BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Paecilomyces spp VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN TRẮNG, TUYẾN TRÙNG CỦA CÁC CHỦNG THU NHẬN ĐƯỢC Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Phùng Lê Kim Yến MSSV: 1051110195 Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 7/2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa cơng bố cơng trình trước Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng năm 2014 Sinh viên thực Phùng Lê Kim Yến Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn em xin chân thành gửi đến tập thể Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy kiến thức truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt năm đại học Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Nguyễn Thị Hai người tận tình dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ, hướng dẫn em có hiểu biết nhiều kiến thức chun ngành để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Em xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người nhiệt tình hỗ trợ thiết bị, vật tư giúp đỡ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp Em xin cám ơn anh Ngơ Văn Bình tạo điều kiện, giúp đỡ em thực thí nghiệm để hồn thành đồ án tốt nghiệp Em cám ơn bạn phòng thí nghiệm đặc biệt người bạn nhóm ESS động viên, giúp đỡ tơi Và lời cám ơn chân thành, sâu sắc xin dành cho Ba Mẹ, người theo dõi, ủng hộ nuôi khôn lớn đến ngày hôm Cám ơn gia đình ln chia sẻ tạo điều kiện để hoàn thành chặng đường học vấn Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1 Phân lập tuyển chọn nấm Paecilomyces spp 1.1.1 Giới thiệu nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái .3 1.1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.1.4 Độc tố nấm Paecilomyces spp 1.1.1.5 Chu kỳ sống chế tác động Paecilomyces spp ký chủ 1.1.2 Các chủng nấm Paecilomyces spp phân lập 11 1.1.3 Một số ứng dụng nấm Paecilomyces spp vào thực tiễn đời sống 13 1.1.3.1 Sản xuất enzyme 13 1.1.3.2 Sản xuất kháng sinh hợp chất thứ cấp 14 1.1.3.3 Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật 15 1.1.3.4 Xứ lý môi trường 15 1.1.4 Một số sản phẩm Paecilomyces spp 16 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển nấm Paecilomyces spp 17 1.3 Các nghiên cứu sử dụng Paecilomyces spp phòng trừ bọ phấn tuyến trùng gây hại .20 1.3.1 Tổng quan bọ phấn trắng 20 1.3.1.1 Phân loại khoa học 20 1.3.1.2 Đặc điểm sinh thái 21 1.3.1.3 Đặc điểm hình thái 22 1.3.1.4 Tổng quan bệnh vàng bọ phấn trắng gây 23 1.3.2 Tổng quan tuyến trùng 24 1.3.2.1 Phân loại khoa học 25 1.3.2.2 Đặc điểm sinh thái 25 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.3 Tổng quan bệnh sần rễ tuyến trùng gây 26 1.3.3 Đánh giá khả ký sinh chủng Paecilomyces spp 28 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 34 2.2 Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 34 2.2.1 Thiết bị - hóa chất 34 2.2.1.1 Thiết bị 34 2.2.1.2 Hóa chất 34 2.2.2 Vật liệu 35 2.2.3 Các môi trường sử dụng 35 2.2.3.