ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ KIM LIÊN PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TỪ HỆ GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ KIM LIÊN PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HÓA ENZYME METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TỪ HỆ GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: TS Lê Tiến Dũng TS Trần Thị Dụ Chi Hà Nội, 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Tiến Dũng TS Trần Thị Dụ Chi, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình giảng dạy, dìu dắt tơi thời gian học tập Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán học viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp hết lòng giúp đỡ tơi thực thành cơng luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho thời gian qua Luận văn nằm đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu protein mẫn cảm với oxi hóa methionine vai trò enzyme methionine sulfoxide reductase nông nghiệp” Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia tài trợ mã số 106-NN.02-2013.46 Hà Nội, tháng 06 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Kim Liên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số protein peptide bị ảnh hưởng Met bị oxi hóa 13 Bảng 1.2 Các MSR vi khuẩn E coli 14 Bảng 1.3 Tóm tắt nghiên cứu di truyền vai trò MSRA 18 Bảng 1.4 Số lượng gen MSRA MSRB số nhóm sinh vật 20 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.3 Cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 29 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 50 l 30 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân dòng cADN 30 Bảng 2.6 Các cặp mồi sử dụng phản ứng PCR RT-PCR 31 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 25 l 32 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển 32 Bảng 3.1 Xác định domain đặc trưng dự đốn vị trí tế bào protein MSRA 35 Bảng 3.2 Dự đốn vị trí Cys xúc tác Cys tái tạo GmMSRA 38 Bảng 3.3 Số lượng exon intron GmMSRA 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Methionine Hình 1.2 Quá trình sinh tổng hợp Methionine Hình 1.3 Tổng hợp ethylene hệ thống mơ hình hóa học Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp ethylene Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp Glucosinolate từ Methionine Hình 1.6 Sơ đồ hình thành gốc tự chứa oxi Hình 1.7 Q trình oxi hóa Met 11 Hình 1.8 Phản ứng khử MetO Met MSR 12 Hình 1.9 Sơ đồ minh họa chế xúc tác phản ứng khử MetO MSR 16 Hình 3.1 So sánh đa trình tự protein GmMSRA 37 Hình 3.2 Số lượng exon intron gen mã hóa cho GmMSRA 38 Hình 3.3 Các GmMSRA hình thành nhân đơi hệ gen 40 Hình 3.4 Đồ thị đánh giá mức độ biểu Gm MSRA mô khác 41 Hình 3.5 Mức độ biểu GmMSRA giai đoạn phát triển khác 42 Hình 3.6 Mức độ biểu GmMSRA điều kiện bình thường điều kiện khô hạn 43 Hình 3.7 Kết nhân dòng đoạn cADN mã hóa gen GmMSRA6 44 Hình 3.8 Cấu trúc vector tách dòng pKS 45 Hình 3.9 Vị trí nhận biết enzyme giới hạn 46 Hình 3.10 Kết biến nạp gen GmMSRA6 vào vector pKS 46 Hình 3.11 Cấu trúc vector biểu nấm men p425GPD 47 Hình 3.12 Kết biến nạp gen GmMSRA6 vào vector p425 48 Hình 3.13 Thử nghiệm hoạt tính enzyme in vivo 49 Hình 3.14 Thử nghiệm khả kháng lại tác nhân oxi hóa H2O2 51 Hình 3.15 Cấu trúc vector pGreen 52 Hình 3.16 Tạo chuyển gen phương pháp nhúng hoa chọn lọc mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L 53 Hình 3.17 Điện di kiểm tra ADN tổng số tách chiết từ chuyển gen A thaliana (gel agarose 0,8%, nhuộm ethidium bromide) 54 Hình 3.18 Điện di sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số chuyển gen (gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide) 55 Hình 3.19 Điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR gel agarose 1.3%, nhuộm