CHUYÊN ĐỀ: CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP VÀ BÀI TẬP PHẦN I: MỞ ĐẦU Dựa hai tảng sinh hóa học di truyền học, phát triển nhanh chóng cơng nghệ đại, sinh học phân tử đời tác động toàn diện tới nhiều ngành khoa học đời sống người Sinh học phân tử khơng góp phần giúp ta giải thích tượng sống thơng qua phân tử cấu tạo thể sống mà ảnh hưởng ngày sâu rộng tới nhiều lĩnh vực y học, nông nghiệp, pháp lý Trong nghiên cứu sinh học phân tử, thực nghiệm thao tác với ADN mà công nghệ ADN tái tổ hợp giữ vai trò cốt lõi Cơng nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm việc thao tác vật liệu di truyền phân tử ADN, nhằm nghiên cứu sống mức độ phân tử cách định hướng xác định CNSH mà đỉnh cao kỹ thuật tái tổ hợp ADN ngày có ý nghĩa to lớn đời sống người, tạo điều mà trước tưởng chừng không làm Trong chương trình sinh học phổ thơng, số tiết cơng nghệ gen hạn chế, kiến thức giáo khoa sơ sài, chưa sâu khai thác chất vấn đề, câu hỏi mức đơn giản tập gần khơng có tài liệu đề cập nên học sinh thường gặp lung túng học ôn luyện Xuất phát từ thực tế lựa chọn chuyên đề: “Công nghệ AND tái tổ hợp tập” Tuy nhiên thời gian soạn thảo ngắn, trình độ hạn chế chuyên đề không tránh khỏi sai sót, chúng tơi mong nhân đóng góp nhiệt tình thầy giáo bạn đồng nghiệp để chuyên đề hoàn thiện PHẦN II: NỘI DUNG A LÝ THUYẾT CƠ BẢN Một số khái niệm: - ADN tái tổ hợp: Là phân tử ADN nhỏ ráp láp từ đoạn ADN lấy từ tế bào khác (thể truyền gen cần chuyển) mà thể truyền phân tử ADN nhỏ có khả nhân đơi cách độc lập hệ gen tế bào gắn vào hệ gen tế bào - Cơng nghệ di truyền: gọi công nghệ gen hay kỹ thuật tái tổ hợp ADN, thực việc chuyển gen để tạo tế bào mang gen nhằm tạo vật chất cần thiết - Kĩ thuật di truyền: Kĩ thuật di truyền kĩ thuật thao tác vật liệu di truyền dựa vào hiểu biết cấu trúc hoá học axit nuclêic di truyền vi sinh vật KTDT sử dụng phổ biến kĩ thuật cấy gen, tức chuyển đoạn ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận cách dùng thể truyền Thể truyền có nhiều loại: plasmid, thể thực khuẩn, nấm men, Kĩ thuật cấy gen plasmid có khâu chủ yếu: + Tách ADN nhiễm sắc thể tế bào cho tách plasmit khỏi tế bào + Cắt nối đoạn ADN tế bào cho vào ADN plasmit điểm xác định, tạo nên ADN tái tổ hợp Thao tác cắt tách đoạn ADN thực nhờ enzim cắt (restrictaza) Các phân tử enzim nhận cắt đứt ADN nuclêôtit xác định nhờ người ta tách gen mã hố prơtêin định Việc cắt đứt ADN vòng plasmit thực enzim cắt việc ghép đoạn ADN tế bào cho vào ADN plasmit enzim nối (ligaza) đảm nhiệm + Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận, tạo điều kiện cho gen ghép biểu Plasmit mang ADN tái tổ hợp chuyển vào tế bào nhận nhiều phương pháp khác Vào tế bào nhận, tự nhân đơi, truyền qua hệ tế bào sau qua chế phân bào tổng hợp loại prơtêin mã hố đoạn ADN ghép Tế bào nhận dùng phổ biến vi khuẩn đường ruột E.Coli Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi Sau 12 giờ, tế bào ban đầu sinh 16 triệu tế bào, qua plasmit chúng nhân lên nhanh sản xuất lượng lớn chất tương ứng với gen ghép vào plasmit Trong kĩ thuật cấy gen người ta dùng thể thực khuẩn làm thể truyền Nó gắn đoạn ADN tế bào cho vào ADN xâm nhập vào tế bào nhận đem theo đoạn ADN vào Kỹ thuật ADN tái tổ hợp: ADN tái tổ hợp hình thành cắt đoạn ADN đưa vào phân tử ADN có khả tái (như plasmid vi khuẩn) gọi vector tạo dòng, từ nhân lên (khuyếch đại), tạo plasmid thực nhờ enzim giới hạn có khả cắt ADN vị trí đặc hiệu, tạo đoạn ADN xác định với dầu