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) 35 2.2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin casein làm chất 35 2.2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất 36 2.2.3.4 Môi trường Czapeck - Dox 36 2.2.3.5 Môi trường Malt agar 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phân lập nấm Paecilomyces spp 37 2.3.1.1 Phân lập nấm Paecilomyces spp từ chế phẩm 37 2.3.1.2 Phân lập nấm Paecilomyces spp từ bọ phấn trắng 37 2.3.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào Peacilomyces spp 38 2.3.2.1 Xác định hoạt tính enzyme chitinase 38 2.3.2.2 Xác định hoạt tính enzyme protease 38 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường đến phát triển của nấm 39 2.3.3.1 Ảnh hưởng pH đến phát triển nấm Paecilomyces 39 2.3.3.2 Khảo sát phát triển nấm Paecilomyces spp môi trường khác 40 2.3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng đến phát triển nấm Paecilomyces spp 41 2.3.4 Đánh giá khả ký sinh bọ phấn chủng Paecilomyces sp1 sp2 41 2.3.5 Đánh giá khả ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp .42 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 42 ii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Phân lập nấm 44 3.1.1 Phân lập nấm có nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất 44 3.1.2 Phân lập nấm Paecilomyces sp2 45 3.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm Paecilomyces phân lập 46 3.3 Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả đối kháng tuyến trùng bọ phấn .50 3.3.1 Khả tổng hợp enzyme protease chủng nấm Paecilomyces50 3.3.2 Khả tổng hợp enzyme chitinase chủng nấm Paecilomyces sp1 sp2 52 3.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường phát triển nấm 54 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến phát triển nấm chủng nấm Paecilomyces spp 54 3.4.1.1 Ảnh hưởng pH lên phát triển nấm Paecilomyces sp1 54 3.4.1.2 Ảnh hưởng pH lên phát triển nấm Paecilomyces sp2 56 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy khác đến phát triển nấm Paecilomyces spp 58 3.4.2.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy khác đến phát triển nấm Paecilomyces sp1 58 3.4.2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy khác đến phát triển nấm Paecilomyces sp2 61 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến phát triển nấm 64 3.4.3.1 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến phát triển nấm Paecilomyces sp1 .64 3.4.3.2 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến phát triển nấm Paecilomyces sp2 .66 3.5 Khả ký sinh bọ phấn chủng Paecilomyces sp1 sp2 68 3.6 Khả ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp chủng nấm Paecilomyces 70 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1 Kết luận .72 4.2 Đề nghị .72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato D - Glucose Agar SB: Sabouraud + KC MA: Malt CZA: Czapeck - Dox iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG STT BẢNG 1.1 NỘI DUNG Hiệu phòng trừ TRANG chủng nấm 29 - 31 Paecilomyces spp tuyến trùng hại thực vật 3.1 So sánh hình thái chủng nấm Paecilomyces sp1 45 - 46 3.2 So sánh hình thái chủng nấm Paecilomyces sp2 47 - 48 3.3 Kết sinh