ethidium bromide 56 Hình 3.20 Hình thái mang gen chuyển (A) không mang gen chuyển (B) giai đoạn 10 ngày tuổi 57 Hình 3.21 Dòng đối chứng hệ F3 58 Hình 3.22 Dòng chuyển gen 35S::GmMSRA6-1 hệ F3 59 Hình 3.23 Dòng chuyển gen 35S::GmMSRA6-2 hệ F3 60 Hình 3.24 Hình thái dòng chuyển gen đĩa thạch giai đoạn tuổi khác 61 Hình 3.25 Hình thái dòng chuyển gen giá thể đất giai đoạn tuổi khác 62 Hình 3.26 Đĩa đối chứng mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/ L 63 Hình 3.27 Thử nghiệm kháng mặn dòng đối chứng dòng chuyển gen 64 BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt, kí hiệu Tiếng Anh cs Met Cộng Methionine MetO Methionine sulfoxide MS Murashige & Skoog MSR Tiếng Việt Methionine sulfoxide reductase NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ROS Reactive Oxygen species Các gốc tự chứa oxi RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 METHIONINE VÀ Q TRÌNH OXI HĨA METHIONINE BỞI CÁC GỐC TỰ DO CHỨA OXI (REACTIVE OXYGEN SPECIES - ROS) 1.1.1 Giới thiệu chung methionine 1.1.1.1 Cấu trúc hóa học, đặc tính sinh học sinh tổng hợp methionine 1.1.1.2 Methionine dẫn xuất S-adenosyl-L-methionine 1.1.1.3 Methionine chu trình sinh tổng hợp ethylene 1.1.1.4 Methionine – tiền chất q trình chuyển hóa glucosinolate 1.1.2 Q trình oxi hóa methionine gốc tự chứa oxi 1.2 ENZYME METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE (MSR) VÀ CƠ CHẾ SỬA CHỮA METHIONINE SULFOXIDE 12 1.2.1 Lịch sử phát họ enzyme MSR 12 1.2.2 Chức bảo vệ tế bào hệ thống MSR 13 1.2.3 Các thành viên họ enzyme MSR 14 1.2.4 Cơ chế sửa chữa oxi hóa Met hệ thống MSR 15 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 18 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 18 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 22 1.4 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 23 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 2.1 VẬT LIỆU 24 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.2 Hóa chất 25 2.1.3 Thiết bị 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Tìm kiếm gen mã hóa cho enzyme methionine sulfoxide reductase A hệ gen đậu tương (GmMSRA) 28 2.2.2 Đánh giá mức độ biểu GmMSRA 28 2.2.2.1 Mức độ biểu mô quan điều kiện sinh trưởng khác 28 2.2.2.2 Đánh giá biểu gen điều kiện bình thường bất lợi 28 2.2.3 Xác định đặc tính GmMSRA thơng qua biểu nấm men Saccharomyces cerevisiae 29 2.2.3.1 Kỹ thuật tách dòng gen 29 2.2.3.2 Phân tích đặc tính gen mã hóa MSRA biểu nấm men 30 2.2.4 Phân tính đặc tính GmMSRA thông qua biểu mô hình Arabidopsis thaliana 31 2.2.4.1 Tạo mơ hình A thaliana siêu biểu GmMSRA 31 2.2.4.2 Phân tích kiểu hình chuyển gen 32 2.2.4.3 Đánh giá hình thái chuyển gen 32 2.2.4.4 Thử nghiệm tính kháng mặn 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 KẾT QUẢ TÌM KIẾM VÀ PHÂN TÍCH CÁC GEN MÃ HÓA CHO ENZYME MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG 34 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN MÃ HÓA MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG 41 3.2.1 Đánh giá mức độ biểu GmMSRA mô khác 41 3.2.2 Đánh giá mức độ biểu GmMSRA giai đoạn phát triển khác Genevestigator® 42 3.2.3 Đánh giá mức độ biểu GmMSRA điều kiện bình thường bất lợi 43 3.3 PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME GmMSRA CỦA ĐẬU TƯƠNG THÔNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE 44 3.3.1 Kết tách dòng gen 44 3.3.1.1 Nhân dòng cADN sử dụng kĩ thuật PCR 44 3.3.1.2 Chuyển gen GmMSRA6 vào vector pKS 45 3.3.1.3 Chuyển gen vào vector đặc hiệu nấm men p425 47 3.3.2 Kết thử nghiệm in vivo hoạt tính xúc tác phản ứng chuyển hóa MetO thành Met GmMSRA 49 3.3.3 Kết đánh giá khả kháng lại tác nhân oxi hóa chủng nấm men mang vector biểu gen mã hóa cho MSRA 50 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME