Giảng viên: Ngô Thị Hương Bộ môn: Dị ứng – Miễn dịch lâm sàng Đại học Y Hà Nội  Hiểu nguyên lý xét nghiệm dị ứng miễn dịch  Nêu định, chống định xét nghiệm  Biết cách thực số xét nghiệm  Tổng quan bệnh dị ứng  Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh dị ứng  Tổng quan bệnh tự miễn  Xét nghiệm phát tự kháng thể bệnh tự miễn    Dị ứng phản ứng mẫn gây hệ thống miễn dịch Dị ứng quy định kháng thể thông qua chế tế bào Dị ứng biểu nhiều tình trạng khác như: mày đay, phù mạch, viêm mũi dị ứng, hen phế quản, bệnh huyết thanh, viêm mạch dị ứng, viêm da atopy, viêm da tiếp xúc… Với nguyên nhân liên quan đến thuốc, thức ăn Phản ứng dị ứng xảy tất quan thường gặp da màng nhầy chúng hàng rào ngăn cách quan bên thể với môi trường bên Theo phân loại Gell Coombs dị ứng chia làm typ       Type I: kháng thể kết hợp với kháng nguyên để giải phóng chất hoạt hóa sinh lý Type II: kháng thể tự kết hợp với kháng nguyên bề mặt tế bào Type III: kháng thể kết hợp với kháng nguyên hòa tan để tạo thành phức hợp lắng đọng mô Type IV: mẫn tế bào T chịu trách nhiệm cho việc biểu triệu chứng dị ứng Typ I,II III quy định kháng thể, chúng gọi dị ứng nhanh Typ IV quy định tế bào, gọi dị ứng muộn Trung gian miễn dịch Liên quan bổ thể Cơ chế miễn dịch Ví dụ Typ I IgE Typ II IgG IgM Typ III IgG IgM Typ IV T cell Khơng Có Có Khơng Giải phóng chất trung gian từ tế bào Mast bạch cầu Kháng thể bổ thể gây ly giải tế bào Lắng đọng phức hợp kháng nguyên - kháng thể Giải phóng cytokines Sốc phản vệ, dị ứng thức ăn, hen… Tai biến truyền Bệnh huyết Viêm da tiếp xúc, máu, thiếu máu thanh, Lupus ban test lao, viêm tan máu tự đỏ hệ thống phổi kẽ miễn Tế bào Mast - Cư trú hầu hết mô, thường gần với biểu mô bề mặt (da, hệ thống hơ hấp đường tiêu hóa) - Tiền thân tạo tủy xương, lưu hành máu sau thâm nhập vào mơ nơi chúng trưởng thành hồn tồn - Vai trò việc tăng chống lại nọc độc động vật giúp thể vật chủ chống lại số ký sinh trùng định - Vai trò bệnh lý: + Là nơi tập trung chủ yếu Histamine chất trung gian (mediator) tham gia vào phản ứng dị ứng sốc phản vệ + Được hoạt hóa nhanh chóng (trong vòng vài phút) để giải phóng histamine hóa chất trung gian kháng nguyên nhận biết kháng thể IgE gắn bề mặt tế bào thông qua IgE receptor (FcεRI)  Mediator Ảnh hưởng sinh học Histamine - Tăng tính thấm thành mạch gây giãn mạch Gây co trơn đường thở Gây đau ngứa Ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch chức số tế bào thần kinh Proteases (Tryptase, chymase, carboxypeptidase…) - Phân hủy số protein peptides, bao gồm chất có nọc độc động vật Quy định trình tái tạo mô Lipid mediators ( Leukotrienes, prosta glandins) - - Cytokines, chemokines, Peptide growth factor - Quy định trình di chuyển chức bạch cầu Tăng tính thấm thành mạch Tác động đến co thắt giãn nở mạch máu ( phụ thuộc vào loại chất trung gian) Co giãn trơn ( đường thở, dày ruột) Tăng tiết chất nhầy Có nhiều ảnh hưởng lên bạch cầu tế bào cấu tạo mô dẫn đến tăng cường ức chế q trình viêm tái tạo mơ  Test lẩy da (Skin prick test)  Test nội bì (Intradermal test)  Specific IgE quantification  Tryptase quantification  Patch test  Lymphocyte transformation test Immediate reaction test Delayed reaction test 10 Phân loại chất kích thích:  Đặc hiệu: Kháng nguyên, thuốc, thức ăn  Không đặc hiệu: Metacholine, Histamine, Leukotrienes, khơng khí lạnh, serotonin, prostaglandin   Kích thích trực tiếp: gây hạn chế luồng khơng khí tác động trực tiếp lên tế bào cảm ứng (ví dụ, tế bào trơn đường hơ hấp, tế bào sản xuất chất nhờn) Ví dụ: Acetycholine, Methacholine, Histamine, Prostaglandin D2, Leukotrienes Kích thích gián tiếp: gây hạn chế luồng khơng khí tác động lên tế bào khác tế bào cảm ứng, sau tương tác với tế bào cảm ứng Ví dụ: Adenosine, Mannitol , Propanolol (β-blockers) 53 Test kích thích phế quản Methacholine: ◦ Tổng quan:  Methacholine có nguồn gốc từ acetylcholine tổng hợp, huyển hóa esterase choline Tác dụng bị chặn atropin thuốc kháng cholinergic khác  Methacholine đươc sử dụng rộng rãi, có tiêu chuẩn tốt, dễ tổng hợp phân biệt dễ dàng phản ứng với không phản ứng đường hô hấp ◦ Chuẩn bị bệnh nhân:  Ngừng sử dụng thuốc ảnh hưởng đến test  Giải thích test  Nên tránh lúc bệnh nhân