CHUYÊN ĐỀ KỸ THUẬT TẠO DÒNG PHẦN A NỘI DUNG CHUYÊN ĐỀ I Quy trình chung kỹ thuật tạo dòng II Tạo vector tái tổ hợp Chọn chuẩn bị vector Chuẩn bị trình tự ADN cần tạo dòng Chọn tế bào chủ phù hợp Tạo vector tái tổ hợp III Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nhận IV Chọn lọc dòng tế bào nhận có chứa ADN tái tổ hợp V Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào nhận PHẦN B MỘT SỐ CÂU HỎI ÔN TẬP Các từ viết tắc: - Linker: Đoạn nối - Insert: Trình tự ADN cần tạo dòng - RE: Enzim cắt giới hạn PHẦN A NỘI DUNG CHUYÊN ĐỀ I Quy trình chung kỹ thuật tạo dòng Kỹ thuật tạo dòng chia thành bước khác nhau, nhiên tựu trưng lại chia thành bước bản: Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp (ADN tái tổ hợp) Bước 2: Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào nhận Bước 3: Chọc lọc dòng tế bào nhận có vector tái tổ hợp Quy trình tạo dòng mơ tả qua hình ảnh minh họa sau: ADN ngoại lai có gen cần chuyển Gen kháng kháng sinh vị trí cắt enzim cắt Đầu dính Plasmid không phù hợp ADN không phù hợp ADN tái tổ hợp mong muốn NST vi khuẩn ADN tái tổ hợp mong muốn Trong bước nêu trên, bước có ý nghĩa tiên Để thành cơng bước – tức tạo vector tái tổ hợp, phải trải qua nhiều công đoạn khác Ngày nay, với đời kỹ thuật di truyền, góp phần giải khó khăn việc tạo vector tái tổ hợp, hỗ trợ việc chọn lọc gen cần chuyển khơng phức tạp trước Về bản, kỹ thuật tạo dòng nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng gen sản phẩm gen tạo II Tạo vector tái tổ hợp Bước quan trọng, để tạo thành công viector tái tổ hợp cần phải chọn chuẩn bị vector, chuẩn bị gen cần tạo dòng, cắt lấy gen gắn vào vector để tạo vector tái tổ hợp Chọn chuẩn bị vector: Vector trình tự ADN ngắn có nguồn gốc virut, vi khuẩn, hay tế bào nhân thực, tồn ổn định tế bào chủ mang trình tự ADN có nguồn gốc khác (ADN ngoại lai) cần tạo dòng – gen cần chuyển Một vector có thành phần sau: - Trình tự khởi đầu chép (ori): Đặc trưng cho tế bào chủ, cho phép vector nhân độc lập tế bào chủ - Gen chọn lọc: Cho phép nhân biết tế bào chủ có chứa vector, thường gen khángkháng sinh, đặc trưng cho tế bào chủ - Các trình tự nhận biết enzyme giới hạn: Cho phép gắn chèn trình tự cần tạo dòng vào vector Ngồi có thêm số trình tự khác gen reporter để nhận biết vector tái tổ hợp, promoter để biểu gen tạo dòng, … Một số loại vector thường dùng kỹ thuật tạo dòng nay: (1) Plasmid: Đây ADN dạng vòng, loại vector phổ biến nhất, có khả mang trình tự nucleotit cần tạo dòng khoảng 10 kb, thường tạo nhiều (ví dụ pUC19 500 – 700 tế bào) Một số plasmid phổ biến: pUC19 có trình tự ori, phù hợp tế bào chủ E coli với gen chọn lọc: kháng ampicillin biến dưỡng (lacZ) Plasmid có trình tự nhận biết RE tập trung vào vùng polylinker (MCS) pBR322 có trình tự ori, phù hợp tế bào chủ E coli với gen chọn lọc: kháng ampicillin tetracyclin Các trình tự nhận biết RE phân bố khắp plasmid pGEM-T Easy có trình tự ori, phù hợp tế bào chủ E coli trình tự f1 ori tử phage f1, với gen chọn lọc là: gen kháng ampicillin lacZ Các trình tự nhận biết RE tập trung vào vùng MCS Plasmid có mang promoter T7 SP6 (2) Bacteriophage (phage):Phổ biến phage lambđa M13, mang khoảng 10-15 kb,tối đa 45-50 kb Hiệu lắp ADN tái tổ hợp vào đầu phage chuyển gene vào vi khuẩn thông qua tải nạp Phage λ (khoảng 48kb) ADN mạch thẳng có mạch đơn (trình tự cos) nằm đầu phage Khi bơm vào vi khuẩn, phage đóng vòng bắt cặp trình tự cos Enzyme terminase phage cắt mở vòng trình tự cos Vector phage có dạng: dạng gắn thêm (insertion) dạng thay (replacement): - Dạng gắn thêm có mang vị trí gắn chèn thu nhận khoảng 5-11 kb - Dạng thay có vị trí cắt nằm kèm vùng gen khơng cần cho tạo dòng, bị loại bỏ thay trình tự khoảng 8-24 kb Trình tự cần tạo dòng phải gắn cánh trái cánh phải phage với đầu mút trình tự cos Kích thước DNA tái tổ hợp yếu tố chọn lọc: nhỏ hay qua lớn có vấn đề “đóng gói” Phage M13 (khoảng 6.4 kb) có ADN mạch đơn dạng vòng Khi xâm nhiễm vi khuẩn có lơng gai giới tính (mang plasmid F), ADN chuyển thành ADN mạch đơi dạng vòng gọi RF (replicative form) “Thể chép” chép theo kiểu vòng xoay tạo nhiều mạch đơn (+), lắp vào đầu tạo phần tử phage thải khỏi tế bào M13 không ly giải tế bào chủ Các vector mp (M13mp) ADN M13 tái tổ hợp có chứa trình tự DNA E coli mã hóa tiểu phần β-galactosidase vùng điều hòa, vùng polylinker với nhiều trình tự cắt RE Vector M13 dùng để thu nhận ADN mạch đơn cho gây tạo đột biến điểm định hướng hay dùng kỹ thuật phage display (3) Vector “lai” loại trên: cosmid mang khoảng 45 kb phagemid: Phagemid bao gồm phage plasmid Vector có mang trình tự ori để chép ADN mạch đôi E coli trình tự f1 ori từ phage f1 để tạo ADN mạch đơn đóng gói phage Đây dạng vector “con thoi” Khi biến nạp phagemid vào vi khuẩn, phagemid chép plasmid Khi xâm nhiễm E.coli với pBluescript helper phage (M13K07), ADN mạch đơn đóng gói tạo phage Cosmidbao gồm plasmid trình tự cos phage lambđa.Có thể thu nhân 28-52 kb (trung bình 45 kb) ADN, dùng để tạo thư viện DNA gen Vector tái tổ hợp đóng gói trongphage xâm nhiễm hiệu vi khuẩn Trongvi khuẩn, cosmid đóng vòng.Các trình tự DNA cần tạo dòng phải có kíchthước phù hợp Vi khuẩn mang cosmid tái tổ hợp tạo khuẩn lạcPhage chứa ADN mạch đơn cần tạo dòng đượctiết mơi trường (4) Vector virus: Baculovirus, adenovirus, retrovirus, mang 8-10 kb, thường dùng liệu pháp gene, tạo vaccin Vector virus có số đặc điểm như: - Có phổ tế bào chủ xác định - Một số virus gắn chèn vào nhiễm sắc thể biểu bền vững - Hiệu chuyển gene cao Một số vector virus thơng dụng: - Retrovirus: thu nhận 8-10 kb ADN, xâm nhiễm tế bào phân chia tích cực, có khả găn chèn vào nhiễm sắc thể, dẫn