phù hợp cho việc gắn vào vector mở vòng enzim mở Các phân tử ADN tái tổ hợp làm thay đổi mức độ biểu bình thường gen (chẳng hạn việc dung hợp trình tự mã hóa lồi với trình tự promoter lồi khác) chí mã hóa tổng hợp loại protein “dung hợp” (protein lai) mang trình tự axit amin từ protein có nguồn gốc khác Hiện nay, kỹ thuật tách dòng phân tử (bao gồm PCR) trở thành công cụ thiết yếu nghiên cứu điều hòa biểu gen hệ gen loài sinh vật khác Q trình tách dòng ADN tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp điển hình thường liên quan đến việc sử dụng véctơ trình tự mang thơng tin điều khiển hoạt động nhân lên (khuếch đại) và/hoặc biểu tế bào phân tử ADN tái tổ hợp mang đoạn ADN cài (đoạn trình tự phân lập) bao gồm trình tự gen quan tâm nghiên cứu Các “công cụ” để tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp enzym giới hạn giúp cắt phân tử ADN vị trí xác định enzym nối cho phép ghép nối phân đoạn ADN có nguồn gốc khác với Bằng việc tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp tự nhận lên tế bào chủ, đoạn ADN cài xác định phân lập, tinh nhân lên thành số lượng lớn Sử dụng enzym giới hạn phân tích ADN Hầu hết phân tử ADN tự nhiên lớn nhiều so với kích thước thao tác phân tích cách thuận lợi phòng thí nghiệm Trong tế bào, phần lớn nhiễm sắc thể thường phân tử ADN dài chứa hàng trăm trí hàng nghìn gen khác Vì vậy, để phân lập phân tích gen, người ta phải cắt phân tử ADN kích thước lớn thành phân đoạn nhỏ Cơng việc thực nhóm enzym đặc biệt gọi enzym giới hạn Tất enzym giới hạn có hai đặc tính: a) nhận biết trình tự đặc hiệu phân tử ADN (gọi trình tự giới hạn); b) cắt bên phân tử ADN vị trí đặc hiệu (hoặc vị trí giới hạn; cách vị trí giới hạn số nucleotit định) Trong nhóm enzym giới hạn, nhóm thường dùng nghiên cứu di truyền phân tử kỹ nghệ gen nhóm nhờ vị trí trình tự cắt chúng xác định rõ Vì đề cập đến việc ứng dụng nhóm enzym giới hạn Các trình tự giới hạn enzym nhóm thường gồm - bp, thơng thường có tính đối xứng vị trí cắt thường nằm trình tự giới hạn Ví dụ enzym giới hạn coR tìm thấy vi khuẩn E coli có trình tự giới hạn 5’-GAATTC- 3’ với vị trí cắt G A Tên enzym gồm ký tự đầu tên loài vi khuẩn mà từ enzym tìm thấy (Eco = Escherichia coli), ký tự sau tên chủng vi khuẩn số thứ tự enzym tìm thấy lồi vi khuẩn (EcoRI enzym giới hạn tìm thấy E coli) Một enzym giới hạn có trình tự giới hạn gồm bp giống EcoRI thơng thường trơng đợi có trung bình vị trí cắt đoạn trình tự có kích thước khoảng kb (bởi theo nguyên tắc xác suất vị trí định xác suất để có loại nucleotit định 1/4, xác suất để có trình tự định gồm bp 1/46 = 1/4096) Giả sử có phân tử ADN mạch thẳng có vị trí cắt enzym EcoRI Việc cắt phân tử ADN EcoRI cho phân đoạn ADN khác Do đó, điện di gel sản phẩm cắt, phân đoạn ADN phân tách chúng khác khối lượng (vì chúng khác thành phần trình tự nucleotit) Như vậy, phân đoạn ADN tương ứng với vùng phân tử ADN ban đầu Việc sử dụng enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII có trình tự giới hạn gồm bp, có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT- 3’) cho sản phẩm cắt khác với sử dụng EcoRI (với phân tử ADN ban đầu) Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn tạo kiểu hình phổ điện di phân đoạn cắt giới hạn đặc thù gen phân tích Đối với số enzym giới hạn khác, chẳng hạn Sau3A1 (tìm thấy vi khuẩn Staphylococcus aureus) có trình tự giới hạn ngắn (5’-GATC-3’), nên tần số cắt chúng thường cao enzym có trình tự giới hạn