tổng hợp enzyme protease chủng 49 nấm Paecilomyces sp1 sp2 3.4 Kết sinh tổng hợp enzyme chitinase 51 chủng nấm Paecilomycessp1 sp2 3.5 Sự ảnh hưởng pH đến đường kính nấm 54 Paecilomyces sp1 qua ngày 3.6 Sự ảnh hưởng pH đến đường kính nấm 56 Paecilomyces sp2 qua ngày 3.7 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phát 58 triển đường kính nấm Paecilomyces sp1 qua ngày 3.8 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phát 61 triển đường kính nấm Paecilomyces sp2 qua ngày 10 3.9 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến phát 63 triển đường kính Paecilomyces sp1 11 3.10 Số liệu phát triển nấm điều kiện 66 v Đồ án tốt nghiệp chiếu sáng qua ngày nuôi cấy 12 3.11 Hiệu lực diệt bọ phấn 67 13 3.12 Đánh giá khả ký sinh tuyến trùng chủng 69 Paecilomycessp1 sp2 DANH MỤC CÁC HÌNH STT HÌNH 1.1 NỘI DUNG Đặc điểm đại thể Paecilomyces spp TRANG Đặc điểm vi thể Paecilomyces spp 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 Cấu tạo hóa học độc tố paecilotoxin Bio Nematon - Sản phẩm công ty T.Stanes có khả trừ tuyến trùng Sản phẩm trừ bọ phấn 16 17 Sự ảnh hưởng nhiệt độ môi trường đến phát triển tản nấm Paecilomyces Các giai đoạn vòng đời bọ phấn trắng Đặc điểm tuyến trùng hại rễ quan sát kính hiển vi quang học ×10 vi 19 21 25 Đồ án tốt nghiệp Vòng đời tuyến trùng hại rễ 1.9 27 10 2.1 Chế phẩm xử lý đất 37 11 2.2 Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 38 Dịch chế phẩm trang đĩa PDA nồng độpha loãng 10-4 vào ngày thứ 12 3.1 13 3.2 14 3.3 Sự phân giải casein chủng Paecilomyces sp1 50 15 3.4 Sự phân giải casein chủng Paecilomyces sp2 50 16 3.5 Sự phân giải chitin chủng Paecilomyces sp1 52 17 3.6 Sự phân giải chitin chủng Paecilomyces sp2 52 18 3.7 19 3.8 20 3.9 21 3.10 Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn môi trường PDA Sự phát triển Paecilomyces sp1 mơi trường có pH khác 14 ngày ni cấy Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1 pH môi trường 5, ,7, qua ngày nuôi cấy Nấm Paecilomyces sp2 pH 5,6,7,8 14 ngày sau cấy Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp2 pH mơi trường 5, ,7, qua ngày nuôi cấy vii 43 44 53 54 55 56 Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for dk by dkcs Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 0.000416667 0.000416667 1.00 0.3739 0.00166667 0.000416667 Total (Corr.) 0.00208333 groups Within groups Multiple Range Tests for dk by dkcs Method: 95.0 percent LSD dkcs Count Mean Homogeneous Groups 12h sang/12h toi 1.38333 X toi lien tuc 1.4 X 30 Đồ án tốt nghiệp NGÀY Summary Statistics for dk dkcs Cou Average Standard Coeff nt variation 12h deviation 3.63333 0.0763763 2.1021% of Minim Maxim Ran Stnd um um ge skewness 3.55 3.7 0.15 -0.6613 sang/12h toi toi lien tuc 3.71667 0.0288675 0.776704% 3.7 3.75 0.05 1.22474 Total 3.675 3.75 0.2 0.0689202 1.87538% 3.55 ANOVA Table for dk by dkcs Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 0.0104167 0.0104167 0.1518 0.0133333 0.00333333 groups Within groups Total (Corr.) 0.02375 31 3.13 -1.37459 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for