đến ung thư - Lentivirus: Là nhóm retrovirus có khả xâm nhiễm gắn chèn vào nhiễm sắc thể tế bào không phân chia, an tồn retrovirus khác - Adenovirus: Khơng gắn chèn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ không nhân tế bào phân chia (5) Vector nhiễm sắc thể nhân tạo: - BAC (Bacterial Artificial Chromosome): dựa plasmid F, có mang gen “phân chia” cần cho chia plasmid tế bào Có thể mang 150-350 kb BAC Gồm thành phần: + RepE:Sao chép plasmid điều hòa số lượng + ParA, parB, parC: chia plasmid tế bào phân chia, trì tính ổn định BAC +Gen thị: Cmr (kháng chloramphenicol), lacZ + Promoter (t7, Sp6) - YAC (Yeast Artificial Chromosome): Dựa DNA Saccharomyces cerevisiae gắn với plasmid YAC Có thể mang 100 – 1000 kb Gồm thành phần: + TEL:Telomere bảo vệ đầu mút nhiễm sắc thể + CEN:Centromere ổn định phân chia nhiễm sắc thể + ARS (Autonomously Replicating Sequence):Vị trí khởi đầu chép + Gen thị: HIS3, URA3, TRP1, ampR + Trình tự nhận biết BamHI EcoRI - HAC (Human Artificial Chromosome): Vi nhiễm sắc thể (6-10 Mb thay 50-250 Mb), hoạt động NST tế bào người HAC gồm thành phần chính: + Vị trí khởi đầu chép + Centromere đảm bảo phân chia NST phân bào + Telomere bảo vệ đầu mút NST Có hai cách tạo HAC: + Loại bỏ dần trình tự NST tự nhiên, giữ lại trình tự thiết yếu + “Lắp ráp” (de novo) từ trình tự DNA vệ tinh alphoid I HAC có ưu điểm so với BAC YAC: Không gắn chèn vào NST có khả mang vơ hạn Chuẩn bị trình tự ADN cần tạo dòng: - Dùng RE cắt ADN NST tế bào cho để lấy đoạn nucleotit cần tạo dòng RE dùng để cắt trường hợp phải loại với RE cắt vector - Có số cách cắt RE: + Cắt đầu bằng: ví dụ RE Smal + Cắt đầu so le kiểu “5 – overhang”: Ví dụ RE BamHI + Cắt so le kiểu “3 – overhang”: Ví dụ RE PstI - Nhân trình tự cần tạo dòng PCR với primer thiết kế gồm vùng đặc hiệu cho gen vùng mang trình tự nhận biết RE: Gắn mồi oligo T Phiên mã ARN thành ADN Cắt bỏ ARN ADN sợi đơn Gắn mồi oligo C Tổng hợp sợi bổ sung Metyl hóa ADN ADN sợi kép Trật tự cắt EcoRI Nối linker vào ADN Cắt linker EcoRI Đầu dính Nối ADN vào vector lây nhiễm vào E.coli Dòng ADN nhân Chọn tế bào chủ phù hợp: - Những đặc tính mong muốn tế bào chủ dùng tạo dòng: Có thể tiếp nhận vector, có đặc tính để nhân biết tình trạng có hay khơng có mang vector hay vector tái tổ hợp, nhân tạo số lượng lớn gen cần tạo dòng, khơng thủy phân phân giải hay biến đổi gen cần tạo dòng - Với đặc tính trên, E coli tế bào chủ phổ biến Ngồi đặc điểm cần có, E coli có chu kỳ sống ngắn, dễ ni cấy tạo sinh khối, dễ tạo thể đột biến có đặc tính di truyền cần cho tạo dòng - E.coli dùng với vector plasmid, phage, cosmid, phagemid, NST nhân tạo vi khuẩn - Các chủng E coli dùng làm tế bào chủ phổ biến cho plasmid JM109, DH5α, NM522; cho phage Y1089, Y1090,… Tạo vector tái tổ hợp: - Cắt vector trình tự ADN cần tạo dòng với loại