dài Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình vị trí cắt đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256) Ngược lại, enzym NotI có trình tự giới hạn dài (5’-GCGGCCGC-3’) trung bình đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, có vị trí cắt (1/48 = 1/65536) Các enzym giới hạn khơng khác trình tự giới hạn độ dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng chúng, mà chúng khác cách “cắt” phân tử ADN Chẳng hạn enzym HpaI tạo phân tử ADN dạng đầu (đầu tù), enzym ERcoRI, HindIII PsIt cắt phân tử ADN tạo phân đoạn có đầu dính Sở dĩ gọi “đầu dính” phần trình tự hai đầu sau enzym cắt bổ trợ với theo nguyên tắc Chargaff chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, với phân tử ADN cắt loại enzym giới hạn Tính chất ứng dụng rộng rãi công nghệ ADN tái tổ hợp kỹ thuật tách dòng phân tử Vậy cách phân tử ADN cắt, tái tổ hợp nhân lên? Tách dòng ADN véctơ plasmid Sau phân đoạn ADN cắt khỏi phân tử ADN có kích thước lớn enzym giới hạn, phân đoạn ADN cần “cài” vào véctơ để nhân lên Hay nói cách khác phân đoạn ADN cần cài vào phân tử ADN thứ hai (véctơ) để nhân lên VD vị trí tế bào chủ nói Cho đến nay, tế bào chủ sử giới hạn hệ dụng rộng rãi để nhân lên đoạn ADN công nghệ ADN gen người tái tổ hợp vi khuẩn E coli Các véctơ ADN điển hình thường có đặc tính: a) Chúng phải chứa trình tự khởi đầu chép (tái bản), cho phép chúng tự chép độc lập với nhiễm sắc thể tế bào chủ b) Chúng phải mang dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng xác định phân lập tế bào mang véctơ tái tổ hợp (mang đoạn ADN cài) với tế bào không mang véctơ tái tổ hợp c) Có vị trí cắt nhiều enzym giới hạn khác Đây vị trí cài phân đoạn ADN cần tách dòng vào véctơ Véctơ tách dòng phổ biến phân tử ADN sợi kép, mạch vòng kích thước nhỏ (khoảng kb) gọi plasmit Các véctơ phần lớn có nguồn gốc từ loài vi khuẩn số từ sinh vật nhân chuẩn đơn bào (nấm men) Trong nhiều trường hợp, phân tử ADN tự nhiên mang sẵn gen mã hóa tính kháng chất kháng sinh Như vậy, plasmid tự nhiên có sẵn hai thuộc tính là: khả tự chép tế bào chủ có trình tự dấu chuẩn chọn lọc Ngồi ra, véctơ plasmit ưu điểm chúng đồng thời tồn nhiều tế bào Điều giúp khuếch đại phân lập số lượng lớn phân đoạn ADN từ quần thể tế bào nhỏ Trước đây, số véctơ plasmit có vị trí cắt enzym giới hạn Cùng với thời gian, cấu trúc véctơ plasmit cải tiến theo hướng cắt bỏ bớt trình tự khơng cần thiết gắn thêm vào đoạn trình tự cắt nhiều loại enzym giới hạn khác Vị trí véctơ mang đoạn trình tự gọi vị trí đa tách dòng (polycloning site) Có vị trí đa tách dòng có kích thước ngắn cắt 20 loại enzym giới hạn khác Nhờ đặc tính này, véctơ dùng để tách dòng nhiều phân đoạn ADN có nguồn gốc khác Trên sở nguyên tắc tương tự, véctơ plasmit, người ta phát triển nhiều loại véctơ khác có nguồn gốc phagơ, lai vi khuẩn - phagơ (như phagemid, cosmid P), có nguồn gốc từ nấm men (ví dụ: YAC) Việc cài phân đoạn ADN vào véctơ thường công việc tương đối đơn giản Người ta thường sử dụng loại enzym giới hạn để cắt véctơ đoạn ADN cài Chẳng hạn việc sử dụng enzym EcoRI cắt chuyển véctơ từ dạng “vòng” sang dạng “mạch thẳng” có hai đầu dính Do cắt enzym giới hạn, nên đoạn ADN cài có hai đầu dính với trình tự bổ trợ với trình tự đầu dính véctơ Các đầu dính liên kết véctơ đoạn ADN cài lại với hình thành nên phân tử ADN mạch vòng (phân tử ADN tái tổ hợp) thiếu hai liên kết phosphodieste lại mạch Hai liên kết “hàn” kín nhờ sử dụng enzym ADN ligase có mặt ATP Để hạn chế khả gắn kết lại