GmMSRA THƠNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN CÂY MƠ HÌNH ARABIDOPSIS THALIANA 52 3.4.1 Kết tạo mơ hình A thaliana siêu biểu gen mã hóa cho enzyme MSR phương pháp nhúng hoa 52 3.4.2 Kết tách chiết ADN tổng số chuyển gen 54 3.4.3 Kết PCR mẫu ADN tổng số chuyển gen nhằm phát có mặt gen chuyển 55 3.4.4 Xác định biểu gen chuyển RT-PCR 56 3.4.5 Kết xác định tỷ lệ đồng hợp/dị hợp dòng chuyển gen hệ F3 57 Gần đây, công bố Le cs (2013), nhóm nghiên cứu phân tích MSRB hệ gen đậu tương (GmMSRB) nhận thấy tồn gen MSRB hệ gen đậu tương bao gồm: GmMSRB1 cặp gen gen lặp lại bao gồm GmMSRB2 GmMSRB5, GmMSRB3 GmMSRB4 Trong đó, GmMRSB1, GmMSRB2 GmMSRB4 có hoạt tính khử MetO dạng liên kết phân tử protein Đáng ý GmMSRB2 (Cys121 xúc tác Cys68 tái tạo) có hoạt tính enzyme Met-R-O dạng tự tương tự enzyme fRMSR vi khuẩn E coli Đây coi hoạt tính nhóm enzyme MSRB thực vật Khi siêu biểu GmMSRB chủng nấm men bị bất hoạt đồng thời gen mã hóa MSR (MSRA/MSRB/fRMSR), ghi nhận GmMSRB2 GmMSRB4 có khả bảo vệ tế bào điều kiện oxi hóa gây H2O2 Nghiên cứu rằng: trái ngược với nhóm động vật có vú khử Met-R-O dạng tự do, thực vật phát triển MSRB có khả khử đồng thời MetO dạng tự dạng liên kết protein tương tự vi khuẩn, phản ánh mức độ đa dạng loại protein MSRB thực vật [35] Chúng ta biết, Việt Nam quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề biến đổi khí hậu tồn cầu, với nơng nghiệp lợi to lớn, điều kiện ngoại cảnh bất lợi có tác hại lớn đến sinh trưởng phát triển thực vật Việc cải thiện phát triển giống trồng có khả chống chịu cao, sức đề kháng tốt giữ vai trò đặc biệt quan trọng việc nâng cao suất, chất lượng giống, đảm bảo an ninh lương thực quốc gia góp phần tích cực xuất Ở nước ta nay, cơng bố tính chống chịu bất lợi mơi trường thực vật nói chung đậu tương nói riêng thường tập trung vào gen chịu mặn – Saltol, gen chịu ngập úng – Sub1, gen chịu lạnh – COR, chưa có cơng trình nghiên cứu oxi hóa Met vai trò enzyme MSR Do đó, nghiên cứu này, chúng tơi bước phân tích đặc tính chức MSRA phân lập từ hệ gen đậu tương, từ đưa nhận định vai trò MSRA việc đáp ứng với điều kiện môi trường bất lợi, tạo tiền đề phát triển số giống trồng nông nghiệp tương lai 67 Sử dụng công cụ phân tích tin sinh học, chúng tơi xác định gen mã hóa cho MSRA hệ gen đậu tương bao gồm GmMSRA3 ba cặp gen gen lặp lại (các gen hình thành tượng nhân đôi hệ gen) GmMSRA1 GmMSRA6, GmMSRA2 GmMSRA5, GmMSRA4 GmMSRA7 Các GmMSRA chứa domain đặc trưng cho protein MSRA, cấu trúc gen có xen kẽ đoạn exon intron Các protein GmMSRA sinh tổng hợp tế bào chất vận chuyển đến vị trí tế bào để thực chức Tuy nhiên, ghi nhận GmMSRA2 GmMSRA5 khả cao tiết lục lạp có thực chức xúc tác Trong trình tự chuỗi peptide mã hóa cho GmMSRA, chúng tơi dự đốn có 5/7 GmMSRA có chứa Cys liên quan đến hoạt tính enzyme (Cys xúc tác Cys tái tạo), riêng với GmMSRA1 GmMSRA6 vị trí Cys xúc tác thay Ser, Cys tái tạo thay axit amin khác, nhiều khả enzyme khơng có hoạt tính khử MetO Dựa số sở liệu có sẵn (Libault cs [37], Genevestigator®) chúng tơi đánh giá mức độ biểu GmMSRA mô quan khác điều kiện sinh trưởng bình thường bất lợi Kết phân tích cho thấy: GmMSRA3 có mức độ biểu cao mô phân lập từ phận rễ (tế bào lông hút, đầu mút, nốt sần), tương tự GmMSRA2 GmMSRA5, GmMSRA lại có tương đồng mức độ biểu dù phân lập từ mơ khác (Hình 3.4) Trong tồn chu trình phát triển bình thường cây, mức độ biểu GmMSRA1 GmMSRA3 trì mức cao, đáng ý vai trò GmMSRA6 tăng cường nhanh chóng trì mức cao bước vào thời kì tăng trưởng mạnh (Hình 3.5) Các gen GmMSRA2, GmMSRA4, GmMSRA5 GmMSRA7 có khả gia tăng sức đề kháng đậu tương điều kiện bất lợi (khơ hạn) (Hình 3.6) Như vây, tùy thuộc vào loại mô, thời gian điều kiện sinh trưởng mà mức