bị hen  Chuẩn bị form  Tránh dùng cà phê, trà, nước uống có ga ngày làm test ◦ Chuẩn bị methacholine: 54 55 PC20FEV : Nồng độ methacholine gây giảm 20% FEV PC20 (mg/mL) Giải thích >16 BHR bình thường 4.0 - 16 Ranh giới BHR 1.0 – 4.0 BHR nhẹ < 1.0 BHR trung bình đến nặng 56 57 58  Bệnh tự miễn bệnh hệ miễn dịch bị sai sót q trình nhận biết mơ thể bình thường phá hủy chúng thể chúng chất ngoại lai công tác nhân bên  Nguyên nhân bệnh tự miễn chưa giải thích rõ theo số nghiên cứu cho bệnh tự miễn khởi phát tiếp xúc với vi sinh vật yếu tố môi trường khác đặc biệt biến đổi gen  Bệnh tự miễn ảnh hưởng đến nhiều quan 59 Tự kháng thể Anti- DsDNA Anti –SSA/ Ro Kháng thể kháng nhân (ANA) Anti – SSB/La Anti – Centromere Anti – Jo1 Anti - RNP Anti - Smith (Sm) Anti – Scl 70 Anti - Histone Anti - CCP Bệnh thường gặp SLE SLE, Block tim bẩm sinh, Hội chứng Sjogren nguyên phát Hội chứng Sjogren nguyên phát Hội chứng CREST Viêm da Bệnh mô liên kết hỗn hợp SLE Xơ cứng bì SLE, lupus thuốc Viêm khớp dạng thấp Anti – neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) (Kháng thể kháng Viêm mạch hệ thống tương bào bạch cầu đa nhân trung tính) Anti-mitochondrial antibody (AMAM2) (kháng thể kháng ty lạp thể) Xơ gan mật nguyên phát Anti- Smooth muscle antibody (kháng thể kháng trơn) Anti-Liver Kidney Microsomal Antibodies (LKM) (Kháng thể kháng tiểu thể gan thận) Viêm gan tự miễn Anit – Liver Cytosol (LC) Kháng thể kháng tương bào gan Anti – Cardiolipin antibody Anti – β2 Glycoprotein antibody Hội chứng kháng Phospholipid  Hiện có số xét nghiệm phòng thí nghiệm để phát tự kháng thể ANA phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IF) phương pháp miễn dịch gắn enzyme (ELISA) Trong IF xem tiêu chuẩn vàng để phát tự kháng thể ELISA lại sử dụng rổng rãi cách thực đơn giản thuận tiện thích hợp với việc thực thường quy  Một số phương pháp khác flowcytometry cơng nghệ nano giai đoạn thử nghiệm 61       Nguyên lý: Hỗn hợp kháng nguyên gắn vào đáy microwell Kháng thể có huyết bệnh nhân gắn vào kháng nguyên tương ứng Một enzyme (Horseradish peroxidase HRP) gắn với kháng thể kháng – kháng thể người tạo thành phức hợp Kháng nguyên – kháng thể - kháng kháng thể - enzyme Một chất thêm vào enzyme có mặt phức hợp thủy phân tạo thành chất có màu xanh da trời Một acid để dừng phản ứng thêm vào biến dung dịch màu thành màu vàng Mật độ quang học dung dịch màu vàng đo 450 nm Cường độ quang học màu trực tiếp nồng độ kháng thể có mặt huyết ban đầu 62 Cách thực hiện: 63  - - - Nguyên lý: Có phiến đồ phủ tế bào thẩm thấu cố định ( từ nhà sản xuất) sau huyết bệnh nhân thêm vào phiến đồ ủ thời gian rửa Nếu bệnh nhân có tự kháng thể, chúng gắn vào phiến đồ Sau đó, kháng thể thứ hai gắn huỳnh quang (từ nhà sản xuất) đượ thêm vào ủ rửa kháng thể không gắn Các tự kháng thể quan sát kính hiển vi huỳnh quang 64 ANA pattern Antigen Associated diseases Speckled ENA, RNP, Sm, SSA/Ro, SSB/La, Scl70, Jo-1, ribosomal-P SLE, Mixed CTD, SS, Primary Sjogren's syndrome, PM Homogenous dsDNA, Histones SLE, Drug induced SLE Peripheral (rim) RNP, Sm, SSA/Ro SLE, SS Nucleolar Anti-PM-Scl, antiRNA polymerase I-III, anti-U3-RNP, To RNP SS, PM Centromere CENP A-E Limited SS 65  Độ nhạy Độ đặc hiệu ELISA 90 – 97% 36 – 94% IF 80% 99% ELISA phát ANA có độ nhạy tốt độ đặc hiệu tốt, cho thấy ELISA thử nghiệm hiệu tiết kiệm chi phí thay IFA sàng lọc ban đầu ANA Copple SS, Sawitzke AD, Wilson AM, Tebo AE, Hill HR Enzyme-linked immunosorbent assay screening then indirect immunofluorescence confirmation of antinuclear antibodies: a statistical analysis Am J Clin Pathol 2011 May 66 67 ... động vật Quy định trình tái tạo mô Lipid mediators ( Leukotrienes, prosta glandins) - - Cytokines, chemokines, Peptide growth factor - Quy định trình di chuyển chức bạch cầu Tăng tính thấm thành... mạn tính suy thận, ung thư… 12          ◦ Chuẩn bị: Histamine dihydrochloride (10mg/ml 0.1%) dùng làm chứng dương Dung dịch pha loãng dị nguyên dùng làm chứng âm ◦ Quy trình: Sát trùng... số ký sinh trùng định - Vai trò bệnh lý: + Là nơi tập trung chủ yếu Histamine chất trung gian (mediator) tham gia vào phản ứng dị ứng sốc phản vệ + Được hoạt hóa nhanh chóng (trong vòng vài phút)