hai đầu dính véctơ (vì hai đầu dính có trình tự bổ trợ) sau cắt enzym giới hạn, người ta thường cho lượng ADN cài dư thừa so với véctơ để phần lớn véctơ sau gắn lại véctơ tái tổ hợp mang đoạn ADN cài Một số loại véctơ cho phép phân lập tinh phân đoạn gen đó, mà điều hòa biểu gen nằm phân đoạn ADN cài Những véctơ gọi véctơ biểu Các véctơ thường phải chứa trình tự promoter nằm ngược dòng sát với vị trí cài gen Nếu vùng mã hóa gen (khơng chứa promoter) gắn vào véctơ theo chiều khung đọc gen, gen cài phiên mã thành mARN dịch mã thành protein tế bào chủ Các véctơ biểu thường sử dụng để biểu gen đột biến gen lai để tiến hành phân tích chức chúng Chúng dùng để sản xuất lượng lớn loại protein vốn khơng thu hiệu suất tương tự đường tự nhiên Ngoài ra, promoter véctơ biểu lựa chọn cho biểu gen cài điều hòa việc bổ sung hợp chất đơn giản vào môi trường nuôi cấy (như loại đường axit amin chẳng hạn) Việc điều khiển chủ động biểu gen có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt gen gây độc Biến nạp véctơ ADN vào tế bào chủ Biến nạp q trình thể chủ tiếp nhận phân tử ADN ngoại lai từ mơi trường bên ngồi Một số vi khuẩn (trong khơng có E coli) có khả biến nạp tự nhiên gọi vi khuẩn khả biến di truyền Vi khuẩn E coli trở nên khả biến xử lý với ion Ca 2+ Mặc dù chế khả biến chưa biết đầy đủ, dường ion Ca2+ bao bọc lại điện tích âm phân tử ADN tăng cường khả chúng xuyên qua màng tế bào Các tế bào xử lý với Ca2+ gọi tế bào khả biến Người ta sử dụng chất kháng sinh mà véctơ plasmid mang gen dấu chuẩn mã hóa tính kháng chất kháng sinh để chọn lọc thể mang plasmid tái tổ hợp Các tế bào mang véctơ tái tổ hợp sinh trưởng môi trường chứa chất kháng sinh, tế bào khác khơng Thơng thường q trình biến nạp có hiệu suất khơng cao Chỉ có tỉ lệ nhỏ tế bào xử lý biến nạp tiếp nhận plasmid tái tổ hợp Nhưng, hiệu biến nạp thấp giúp hầu hết tế bào mang véctơ tái tổ hợp thường tiếp nhận plasmid Thuộc tính giúp cho tế bào biến nạp dòng tế bào chúng sinh (do phân chia trực phân) mang véctơ ADN tái tổ hợp cho phép nhà nghiên cứu thể phân lập tinh gen hoặc sản phẩm gen riêng rẽ từ hỗn hợp biến nạp mang phân tử ADN khác Thư viện hệ gen Đối với hệ gen đơn giản, kỹ thuật tách dòng thường đơn giản Chẳng hạn với hệ gen số virut có kích thước khoảng 10 kb, người ta trực tiếp tách chiết ADN, cắt chúng enzym giới hạn tiến hành phân tích điện di Các phân đoạn ADN tách biệt gel điện di cắt khỏi gel, tinh cài vào véctơ Trong đó, hệ gen phức tạp, kích thước lớn (như hệ gen người), việc cắt ADN tổng số enzym giới hạn phân tích điện di thường dẫn đến hình thành dải băng điện di liên tục có phân bố liên tục phân đoạn ADN cắt giới hạn khác một vài nucleotit Vì vậy, để đơn giản hóa quy trình tách dòng hệ gen này, người ta thường tiến hành biến nạp toàn phân đoạn ADN (thu sau cắt enzym giới hạn) vào véctơ tách dòng biến nạp tất chúng vào tế bào chủ, sau phân lập dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp có đoạn cài ADN khác Tập hợp dòng tế bào gọi thư viện hệ gen Như vậy, thư viện hệ gen tập hợp dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp chứa đoạn ADN cài khác có nguồn gốc (cùng hệ gen) Để thiết lập thư viện gen, hệ gen tế bào đích (chẳng hạn ADN hệ gen người) cắt enzym giới hạn để tạo phân đoạn ADN có kích thước trung bình mong muốn Kích thước phân đoạn (đoạn cài) dao động từ 100 bp đến Mb (đối với phân đoạn ADN kích thước lớn, phân tử ADN thường cắt khơng hồn tồn enzym giới hạn) Các phân đoạn ADN cắt