độ phiên mã GmMSRA có thay đổi định để đáp ứng với yêu cầu tế bào 68 Để nghiên cứu chức MSRA, chúng tơi lựa chọn tách dòng số GmMSRA (A3 A6) để siêu biểu gen chủng nấm men bị bất hoạt đồng thời gen mã hóa MSR (MSRA/MSRB/fRMSR) Kết thu thử nghiệm khả xúc tác phản ứng khử MetO Met chứng minh GmMSRA3 có hoạt tính xúc tác GmMSRA6 khơng có hoạt tính Điều phù hợp với tính tốn tin sinh học chúng tơi trình bày trên, trình tự chuỗi polipeptide mã hóa cho GmMSRA6 thiếu Cys thường thấy nằm trung tâm hoạt động MSRA (Hình 3.1) Tiếp tục thử nghiệm dòng tế bào nấm men điều kiện có tác nhân gây oxi hóa H2O2 việc siêu biểu GmMSRA6 làm tế bào nhạy cảm với H2O2 hơn, GmMSRA3 có khả trì khả sinh trưởng tế bào tốt Để có thêm liệu thực nghiệm cho việc đánh giá vai trò GmMSRA thực vật, tiếp tục tách dòng siêu biểu GmMSRA6 mơ hình Arabidopsis thaliana Việc siêu biểu gen khơng làm ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng điều kiện bình thường lại gia tăng mức độ nhạy cảm điều kiện nồng độ muối cao (NaCl) Như vậy, hai mơ hình sinh vật biểu nấm men A thaliana ghi nhận kết tương tự Chúng đặt giả thuyết cạnh tranh chất enzyme để giải thích cho kết sau: Khi siêu biểu hiện, GmMSRA6 tăng cường tổng hợp mức cao tế bào Trong điều kiện bất lợi (có tác nhân oxi hóa H2O2, nồng độ muối cao) tương tác enzyme GmMSRA6 với chất (các phân tử protein có Met bị oxi hóa thành MetO) xảy hướng sau: − Ở A thaliana: xảy cạnh tranh chất MSRA6 với MSRA có hoạt tính sửa chữa Do hàm lượng sinh tổng hợp tế bào cao MSRA khác, MSRA6 có “cơ hội” cao bám vào chất, lại khơng có hoạt tính xúc tác, MSRA khác khơng có điều kiện tương tác với chất để sửa chữa Met bị oxi hóa 69 − Ở nấm men: trường hợp tất MSR bị bất hoạt, MSRA6 tương tác với chất hoạt tính sửa chữa nên việc MSRA6 bám protein lại trở thành yếu tố kìm hãm hoạt động protein (các protein thực phần chức sinh học dù có chứa Met bị oxi hóa) Trong thử nghiệm, siêu biểu gen GmMSRA6 kìm hãm hoạt tính sửa chữa MSRA, ức chế hoạt động protein, chức protein khơng phục hồi protein thực chức năng, làm ảnh hưởng đến sức đề kháng tế bào điều kiện bất lợi Như vậy, từ phân tích tin sinh học thực nghiệm, chúng tơi xây dựng hiểu biết đặc tính vai trò số GmMSRA tế bào thực vật Một câu hỏi thú vị đặt sau kết phân tích có là: Tại GmMSRA6 khơng có hoạt tính xúc tác đặc trưng họ enzyme MSR mà gen trì hệ gen đậu tương? Liệu GmMSRA6 có vai trò quan trọng cần thêm nghiên cứu tiếp sau trước khẳng định cách chắn gen có hay không thực chức cần thiết cho sinh trưởng tế bào 70 KẾT LUẬN Từ kết phân tích thu chúng tơi rút số kết luận sau: Trong hệ gen đậu tương có gen mã hóa cho enzyme MSRA (GmMSRA) bao gồm GmMSRA3 ba cặp gen gen lặp lại GmMSRA1 GmMSRA6, GmMSRA2 GmMSRA5, GmMSRA4 GmMSRA7 Có tổng số gen GmMSRA có chứa Cys liên quan đến hoạt tính xúc tác enzyme Tùy thuộc vào loại mô, thời gian điều kiện sinh trưởng mà mức độ phiên mã GmMSRA có thay đổi định để đáp ứng với yêu cầu tế bào GmMSRA3 có mức độ biểu cao mô phân lập từ phận rễ GmMSRA1 GmMSRA3 ln trì mức độ biểu cao tồn chu trình phát triển bình thường Các gen GmMSRA2, GmMSRA4, GmMSRA5 GmMSRA7 có khả liên quan đến việc đề kháng đậu tương điều kiện bất lợi (khô hạn) Nghiên cứu in vivo GmMSRA dòng tế bào nấm men cho thấy GmMSRA3 có hoạt tính xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phân tử MetO thành Met, qua hỗ trợ sinh trưởng cho bảo vệ tế bào khỏi tổn thương gây tác nhân oxi hóa (H2O2) GmMSRA6 khơng có chức Tách dòng siêu biểu gen GmMSRA6 mơ hình Arabidopsis thaliana tạo dòng chuyển gen sinh trưởng tốt điều kiện thí nghiệm có đáp ứng (nhạy cảm hơn) với nồng độ muối cao (NaCl) 71 KIẾN NGHỊ Từ q trình nghiên cứu thực tế, chúng tơi đưa số kiến nghị sau: Mở rộng nghiên cứu mặt tin sinh học MSR nông nghiệp