàm lƣợng Ginsenoside Rb1 mẫu Giảo cổ lam nằm khoảng từ 0,085% đến 0,172% (tính theo khối lƣợng dƣợc liệu khơ tuyệt đối) Ba mẫu Giảo cổ lam thu mua thị trƣờng (một mẫu thu mua chợ Ninh Hiệp, mẫu thu mua chợ Lãn Ông 58 mẫu trà Giảo cổ lam Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Bình Minh) khơng có hai thành phần Rutin Ginsenoside Rb1 Ba mẫu thu mua thị trƣờng có thành phần hóa học khơng giống với thành phần hóa học mẫu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) thu hái tự nhiên 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Phạm Tuấn Anh (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Giảo cổ lam thu hái Sa Pa, tỉnh Lào Cai (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Cucurbitaceae, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh (2014), "Định lƣợng saponin toàn phần giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng vùng phƣơng pháp đo quang", Tạp chí Dược học, 54(2), tr 52-56 Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trần Văn Ơn cộng (2015), "Phân loại hình thái số lồi thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam", Tạp chí Dược học, 55(10), tr 34-38 Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, NXB Y học, Hà Nội Vũ Đức Cảnh (1999), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Curcubitaceae, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ Đại học, Đại học Dƣợc Hà Nội Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Tiến Dẫn (1999), Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Thất diệp đởm, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội Phạm Thanh Hƣơng (2013), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Giảo cổ lam, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ Đại học, Đại học Dƣợc Hà Nội Phạm Thị Lan (2013), Định tính saponin giảo cổ lam sắc ký lớp mỏng, Khóa luận Tốt nghiệp Dƣợc sĩ Đại học, Đại học Dƣợc Hà Nội 10 Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), Định tính Saponin dược liệu Giảo cổ lam HPLC, Khóa luận Tốt nghiệp Dƣợc sĩ Đại học, Đại học Dƣợc Hà Nội 11 Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội 60 12 Trịnh Thị Diệp Thanh (2013), Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam phương pháp đo quang, Khóa luận Tốt nghiệp Dƣợc sĩ Đại học, Đại học Dƣợc Hà Nội 13 Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình mơn học thống kê hóa phân tích, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội 14 Viện Dƣợc liệu (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 15 Viện Dƣợc liệu (2011), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội II Tiếng Anh 16 Al-Dhabi N A., Arasu M V., Park C H., Park S U (2014), "An up-to-date review of rutin and its biological and pharmacological activities", EXCLI Journal, 14, pp 59-63 17 Blumert M., Li J L (1999), Jiaogulan China 's “Immortality” Herb, Torchlight Publishing Inc., Badger, USA 18 Chinese Pharmacopoeia Commission (2010), Chinese pharmacopoeia, China Medical Science and Technology Press, Vol I China 19 Circosta C., De Pasquale R., Occhiuto F (2005), "Cardiovascular effects of the aqueous extract of Gynostemma pentaphyllum Makino", Phytomedicine, 12(9), pp 638-643 20 Cui J F., Eneroth P., Bruhn J G (1999), "Gynostemma pentaphyllum: identification of major sapogenins and differentiation from Panax species", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 8(3), pp 187-191 21 Dong M W (2006), Modern HPLC for practicing scientists, A John Wiley and Sons, Inc., Publication, pp 20-25 22 Gong F., Liang Y Z., Xieb P S., Chau F T (2003), "Information theory applied to chromatographic fingerprint of herbal medicine for quality control", Journal of Chromatography A, 1002(1–2), pp 25–40 61 23 Government of the Hong Kong Special Administrative Region (2012), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards, Volume V Hong Kong 24 Han M Q., Liu J X., Gao H (1995), "Effects of 24 Chinese medicinal herbs on nucleic acid, protein and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell", Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 15(3), pp 147-149 25 Kao T H., Huang S C., Stephen Inbaraj B., Chen B H (2008), "Determination of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by liquid chromatography–Mass spectrometry", Analytica Chimica Acta, 626(2), pp 200–211 26 Lee C H., Kim J H (2014), "A review on the medicinal potentials of ginseng and ginsenosides on cardiovascular diseases", Journal of Ginseng Research, 38(3), pp 161166 27 Leung K W., Wong A S (2010), "Pharmacology of ginsenosides: a literature review", Chinese Medicine, 5(20), pp 1-10 28 Liao X Y (2013), "Determination of Rutin, Ginsenoside Rb1 and Quercetin in Gynostemma pentapylla by HPLC with Programmed Wavelength UV Detection", Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 19(3), 127-129 29 Liu F., Ren D., Guo D A., Pan Y., Zhang H., Hu P (2008), "Method development for gypenosides fingerprint by high performance liquid chromatography with diode-array detection and the addition of internal standard", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 56(3), pp 389-393 30 Liu X., Ye W., Mo Z., Yu B., Zhao S (2004), "Five new Ocotillone-type saponins from Gynostemma pentaphyllum", Journal of Natural Products, 67(7), pp 1147-1151 31 Lu J G., Zhu L., Lo K Y (2013), "Chemical differentiation of two taste variants of Gynostemma pentaphyllum by using UPLC−Q-TOF-MS and HPLC−ELSD", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(1), pp 90-97 62 32 Lu J Q., Chen L., Xiao B., Wan W., Yu F., Tian Y P (2007), "Studies on the HPLC fingerprint spectrum of flavonoids in Gynostemma pentaphyllum", Zhong Yao Cai, 30(8), pp 929-932 33 Marino A., Elberti M G., Cataldo A (1989), "Sterols from Gynostemma pentafillum", Phytochemistry, 65(4), pp 317-319 34 Ma S L., Wang F X., Yang X., Wan S N., Wei X Y (2015), "Diversity of Endogeny Eumycetes in Gynostemma pentaphyllum and Its Correlation with Gypenoside XLIX", Zhong Yao Cai, 38(3), pp 476-480 35 Mishra R N., Joshi D (2011), "Jiao Gu Lan (Gynostemma pentaphyllum)", The Chinese Rasayan- Current Research Scenario, 2(4), pp 1483-1502 36 Qi G., Zhang L., Xie W L., Chen X Y., Li J S (2000), "Protective effect of gypenosides on DNA and RNA of rat neurons in cerebral ischemia-reperfusion injury", Acta Pharmacologica Sinica, 21(12), pp 1193-1196 37 Razmovski-Naumovski V., Hwang T S H., Hoan T V (2005), "Chemistry and Pharmacology of Gynostemma pentaphyllum", Phytochemistry Reviews, 4(2), pp 197219 38 Tsai Y C., Lin C L., Chen B H (2010), "Preparative chromatography of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum and their antiproliferation effect on hepatoma cell", Phytomedicine, 18(1), pp 2–10 39 University China Pharmaceutical (1996), Encyclopedia of Chinese Herbs, China Medicine, Science and Technology Publisher, Vol II, pp 1878-1882, China 40 Wagner H., Bauer R., Melchart D., Xiao P G., Staudinger A (2015), Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal Medicines: Thin-layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs, Springer 63 ... đề tài Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất dƣợc liệu Giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum (Thunb. ) Makino với mục tiêu - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng hai hợp chất Rutin... VŨ VĂN TUẤN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM (THUNB. ) MAKINO Chuyên ngành: Hóa phân tích... (Cucurbitaceae) [6], [15] Theo nghiên cứu công bố, Việt Nam có 05 lồi thuộc chi Gynostemma bao gồm Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb. ) Makino) , Cổ yếm bóng (Gynostemma laxum (Wall .) Cogn .), Giảo