giới hạn sau “trộn” với loại véctơ phù hợp (trước cắt loại enzym giới hạn) ADN ligase Kết bước tạo tập hợp véctơ mang đoạn ADN cài khác Người ta tạo nhiều thư viện gen khác bắt nguồn từ nguồn vật liệu khác Thư viện hệ gen đơn giản bắt nguồn từ ADN hệ gen tổng số cắt enzym giới hạn nhất, gọi thư viện hệ gen Loại thư viện có ý nghĩa ứng dụng rõ rệt nhằm giải mã trình tự hệ gen Ngược lại, mục đích tìm phân lập phân đoạn mang gen mong muốn, thư viện hệ gen tỏ hiệu hệ gen chứa phần tương đối nhỏ vùng khơng mã hóa Đối với hệ gen phức tạp hơn, thư viện hệ gen không phù hợp cho việc tìm phân đoạn mang gen mong muốn phần lớn dòng thư viện mang đoạn cài thuộc vùng không mã hóa Để có thư viện gen mang hầu hết đoạn cài vùng mã hóa, người ta sử dụng thư viện cADN Các bước thiết lập thư viện cADN minh họa hình 10 Theo đó, bước thay ADN, người ta phiên mã ngược trình tự mARN thành trình tự ADN phiên (cADN) Quá trình gọi trình phiên mã ngược thực nhờ enzym ADN polymerase đặc biệt reverse transcriptase Enzym có khả tổng hợp ADN bắt nguồn từ phân tử ARN mạch đơn làm khuôn ban đầu Khi có mặt enzym reverse transcriptase, trình tự mARN phiên mã ngược thành phân tử ADN sợi kép, phân tử gắn vào véctơ Để phân lập đoạn cài riêng rẽ từ thư viện hệ gen, tế bào E coli tiến hành biến nạp với tất phân đoạn thư viện Mỗi tế bào biến nạp thường mang véctơ mang đoạn cài ADN Vì vậy, tế bào nhân lên sau chúng sẽ tạo nhiều dòng tế bào, dòng chứa nhiều phân đoạn thư viện cADN Khuẩn lạc tạo từ tế bào mang trình tự ADN mong muốn phân lập từ thu lại ADN Có số cách để xác định dòng tế bào mang gen biến nạp Chẳng hạn phương pháp nêu sử dụng mẫu dò ARN /hoặc ADN để xác định quần thể tế bào mang đoạn ADN định Sử dụng lai mẫu dò để xác định dòng tế bào thư viện gen Trong phương pháp sử dụng mẫu dò, người ta sử dụng đoạn trình tự ADN /ARN có trình tự bổ trợ đánh dấu lai với dòng tế bào mang đoạn gen cài khác thư viện hệ gen Kỹ thuật gọi phương pháp lai khuẩn lạc Một thư viện hệ gen điển hình thường chứa hàng ngàn đoạn cài khác mang loại véctơ tách dòng Sau véctơ biến nạp vào chủng vi khuẩn phù hợp, tế bào vi khuẩn cấy bề mặt đĩa petri chứa môi trường bán rắn chứa agar Mỗi tế bào sau phát triển lên thành khuẩn lạc riêng rẽ, tế bào khuẩn lạc mang loại véctơ đoạn gen cài giống Trong kỹ thuật lai khuẩn lạc, người ta sử dụng loại màng lai dùng phương pháp thẩm tách Southern Northern để thu hồi lượng “vết” ADN đủ cho kết cặp với mẫu dò đây, người ta dùng màng lai ép lên bề mặt đĩa nuôi cấy chứa khuẩn lạc in hình chúng lên màng lai (cùng với ADN chúng) cho vị trí dòng tế bào màng lai tương ứng với vị trí khuẩn lạc chúng đĩa petri (theo nguyên tắc “đóng dấu”) Điều đảm bảo cho việc xác định vị trí màng lai có kết “dương tính” việc bắt cặp với mẫu dò xác định tương ứng khuẩn lạc mang dòng tế bào chứa véctơ tái tổ hợp mang đoạn gen cài mong muốn Màng lai đem lai với mẫu dò sau: người ta tiến hành xử lý màng lai cho màng tế bào vỡ phân tử ADN ngồi gắn lên màng lai vị trí tế bào chúng Các màng lai sau ủ với mẫu dò đánh dấu từ trước điều kiện giống tiến hành kỹ thuật thẩm tách Northern hay Southern Trong công nghệ ADN tái tổ hợp, ngồi véctơ plasmit có nguồn gốc vi khuẩn, người ta sử dụng véctơ có nguồn gốc virut (bacteriophage), từ sinh vật bậc cao nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC), hay nhiễm sắc thể nhân tạo có nguồn gốc vi khuẩn (BAC), số véctơ lai chúng (vd: cosmid, P) Trong véctơ có nguồn gốc bacteriophage, phage