quan trọng khác lúa gạo, ngô sắn Tách dòng GmMSRA lại để xác định đặc tính thơng qua biểu nấm men S cerevisiae, từ chọn lựa thêm GmMSRA siêu biểu mơ hình A thaliana đánh giá khả kháng số điều kiện bất lợi nồng độ muối cao (NaCl), thuốc diệt cỏ paraquat, ion kim loại nặng (Cd 2+) chuyển gen 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phạm Thị Hoa (2011), Đánh giá đa hình di truyền nguồn gen chịu hạn phục vụ công tác lập đồ QTL số giống lúa địa phương Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học - Đại học Bách Khoa Hà Nội Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Thúy Điệp, Kiều Thị Dung, Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Thị Thanh Thủy (2013), “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn Việt Nam thị phân tử SSR”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn, Tập 1, trang 12 - 18 Tài liệu tiếng nước Achilli, C., Ciana, A., and Minetti, G (2015), “The discovery of methionine sulfoxide reductase enzymes: An historical account and future perspectives”, BioFactors 41(3), pp 135-152 Apel, K and Hirt, H (2004), “Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction”, Annual review of plant biology 55, pp 373-399 Arc, E., Sechet, J., Corbineau, F., Rajjou, L., and Marionpoll, A (2013), “ABA crosstalk with ethylene and nitric oxide in seed dormancy and germination”, Plant Cell Biology 4(63) Argueso, C.T., Hansen, M., and Kieber, J.J (2007), “Regulation of Ethylene Biosynthesis”, Journal of Plant Growth Regulation 26, pp 92-105 Barger, G and Coyne, F.P (1928), “The amino-acid methionine; constitution and synthesis”, The Biochemical journal 22(6), pp 1417-1425 73 Boschi-Muller, S., Olry, A., Antoine, M., and Branlant, G (2005), “The enzymology and biochemistry of methionine sulfoxide reductases”, Biochimica et biophysica acta 1703(2), pp 231-238 Brot, N and Weissbach, H (1983), “Biochemistry and physiological role of methionine sulfoxide residues in proteins”, Archives of biochemistry and biophysics 223(1), pp 271-281 10 Cabreiro, F., Perichon, M., Jatje, J., Malavolta, M., Mocchegiani, E., Friguet, B., and Petropoulos, I (2008), “Zinc supplementation in the elderly subjects: effect on oxidized protein degradation and repair systems in peripheral blood lymphocytes”, Experimental gerontology 43(5), pp 483-487 11 Caldwell, P., Luk, D.C., Weissbach, H., and Brot, N (1978), “Oxidation of the methionine residues of Escherichia coli ribosomal protein L12 decreases the protein's biological activity”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 75(11), pp 5349-5352 12 Carp, H and Janoff, A (1978), “Possible mechanisms of emphysema in smokers In vitro suppression of serum elastase-inhibitory capacity by fresh cigarette smoke and its prevention by antioxidants”, The American review of respiratory disease 118(3), pp 617-621 13 Ciorba, M.A., Heinemann, S.H., Weissbach, H., Brot, N., and Hoshi, T (1997), “Modulation of potassium channel function by methionine oxidation and reduction”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94(18), pp 9932-9937 14 Clark, R.A., Szot, S., Venkatasubramanian, K., and Schiffmann, E (1980), “Chemotactic factor inactivation by myeloperoxidase-mediated oxidation of methionine”, Journal of immunology 124(4), pp 2020-2026 15 Clough, S.J and Bent, A.F (1998), “Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”, The Plant journal : for cell and molecular biology 16(6), pp 735-743 74 16 Delaye, L., Becerra, A., Orgel, L., and Lazcano, A (2007), “Molecular evolution of peptide methionine sulfoxide reductases (MsrA and MsrB): on the early development of a mechanism that protects against oxidative damage”, Journal of molecular evolution 64(1), pp 15-32 17 