dk by dkcs Method: 95.0 percent LSD dkcs Count Mean Homogeneous Groups 12h sang/12h toi 3.63333 X toi lien tuc 3.71667 X NGÀY 10 Summary Statistics for dk ngay10 dkcs Cou Average Standard Coeff 10 nt 12h deviation variation of Minim Maxim Ran Stnd um um ge skewness 5.86667 0.057735 0.98412% 5.8 5.9 0.1 -1.22474 toi lien tuc 6.1 6.1 6.1 0.0 1.73205 Total 5.98333 0.132916 2.22144% 5.8 6.1 0.3 -0.326494 sang/12h toi 0.0 0.0% 32 Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for dk ngay10 by dkcs 10 Source Sum of Df Mean Squares Between F-Ratio P-Value Square 0.0816667 0.0816667 49.00 0.0022 groups Within 0.00666667 groups 0.0016666 Total (Corr.) 0.0883333 Multiple Range Tests for dk ngay10 by dkcs 10 Method: 95.0 percent LSD dkcs 10 Count Mean Homogeneous Groups 12h sang/12h toi 5.86667 X toi lien tuc 6.1 X 33 Đồ án tốt nghiệp NGÀY 14 Summary Statistics for dk 14 dkcs Cou Averag Standard Coeff of Minim Maxim Ran Stnd 14 nt e deviation variation um um ge skewness 12h 8.1 0.1 1.23457% 8.0 8.2 0.2 0.0 toi lien tuc 8.25 0.05 0.606061% 8.2 8.3 0.1 0.0 Total 8.175 0.108397 1.32596% 8.3 0.3 -0.794947 sang/12h toi 8.0 ANOVA Table for dk 14 by dkcs 14 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 0.03375 0.03375 0.0808 0.025 0.00625 groups Within groups Total (Corr.) 0.05875 34 5.40 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for dk 14 by dkcs 14 Method: 95.0 percent LSD dkcs 14 Count Mean Homogeneous Groups 12h sang/12h toi 8.1 toi lien tuc 8.25 X X 35 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC G: Đường kính nấm (d), đường kính vòng phân giải chitin (D) tỉ lệ D/d chúng Paecilomyces sp1 sp2 Paecilomyces sp1 Thời gian nuôi cấy Đường nấm 24 48 72 96 kính Paecilomyces sp2 Đường kính vòng phân giải chitin Đường nấm kính Đường vòng phân giải chitin 0,5 0,7 1,4 0,5 0,6 1,4 0,5 0,6 1,2 0,6 1,7 0,9 2,4 0,6 1,7 0,9 2,5 0,7 1,7 0,9 2,4 1,3 2,8 1,4 1,3 2,8 1,4 1,4 2,8 1,4 2,6 1,7 2,9 2,1 3,4 1,7 2,1 3,4 1,6 2,7 2,1 3,4 36 kính Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC H: Đường kính nấm (d), đường kính vòng phân giải casein (D) tỉ lệ D/d chúng Paecilomyces sp1 sp2 Paecilomyces sp1 Thời gian nuôi cấy Đường nấm 24 48 72 96 kính Paecilomyces sp2 Đường kính vòng phân giải casein Đường nấm kính Đường vòng phân giải casein 0,6 1.3 0,6 1,1 0,6 1.2 0,6 1,3 0,6 1.2 0,6 1,2 0.8 1.3 0,8 1,4 0.7 1.2 0,9 1,5 0.7 1.4 1,7 1.5 1,5 2,2 1.5 2.1 1,4 1.6 2.2 1,4 2,1 1.8 2.2 2,2 2,9 1.8 2.4 2,3 1.8 2.3 2,2 2,8 37 kính Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC I: Sự ảnh hưởng pH đến phát triển chúng Paecilomyces sp1 sp2 Thời Đường gian Paecilomyces sp1 giá trị pH Paecilomyces sp1 giá trị pH nuôi khác cấy pH pH pH pH pH pH pH pH 1.1 1.05 1.1 0.9 1.3 1.3 1.2 1.4 1.05 1.05 1.1 1.25 1.3 1.2 1.4 1.05 1.1 0.9 1.45 1.3 1.35 1.3 2.1 2.15 2.15 1.8 2.6 2.4 2.5 2.8 2 2.1 1.8 2.5 2.6 2.5 2.7 1.95 1.95 1.8 2.6 2.6 2.6 2.7 2.9 3 2.4 3.7 3.6 3.6 3.8 2.7 2.9 2.9 2.5 3.65 3.6 3.55 3.65 2.6 2.9 2.9 2.4 3.8 3.7 3.75 3.7 4.1 4.1 4.2 3.4 4.8 4.8 5.1 3.7 3.6 3.5 3.5 5 4.9 3.1 3.8 3.8 3.3 5 5.1 10 4.95 