l sử dụng phổ biến ADN virut cải biến sử dụng véctơ tách dòng Véctơ sử dụng để tách dòng thư viện hệ gen nguyên tắc giống hệt sử dụng véctơ plasmit Chỉ có điểm khác tiến hành lai để xác định dòng gen biến nạp vị trí mẫu dò xác định màng lai tương ứng với vị trí vết tan thay cho vị trí khuẩn lạc sử dụng véctơ tách dòng plasmit B CÂU HỎI LÝ THUYẾT TỰ LUẬN Thế DNA tái tổ hợp invitro ? Tại kĩ thuật tái tổ hợp DNA gọi kĩ thuật tạo dòng phân tử ? DNA tái tổ hợp invitro DNA tạo thành ghép nối đoạn DNA khác ống nghiệm biểu hoạt tính đưa trở lại tế bào sống Kĩ thuật tái tổ hợp DNA gọi kĩ thuật tạo dòng phân tử cho phép từ đoạn acid nucleic nhân lên thành dòng gồm giống Ý nghĩa enzyme restrictase ? + Giúp vi khuẩn nhận biết hạn chế khả sinh sản phage khả cắt DNA cách đặc hiệu restrictase enzyme + Enzyme restrictase dùng để cắt DNA kĩ thuật tái tổ hợp DNA Nững loại enzyme dùng để cắt, nối chép gene ? Loại enzyme đóng vai trò hàng đầu ? Nuclease, DNA polymerase, ligase, reverse transcriptase, terminal transferase, hàng đầu restrictase Một gene cấu trúc biết rõ trình tự tổng hợp nhân tạo lần nhóm Khorona vào 1969 gene khơng có hoạt tính Giải thích Thiếu trình tự điều hòa (promoter) Tạo nòi vi khuẩn sản xuất insulin phương pháp hóa tổng hợp gene sau: dùng ligase nối đoạn oligonucleotide tổng hợp thành polynucleotide Polynucleotide gắn vào plasmid Tế bào chứa plasmid mang gene insulin sản xuất proinsulin, qua xử lí hóa học thu insulin Ở thí nghiệm người ta thấy tế bào chứa plasmid mang gene insulin không tổng hợp proinsulin Giải thích Do plasmid khơng có gắn promoter cần cho phiên mã gene lạ 10 Có phương pháp thu nhận gene để thực kĩ thuật tái tổ hợp DNA: Cách 1: Tách đoạn DNA từ hệ gene: dùng enzyme restriction cắt toàn DNA thành đoạn nhỏ gắn vào vector mang gene tạo plasmid tái tổ hợp Cách 2:Hóa tổng hợp nhân tạo gene (xem câu 5) Cách 3: sinh tổng hợp gene từ mRNA tương ứng: tổng hợp cDNA mạch đơn từ mRNA trưởng thành nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sau dùng DNA polymerase tổng hợp cDNA mạch kép từ cDNA mạch đơn Gắn cDNA mạch kép vào plasmid biến nạp vào tế bào vi khuẩn Trong thực tiễn kĩ thuật di truyền, người ta thường dùng cách ? Giải thích +Trong thực tiễn kĩ thuật di truyền, người ta thường dùng cách +cách 1:tách đoạn DNA từ hệ gene có nhiều bất lợi: hệ gene sinh vật khác chứa nhiều gene; số đoạn DNA tạo nhiều có đoạn DNA tương tự nhau; số đoạn DNA nhiều nên cần số lượng lớn dòng vi khuẩn mang DNA; phần lớn DNA Eukarytotae bậc cao khơng mã hóa tổng hợp protein nên dễ làm tốn cơng vơ ích tạo dòng Tuy nhiên, cách dùng có hiệu lập ngân hàng DNA hệ gene hay thư viện DNA hệ gene +cách 2: Phải biết trình tự nucleotide gene Tuy nhiên, nhờ phát triển phương pháp nghiên cứu cấu trúc bậc protein sản phẩm khác gene phương pháp xác định trình tự nucleotide thúc đẩy nhanh cách +cách 3:dòng cDNA hệ gene đoạn nucleotide ngẫu nhiên, gần không phụ thuộc loại tế bào dùng để lấy DNA; dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục nên cDNA tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn; protein tạo với số lượng lớn mRNA protein có tỉ lệ cao nên dễ xác định dòng cDNA mong muốn Vector chuyển gene ? Vector chuyển gene phân tử DNA có khả tự chép, tồn độc lập tế bào mà không thiết phải gắn vào hệ gene tế bào chủ mang gene mong muốn với số lượng lớn Vector phải gắn thêm promoter (trình tự điều hòa) tạo thuận lợi cho phiên mã gene lạ gene đánh dấu để dễ dàng phát vector hay