Emanuelsson, O., Nielsen, H., Brunak, S., and Von Heijne, G (2000), “Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence”, Journal of molecular biology 300(4), pp 1005-1016 18 Erickson, J.R., Joiner, M.L., Guan, X., Kutschke, W., Yang, J., Oddis, C.V., Bartlett, R.K., Lowe, J.S., O'donnell, S.E., Aykin-Burns, N., Zimmerman, M.C., Zimmerman, K., Ham, A.J., Weiss, R.M., Spitz, D.R., Shea, M.A., Colbran, R.J., Mohler, P.J., and Anderson, M.E (2008), “A dynamic pathway for calcium-independent activation of CaMKII by methionine oxidation”, Cell 133(3), pp 462-474 19 Ezraty, B., Aussel, L., and Barras, F (2005), “Methionine sulfoxide reductases in prokaryotes”, Biochimica et biophysica acta 1703(2), pp 221229 20 Ferla, M.P and Patrick, W.M (2014), “Bacterial methionine biosynthesis”, Microbiology (160), pp 1571–1584 21 Gao, J., Yin, D.H., Yao, Y., Sun, H., Qin, Z., Schoneich, C., Williams, T.D., and Squier, T.C (1998), “Loss of conformational stability in calmodulin upon methionine oxidation”, Biophysical journal 74(3), pp 1115-1134 22 Glaser, C.B., Morser, J., Clarke, J.H., Blasko, E., Mclean, K., Kuhn, I., Chang, R.J., Lin, J.H., Vilander, L., Andrews, W.H., and Light, D.R (1992), “Oxidation of a specific methionine in thrombomodulin by activated neutrophil products blocks cofactor activity A potential rapid mechanism for modulation of coagulation”, The Journal of clinical investigation 90(6), pp 2565-2573 75 23 Guo, X., Wu, Y., Wang, Y., Chen, Y., and Chu, C (2009), “OsMSRA4.1 and OsMSRB1.1, two rice plastidial methionine sulfoxide reductases, are involved in abiotic stress responses”, Planta 230(1), pp 227-238 24 Hansel, A., Kuschel, L., Hehl, S., Lemke, C., Agricola, H.J., Hoshi, T., and Heinemann, S.H (2002), “Mitochondrial targeting of the human peptide methionine sulfoxide reductase (MSRA), an enzyme involved in the repair of oxidized proteins”, FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 16(8), pp 911-913 25 Hellens, R.P., Edwards, E.A., Leyland, N.R., Bean, S., and Mullineaux, P.M (2000), “pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacteriummediated plant transformation”, Plant molecular biology 42(6), pp 819-832 26 Hruz, T., Laule, O., Szabo, G., Wessendorp, F., Bleuler, S., Oertle, L., Widmayer, P., Gruissem, W., and Zimmermann, P (2008), “Genevestigator v3: a reference expression database for the meta-analysis of transcriptomes”, Advances in bioinformatics 2008, pp 420747 27 Imai, A., Matsuyama, T., Hanzawa, Y., Akiyama, T., Tamaoki, M., Saji, H., Shirano, Y., Kato, T., Hayashi, H., Shibata, D., Tabata, S., Komeda, Y., and Takahashi, T (2004), “Spermidine synthase genes are essential for survival of Arabidopsis”, Plant physiology 135(3), pp 1565-1573 28 Joo, J.H., Bae, Y.S., and Lee, J.S (2001), “Role of auxin-induced reactive oxygen species in root gravitropism”, Plant physiology 126(3), pp 10551060 29 Koc, A., Gasch, A.P., Rutherford, J.C., Kim, H.Y., and Gladyshev, V.N (2004), “Methionine sulfoxide reductase regulation of yeast lifespan reveals reactive oxygen species-dependent and -independent components of aging”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(21), pp 7999-8004 30 Laugier, E., Tarrago, L., Vieira Dos Santos, C., Eymery, F., Havaux, M., and Rey, P (2010), “Arabidopsis thaliana plastidial methionine sulfoxide 76 reductases B, MSRBs, account for most leaf peptide MSR activity and are essential for growth under environmental constraints through a role in the preservation of photosystem antennae”, The Plant journal : for cell and molecular biology 61(2), pp 271-282 31 Le Bras, M., Clement, M.V., Pervaiz, S., and Brenner, C (2005), “Reactive oxygen species and the mitochondrial signaling pathway