RE sau nối chúng lại với nhờ enzim ligase: - Đối với sản phẩm ADN tạo nhờ PCR, trình tự cần tạo dòng ADN vector dạng thẳng thơng qua hoạt hóa topoisomerase liên kết đầu mút vector: 10 - Bên cạnh đó, dựa tượng gắn chèn phage λ vào gen vi khuẩn, người ta nối insert với vector thơng qua tái tổ hợp vị trí chuyên biệt trình tự attB insert attP vector: III Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nhận - Vector tái tổ hợp đưa vào tế bào nhận nhờ phương pháp biến nạp tải nạp - Phương pháp hóa biến nạp: Transformation vi khuẩn hay transfection tế bào nhân thực cách sử dụng hóa chất muối CaCl để biến tế bào chủ thành tế bào khả nạp, có khả thu nhận vector từ mơi trường - Phương pháp điện biến nạp (electroporation): Sử dụng xung điện cao để tạo “lỗ” tạm thời màng tế bào màng nhân, qua phân tử từ môi trường chuyển vào tế bào chất hay nhân Ưu điểm phương pháp hiệu chuyển gen cao nhanh, không bị giới hạn kích thước vector sử dụng nhiều loại tế bào, kể loại khó chuyển gen 11 Trước dùng xung Trong dùng xung Sau dùng xung - Phương pháp tải nạp (transduction):Sử dụng virus để chuyểnvector tái tổ hợp vào tế bào (vi khuẩn, tế bào nhân thực) thông qua xâm nhiễm tự nhiên Trong phương pháp này, cần dịch “đóng gói” (packaging extract) có nguồngốc từ chủng E coli cI857 tiềm tan, có chứa cácthành phần cần để tạo đầu phần tửphage hồn chỉnh IV Chọn lọc dòng tế bào nhận có chứa ADN tái tổ hợp - Khi thực giai đoạn chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào nhận, có khả xảy ra: (1) Tế bào chủ nhận vector tái tổ hợp (2) Tế bào chủ nhận vector không tái tổ hợp (3) Tế bào chủ không nhận vector 12 - Có thể chọn lọc dòng tế bào nhận có chứa vector tái tổ hợp phương pháp như: Sàng lọc xanh – tím, dùng kháng thể hay lai phân tử khuẩn lạc - Chọn lọc dòng phương pháp sàng lọc xanh – tím: 13 - Chọn lọc dòng tế bào nhận cần tìm kháng sinh: Được tiến hành theo bước: (1) Gene tạo dòng vector biểu (2) Cảm ứng biểu protein (3) Chuyển protein biểu lên màng nitrocellulose (4) Lai với kháng thể sơ cấp kháng thể thứ cấp đánh dấu (5) Phát protein mục tiêu (6) Từ thu nhận khuẩn lạc (đĩa tan) tương ứng 14 - Chọn lọc dòng tế bào nhận cần tìm lai phân tử khuẩn lạc hay đĩa tan: Dùng mẫu dò để phát dòng tế bào có mang gen cần tìm 15 PHẦN B MỘT SỐ CÂU HỎI ƠN TẬP Câu Một thí nghiệm thực để tạo ADN tái tổ hợp plasmid X đoạn ADN (Y).Plasmid X chứa gen Leu2 quy định tổng hợp Leucine, đoạn ADN Y có chứa gen KanR- kháng kanamycin Biểu đồ cấu trúc X Y thể đây: Plasmid X đoạn ADN (Y) thêm vào hỗn hợp phản ứng có chứa enzim giới hạn Bglll(5'-A * GATCT-3 '), BamHI (5'-G * GATCC-3') Sau đó, sản phẩm chuyển sanghỗn hợp phản ứng có chứa ligase Các phân tử ADN biến nạp vào vi khuẩn Znhạy cảm với Kanamycin khơng thể sống sót mơi trường khơng có Leucine Sau ni cấy vi khuẩn Z môi trường chứa