gene lạ gắn vào Vector cấu tạo tùy theo mục tiêu sử dụng cải tiến khơng ngừng Vì vector phage λ dùng rộng rãi để lập ngân hàng gene thay đưa plasmid vào tế báo vi khuẩn biến nạp ? +Dễ bảo quản, dễ tách để phân tích, dễ loại bỏ +Có hệ thống tự động xâm nhập sinh sản tế bào vi khuẩn +Một ưu phage có khả mang đoạn DNA lạ dài so với plasmid 11 +Dễ xác định DNA lạ gắn vào phage chưa Vì để đưa DNA tái tổ hợp vào thực vật nhiễm gene (transgenic plant) người ta thường bắn DNA trực tiếp vào tế bào mà không tạo tế bào trần ? +Tạo tế bào trần: phải làm vách tế bào để DNA ngấm vào trong; thường tế bào có sức sống kém, khó phân chia để tự tái sinh +DNA bắn với tốc độ nhanh, xuyên thủng vách tế bào vào 10 Tại PCR có vai trò cách mạng hóa nghiên cứu cấu trúc chức gene ? +Thời gian thực cực nhanh, đơn giản tốn +Độ tinh mẫu không cần cao +Khuyếch đại nhanh nhiều đoạn acid nucleic mà khơng cần tạo dòng +Được hồn thiện khơng ngừng có nhiều ứng dụng xác định trình tự nucleotide, gây đột biến điểm định hướng, Có thể thực PCR tế bào với DNA RNA 11 Làm tạo đột biến điểm định hướng tức chủ động gây đột biến điểm chuyên biệt mong muốn ? +Làm đoạn +Làm tăng đoạn +Nối đoạn gene lại +Thay nucleotide nucleotide khác 12 Vì lai acid nucleic PCR coi phương pháp chẩn đoán y học ? +Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng diện đủ cho phân tích khơng cần ni cấy +Có thể dùng vi sinh vật gây bệnh không nuôi bệnh nhiễm virus +Một mẫu xác định đại diện cho tất serotype +Có thể tạo dòng gene bệnh để sản xuất mẫu thử tương ứng 12 C MỘT SỐ DẠNG TẬP CƠ BẢN: Một phân tử ADN, số nucleotide A khác T G khác X ADN mạch đơn Từ tỷ lệ bazo ADN sau, xác định mạch đơn hay kép ADN1 ADN2 ADN3 A 32 17 29 G 18 28 25 T 31 31 29 X 10 24 17 Giải: Phân tử mạch kép A=T G=X Phân tử mạch đơn A khác T G khác X Hàm lượng G-X cao nhiệt độ gây biến tính ADN cao Nhiệt độ mà phân tử ADN mạch kép bị tách thành sợi đơn gọi nhiệt độ "nóng chảy" Hãy cho biết đoạn ADN có cấu trúc có nhiệt "nóng chảy" cao ngược lại Nếu ADN1 biến tính 74 0C ADN2 biến tính 810C, so sánh hàm lượng G-X chúng? Giải: Những đoạn ADN có nhiệt độ :nóng chảy" cao đoạn có chứa nhiều loại G-X số lượng liên kết hyđrơ nhiều hơn, ngược lại, đoạn ADN có nhiều cặp A-T , G-X có nhiệt độ nóng chảy thấp có liên kết hyđrơ Phân tử ADN2 có hàm lượng G-X cao biến tính nhiệt độ cao Phân tử AND mạch vòng có n điểm giới hạn tạo n đoạn xử lý enzim giới hạn Khi cắt plasmid pBR322 HaeI có 11 đoạn AND tạo ra, cắt BamHI có đoạn tạo Có điểm giới hạn cho enzim? Giải: AND mạch vòng, có 11 điểm giới hạn cho HaeI cho BamHI AND mạch thẳng có có n điểm giới hạn tạo n+1 đọan Một phân tử AND mạch thẳng cắt EcoRI tạo đọan 3kb, 4,2kb, 5kb Hãy xác định đồ giới hạn Giải: Có ba đọan AND tạo thành sau cắt với enzyme giới hạn, phải có điểm cắt giới hạn Các điểm phân bố sau: 3 5 4.2 4.2 4.2 Khi dùng enzym giới hạn cắt AND, đột biết xảy vị trí cắt giới hạn, đọan làm xuất đọan dài 13 Khi xử lý gen (đọan AND) BgIII, tạo đọan 1,7kb; 2,1kb 3,2kb Khi xử lý đoạn AND tách từ thể đột biến ko tổng hợp enzim gen BgIII, người ta thấy đoạn 3,2 3,8kb Điều xảy ra? Giải: Đột biến làm thay đổi số loại bazo điểm nhận biết BgIII, E cắt ADN lần Đoạn tổng đoạn 1,7kb 2,1kb cho thấy đoạn nằm kề AND bình thường Đột biến tạo vị trí cắt giới hạn làm đoạn cũ xuất đoạn ngắn Xét đoạn AND 5, xử lý AND tách từ thể đột biến khác BgIII thấy xuất đoạn 1,3kb; 1,7kb; 1,9kb 2,1kb Giải thích kết thu được? Giải: Các đoạn 1,7kb 2,1kb có ADN