of cell death”, Histology and histopathology 20(1), pp 205-219 32 Le, D.T., Lee, B.C., Marino, S.M., Zhang, Y., Fomenko, D.E., Kaya, A., Hacioglu, E., Kwak, G.H., Koc, A., Kim, H.Y., and Gladyshev, V.N (2009), “Functional analysis of free methionine-R-sulfoxide reductase from Saccharomyces cerevisiae”, The Journal of biological chemistry 284(7), pp 4354-4364 33 Le, D.T., Nishiyama, R., Watanabe, Y., Mochida, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., and Tran, L.S (2011), “Genome-wide expression profiling of soybean two-component system genes in soybean root and shoot tissues under dehydration stress”, DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 18(1), pp 17-29 34 Le, D.T., Nishiyama, R., Watanabe, Y., Tanaka, M., Seki, M., Ham Le, H., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., and Tran, L.S (2012), “Differential gene expression in soybean leaf tissues at late developmental stages under drought stress revealed by genome-wide transcriptome analysis”, PloS one 7(11), pp e49522 35 Le, D.T., Tarrago, L., Watanabe, Y., Kaya, A., Lee, B.C., Tran, U., Nishiyama, R., Fomenko, D.E., Gladyshev, V.N., and Tran, L.S (2013), “Diversity of plant methionine sulfoxide reductases B and evolution of a form specific for free methionine sulfoxide”, PloS one 8(6), pp e65637 36 Li, C.W., Lee, S.H., Chieh, P.S., Lin, C.S., Wang, Y.C., and Chan, M.T (2012), “Arabidopsis root-abundant cytosolic methionine sulfoxide reductase 77 B genes MsrB7 and MsrB8 are involved in tolerance to oxidative stress”, Plant & cell physiology 53(10), pp 1707-1719 37 Libault, M., Farmer, A., Joshi, T., Takahashi, K., Langley, R.J., Franklin, L.D., He, J., Xu, D., May, G., and Stacey, G (2010), “An integrated transcriptome atlas of the crop model Glycine max, and its use in comparative analyses in plants”, The Plant journal : for cell and molecular biology 63(1), pp 86-99 38 Moskovitz, J., Flescher, E., Berlett, B.S., Azare, J., Poston, J.M., and Stadtman, E.R (1998), “Overexpression of peptide-methionine sulfoxide reductase in Saccharomyces cerevisiae and human T cells provides them with high resistance to oxidative stress”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(24), pp 1407114075 39 Mumberg, D., Muller, R., and Funk, M (1995), “Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds”, Gene 156(1), pp 119-122 40 Oh, S.K., Baek, K.H., Seong, E.S., Joung, Y.H., Choi, G.J., Park, J.M., Cho, H.S., Kim, E.A., Lee, S., and Choi, D (2010), “CaMsrB2, pepper methionine sulfoxide reductase B2, is a novel defense regulator against oxidative stress and pathogen attack”, Plant physiology 154(1), pp 245-261 41 Pei, Z.M., Murata, Y., Benning, G., Thomine, S., Klusener, B., Allen, G.J., Grill, E., and Schroeder, J.I (2000), “Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells”, Nature 406(6797), pp 731-734 42 Picot, C.R., Perichon, M., Cintrat, J.C., Friguet, B., and Petropoulos, I (2004), “The peptide methionine sulfoxide reductases, MsrA and MsrB (hCBS-1), are downregulated during replicative senescence of human WI-38 fibroblasts”, FEBS letters 558(1-3), pp 74-78 78 43 Pitzschke, A., Forzani, C., and Hirt, H (2006), “Reactive oxygen species signaling in plants”, Antioxidants & redox signaling 8(9-10), pp 1757-1764 44 Roje, S (2006), “S-Adenosyl-L-methionine: beyond the universal methyl group donor”, Phytochemistry 67(15), pp 1686-1698 45 Romero, H.M., Berlett, B.S., Jensen, P.J., Pell, E.J., and Tien, M (2004), “Investigations into the role of the plastidial peptide methionine sulfoxide reductase in response to oxidative stress in Arabidopsis”, Plant physiology 136, pp 3784-3794 46 Rouhier, N., Vieira Dos Santos, C., Tarrago, L., and Rey, P (2006), “Plant