Kanamycin không chứa Leucine để chọn lọc tế bào Z có chứa plasmid tái tổ hợp Plasmid tái tổ hợp sau phân lập từ môi trường nuôi cấy Các phát biểu sau hay sai, giải thích a Nếu cắt plasmid sau chèn đoạn ADN Y EcoRI sau đem điện di thu băng điện di chứa đoạn ADN kích thước 2800 bp b Nếu hỗn hợp phản ứng, HindIII (5'-A * AGCTT-3 ') sử dụng thay cho BglII, vi khuẩn biến đổi có khả phát triển mơi trường có chứa Kanamycin c Đoạn ADN (Y) 500 bp loại bỏ khỏi plasmid tái tổ hợp cách sử dụng enzimgiới hạn BglII Hướng dẫn trả lời: a Sai đoạn ADN thu có kích thước lớn 2800 bp có chứa thêm đoạn Y b Sai đoạn ADN (Y) chèn vào plasmid c Sai vị trí cắt giới hạn enzim HglII bị thay đổi Câu 2:Dưới đồ giới hạn plasmid pGEN101 (tổng chiều dài=20kb) Hãy đưa số lượng kích thước phân đoạn cắt enzyme riêng rẽ EcoRI, BamHI, kết hợp loại enzme EcoRI + BamHI 16 DigestPerformed SizeofFragmentsObtained EcoRI BamHI EcoRI+BamHI Hướng dẫn trả lời: DigestPerformed Size ofFragments Obtained EcoRI 20kb BamHI kb, 6kb, 12 kb EcoRI+BamHI kb, 4kb, 6kb,8 kb Câu 3:Thực cắt plasmid pBLA230 thu bảng số liệu sau: DigestPerformed HpaI HindIII HpaI+HindIII SizeofFragmentsObtained 26kb 13kb,6kb,4kb,3kb 7kb,6kb(2),4kb,3kb Xây dựng đồ giới hạn pBLA230 Hướng dẫn trả lời: Câu 4:Plasmid pBR607 dài 2.6kb chứa gen kháng Ampicillin Tetracyline, ori, vị trí cắt giới hạn enzyme EcoRI, BamHI, PstI Dựa đồ giới hạn pBR607, vẽ phân đoạn tương ứng với kích thước chúng bảng điện di gel agarose sau thực cắt enzyme EcoRI, BamHI, PstI 17 Hướng dẫn trả lời: 18 Câu 5:Một học sinh xây dựng đồ giới hạn plasmid pUC23 cách sử dụng enzyme cắt giới hạn EcoRI BamHI Sau thực phản ứng cắt vị trí đơn lẻ phản ứng cắt đồng thời vị trí kép, điện di gel agarose sản phẩm phản ứng Hình ảnh cho biết số lượng phân đoạn ADN phản ứng Hướng dẫn trả lời: Câu 6: Một plasmid AND vòng, pDA102, dài 4.35kb Khi plasmid cắt tổ hợp enzyme cắt giới hạn điện di phân đoạn thu được, ghi lại bảng liệu 19 Sử dụng bảng liệu này, xây dựng đồ giới hạn pDA102 với vị trí cắt enzyme SalI, HhaIII Enzyme SalI HhaIII SalI+HhaIII Độ dài phân đoạn 2.30kb, 0.25kb, 1.80kb 2.10kb, 1.55kb, 0.70kb 1.20kb,1.10kb,0.75kb,0.70kb,0.35kb,0.25k b Hướng dẫn trả lời: 20 ... trình tự cần tạo dòng vào vector Ngồi có thêm số trình tự khác gen reporter để nhận biết vector tái tổ hợp, promoter để biểu gen tạo dòng, … Một số loại vector thường dùng kỹ thuật tạo dòng nay:... chuyển khơng phức tạp trước Về bản, kỹ thuật tạo dòng nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng gen sản phẩm gen tạo II Tạo vector tái tổ hợp Bước quan trọng, để tạo thành công viector tái tổ hợp cần... Y1089, Y1090,… Tạo vector tái tổ hợp: - Cắt vector trình tự ADN cần tạo dòng với loại RE sau nối chúng lại với nhờ enzim ligase: - Đối với sản phẩm ADN tạo nhờ PCR, trình tự cần tạo dòng ADN vector