bình thường lẫn đột biến Điểm giới hạn sinh đoạn phải nguyên vẹn AND đột biến Hai đoạn lại có tổng 3,2kb đoạn bị Vậy vị trí cắt giới hạn tạo AND gốc Nếu đoạn enzim giới hạn tạo xuất xử lý enzim hỗn hợp enzim đoạn khơng có điểm giới hạn cho enzim thứ Một AND mạch thẳng xử lý enzim kết sau: EcoRI: 1,7; 2,1; 3,2kb HaeI: 1,0; 1,4; 4,6kb Hỗn hợp: 0,7; 1,0; 1,4; 1,8; 2,1kb Những đoạn giới hạn EcoRI không chứa điểm giới hạn HaeI ngược lại? Giải: Đoạn 2,1kb EcoRI xuất hỗn hợp, ko có điểm giới hạn HaeI Các đoạn khác EcoRI xử lý E nên chúng phải chứa điểm giới hạn HaeI Tương tự đoạn 1,0 1,4 HaeI ko chứa điểm giới hạn HaeI Tế bào thu nhận plasmid phải biểu tính kháng lien quan đến plasmid Trong thí nghiệm biến nạp điển hình, chưa đến 1% số tế bào thực nhận plasmid Bằng cách bạn tách số tế bào có plasmid? Giải: thiết kế plasmid có chứa vài gen kháng chất kháng sinh Trộn tế bào với plasmid cấy môi trường chứa chất kháng sinh Chỉ tế bào nhận plasmid sinh trưởng Việc xen đoạn AND ngoại lai vào gen thường làm chức gen Một plasmid chứa gen kháng ampicillin tetracycline Plasmid chứa điểm giới hạn nằm gen tetracycline Plasmid xử lý với E giới hạn trộn 14 với AND ngoại lai đem ủ với E.coli Bằng cách để tách tế bào có plasmid lai? Giải: Cấy tế bào mt có ampicillin chọn tế bào sinh trưởng tế bào có plasmid có gen ampicillin trọn vẹn Cấy chép tế bào vào mt chứa tetracycline Những tế bào ko sinh trưởng tế bào mang gen có đoạn xen Trở lại với tế bào gốc mt chứa ampicillin để lấy ngững tế bào ko sinh trưởng mt chứa tetracycline 10.ARN có đánh dấu phóng xạ, cADN dùng mẫu dò chúng gắn với đoạn AND từ chúng sinh Các phân tử bổ trợ với AND tạo đoạn lai phát Xử lý AND hệ gen người với E.coli phân tách đoạn tạo điện di Các băng AND chuyển sang màng lọc ủ với cADN mã hóa insulin có đánh dấu phóng xạ Kết sau: (dấu *= băng có đánh dấu phóng xạ) * * Có thể kết luận từ thí nghiệm này? Giải: Hai băng đánh dấu * có chứa trình tự bổ trợ với cADN insulin, phần gen insulin Sự có mặt băng cho thấy gen có chứa điểm cắt giới hạn E.coli PHẦN III KẾT LUẬN Công nghệ ADN tái tổ hợp đời sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trò cách mạng phát triển sinh học cải tạo sinh giới Công nghệ sinh học mà đỉnh cao kỹ thuật tái tổ hợp ADN ngày có ý nghĩa to lớn đời sống người, tạo điều mà trước tưởng chừng không làm được.Thực vậy, nhờ kỹ thuật tái tổ hợp ADN người làm nhiều sản phẩm ưu việt hơn, điều chế nhiều loại văcxin phòng nhiều bệnh nguy hiểm, nâng cao chất lượng sống Chuyên đề “Công nghệ ADN tái tổ hợp” tập trung vào ba nội dung hệ thống hóa kiến thức lý thuyết - Các dạng câu hỏi lý thuyết trắc nghiệm tự luận Một số dạng tập kỹ thuật di truyền phân tử Khi áp dụng chuyên đề vào giảng dạy cho học sinh chuyên, ôn luyện thi học sinh giỏi, ôn thi đại học bước đầu thu kết tốt Rất mong góp ý đồng nghiệp để chuyên đề hoàn thiện 15 ... thuật tái tổ hợp ADN người làm nhiều sản phẩm ưu việt hơn, điều chế nhiều loại văcxin phòng nhiều bệnh nguy hiểm, nâng cao chất lượng sống Chuyên đề Công nghệ ADN tái tổ hợp tập trung vào ba... vào plasmit Trong kĩ thuật cấy gen người ta dùng thể thực khuẩn làm thể truyền Nó gắn đoạn ADN tế bào cho vào ADN xâm nhập vào tế bào nhận đem theo đoạn ADN vào Kỹ thuật ADN tái tổ hợp: ADN tái. .. III KẾT LUẬN Công nghệ ADN tái tổ hợp đời sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trò cách mạng phát triển sinh học cải tạo sinh giới Công nghệ sinh học mà đỉnh cao kỹ thuật tái tổ hợp ADN ngày có