methionine sulfoxide reductase A and B multigenic families”, Photosynthesis research 89(2-3), pp 247-262 47 Rouhier, N., Kauffmann, B., Tete-Favier, F., Palladino, P., Gans, P., Branlant, G., Jacquot, J.P., and Boschi-Muller, S (2007), “Functional and structural aspects of poplar cytosolic and plastidial type a methionine sulfoxide reductases”, The Journal of biological chemistry 282(5), pp 33673378 48 Ruan, H., Tang, X.D., Chen, M.L., Joiner, M.L., Sun, G., Brot, N., Weissbach, H., Heinemann, S.H., Iverson, L., Wu, C.F., and Hoshi, T (2002), “High-quality life extension by the enzyme peptide methionine sulfoxide reductase”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99(5), pp 2748-2753 49 Sanchez, J., Nikolau, B.J., and Stumpf, P.K (1983), “Reduction of N-acetyl methionine sulfoxide in plants”, Plant physiology 73(3), pp 619-623 50 Seilheimer, B., Bohrmann, B., Bondolfi, L., Muller, F., Stuber, D., and Dobeli, H (1997), “The toxicity of the Alzheimer's beta-amyloid peptide correlates with a distinct fiber morphology”, Journal of structural biology 119(1), pp 59-71 51 Snijder, J., Rose, R.J., Raijmakers, R., and Heck, A.J (2011), “Site-specific methionine oxidation in calmodulin affects structural integrity and 79 interaction with Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II”, Journal of structural biology 174(1), pp 187-195 52 Stadtman, E.R (1993), “Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reactions”, Annual review of biochemistry 62, pp 797-821 53 Takahashi, F., Mizoguchi, T., Yoshida, R., Ichimura, K., and Shinozaki, K (2011), “Calmodulin-dependent activation of MAP kinase for ROS homeostasis in Arabidopsis”, Molecular cell 41(6), pp 649-660 54 Tang, H., Bowers, J.E., Wang, X., Ming, R., Alam, M., and Paterson, A.H (2008), “Synteny and collinearity in plant genomes”, Science 320(5875), pp 486-488 55 Tarrago, L., Laugier, E., and Rey, P (2009), “Protein-repairing methionine sulfoxide reductases in photosynthetic organisms: gene organization, reduction mechanisms, and physiological roles”, Molecular plant 2(2), pp 202-217 56 Textor, S., Bartram, S., Kroymann, J., Falk, K.L., Hick, A., Pickett, J.A., and Gershenzon, J (2004), “Biosynthesis of methionine-derived glucosinolates in Arabidopsis thaliana: recombinant expression and characterization of methylthioalkylmalate synthase, the condensing enzyme of the chainelongation cycle”, Planta 218(6), pp 1026-1035 57 Vogt, W (1995), “Oxidation of methionyl residues in proteins: tools, targets, and reversal”, Free radical biology & medicine 18(1), pp 93-105 58 Weissbach, H., Resnick, L., and Brot, N (2005), “Methionine sulfoxide reductases: history and cellular role in protecting against oxidative damage”, Biochimica et biophysica acta 1703(2), pp 203-212 59 Wolff, J., Cook, G.H., Goldhammer, A.R., and Berkowitz, S.A (1980), “Calmodulin activates prokaryotic adenylate cyclase”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77(7), pp 3841-3844 80 60 Yang, S.F and Hoffman, N.E (1984), “Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants”, Annual Review of Plant Physiology 35, pp 155 – 189 81 ... - NGUYỄN THỊ KIM LIÊN PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TỪ HỆ GEN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN... bất lợi môi trường Xuất phát từ lý trên, lựa chọn đề tài nghiên cứu: Phân tích đặc tính gen mã hóa enzyme methionine sulfoxide reductase từ hệ gen đậu tương (Glycine max) Đề tài nghiên cứu nằm... KẾT QUẢ TÌM KIẾM VÀ PHÂN TÍCH CÁC GEN MÃ HĨA CHO ENZYME MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG 34 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN MÃ HÓA MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG 41 3.2.1