4.1 6.2 6.2 6.25 ngày 4.5 4.3 4.1 6.25 6.1 6.2 6.4 ngày ngày kính tản nấm (cm) Đường kính tản nấm (cm) khác 38 Đồ án tốt nghiệp 12 ngày 14 ngày 3.6 4.6 4.6 3.8 6.2 5.95 6.25 6.25 5.85 5.8 4.7 7.4 7.5 7.3 7.5 5.4 4.6 4.6 7.4 7.3 7.4 7.35 5.3 5.3 4.5 7.3 7.3 7.3 7.4 6.6 6.5 6.7 5.5 8.4 8.6 8.3 8.5 6.3 5.7 5.2 5.4 8.5 8.5 8.5 8.4 4.5 5.9 5.2 8.3 8.4 8.5 8.5 39 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC J: Sự ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phát triển chúng Paecilomyces sp1 sp2 Đường kính tản nấm (cm) Thời Paecilomyces sp1 môi trường gian khác Đường kính tản nấm (cm) Paecilomyces sp1 mơi trường khác nuôi CZAPE PD MAL CZAPECK SABOUR A T - DOX AUD 1.3 1.4 1.1 1.1 1.35 1.4 1.4 1.4 1.4 1.2 1.2 1.4 1.3 0.9 1.4 1.3 1.4 1.1 1.1 1.35 1.4 1.3 2.3 2.6 2.1 2.3 2.45 2.4 1.9 2.4 2.5 2.5 2.1 2.4 2.5 2.4 1.8 2.45 2.3 2.5 2.1 2.2 2.4 2.4 2.3 3.3 3.7 3.3 3.6 3.5 2.9 3.5 3.5 3.7 3.1 3.5 3.7 3.7 3.5 3.3 3.6 2.9 3.3 3.65 3.6 2.8 3.5 4.5 4.9 4.4 4.7 4.7 3.7 4.6 ngày 4.6 4.7 4.6 4.8 4.8 3.8 4.6 cấy ngày 40 PDA MALT CK DOX - SABOU RAUD Đồ án tốt nghiệp 10 ngày 12 ngày 14 ngày 4.4 4.6 3.95 4.4 4.7 4.7 3.7 4.6 5.6 5.4 5.9 5.9 4.7 5.7 5.7 5.9 5.5 6 4.8 5.7 5.6 5.9 4.9 5.6 5.8 5.8 4.6 5.8 6.6 5.9 6.6 7 5.6 6.7 6.7 6.9 5.9 6.3 7.1 7.2 5.8 6.7 6.5 6.9 5.9 6.7 7 5.6 6.8 7.6 6.7 7.6 8.1 8.1 6.8 7.8 7.7 6.9 7.2 8.1 8.3 6.8 7.9 7.4 7.9 6.8 7.2 8 6.7 7.9 41 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC K: Sự ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến phát triển chúng Paecilomyces sp1 sp2 Đường kính tản nấm (cm) Đường kính tản nấm (cm) Paecilomyces sp1 điều Paecilomyces sp2 điều Thời gian nuôi kiện chiếu sáng cấy 12 sáng/ 12 tối ngày ngày kiện chiếu sáng Tối liên tục 12 sáng/ 12 tối Tối liên tục 1.2 1.25 1.4 1.4 1.2 1.25 1.35 1.4 1.25 1.2 1.4 1.4 1.85 2.4 2.45 1.95 1.95 2.4 2.5 1.75 1.9 2.35 2.4 2.1 2.6 3.7 3.7 2.4 2.6 3.65 3.75 2.2 2.6 3.55 3.7 3.2 3.4 4.7 4.8 3.5 3.35 4.6 4.8 3.2 3.35 4.6 4.7 42 Đồ án tốt nghiệp 10 ngày 12 ngày 14 ngày 4.9 4.75 5.9 6.1 5.1 5.1 5.8 6.1 5.1 5.5 5.9 6.1 6.1 6.2 7.1 7.1 6.2 6.1 7.1 7.1 6.1 7.1 6.5 6.6 8.2 8.25 6.4 6.5 8.1 8.3 6.4 6.5 8.2 PHỤ LỤC L: Khả kí sinh bọ phấn Paecilomyces sp2 Nghiệm thức Đối chứng Thí nghiệm Tỉ lệ kí sinh qua ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 0.33 0.43 0.57 0.73 0.30 0.40 0.60 0.70 0.23 0.37 0.60 0.73 0.50 0.67 1.00 1.00 0.40 0.50 0.93 1.00 0.43 0.50 0.90 1.00 43 Đồ án tốt nghiệp 44 ... 37 2.3.1 Phân lập nấm Paecilomyces spp 37 2.3.1.1 Phân lập nấm Paecilomyces spp từ chế phẩm 37 2.3.1.2 Phân lập nấm Paecilomyces spp từ bọ phấn trắng 37 2.3.2 Xác định khả sinh enzyme... trên, sinh viên định chọn nghiên cứu đề tài: "Phân lập nấm Paecilomyces spp xác định số đặc điểm sinh học, khả phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng chủng thu nhận được" Mục đích nghiên cứu Phân lập. .. phân lập − Đánh giá khả ký sinh bọ phấn tuyến trùng nấm Paecilomyces spp phân lập Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1 Phân lập tuyển chọn nấm Paecilomyces spp 1.1.1 Giới thiệu nấm thuộc chi Paecilomyces