BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62 64 01 02 NGUYỄN THỊ YẾN MAI NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM RUỘT DO PARVOVIRUS TRÊN CHÓ TẠI MỘT SỐ TỈNH THÀNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ, 2020 i CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Ngọc Bích Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc ngày tháng năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam ii DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Thị Yến Mai, Trần Ngọc Bích, Phạm Thế Lâm, Nguyễn Phúc Khánh 2016 Bệnh Parvovirus chó Phòng mạch Chi cục Thú y thành phố Cần Thơ Tạp chí NN&PTNT số 11/2016, trang 151-155 Nguyễn Thị Yến Mai, Trần Ngọc Bích, Trần Văn Thanh, 2018 Tình hình bệnh viêm ruột Parvovirus chó Phòng mạch thú y tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp Thành phố Cần Thơ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 54 (Số CĐ Nông nghiệp), trang 136142 Nguyễn Thị Yến Mai, Trần Ngọc Bích, Trần Văn Thanh, 2018 Tình hình bệnh viêm ruột Parvovirus chó Bệnh xá thú y trường đại học Cần Thơ Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y tập XXV Số 4, trang 36-41 Trần Văn Thanh, Trần Ngọc Bích, Thái Quốc Hiếu, Nguyễn Thị Yến Mai, 2018 Tình hình viêm ruột Parvovirus chó Chi cục Chăn nuôi Thú y Tiền Giang Tạp chí NN&PTNT số 24/2018 trang 102-107 Keovongphet Phuthavong, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Thị Yến Mai, Trần Văn Thanh, 2018 Khảo sát bệnh viêm ruột Parvovirus chó Bệnh xá Thú y Trường Đại học Cần Thơ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 54 (Số CĐ Nông nghiệp), trang 51-55 iii Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết luận án Bệnh viêm ruột Canine Parvovirus type (CPV-2) gây chó bệnh truyền nhiễm cấp tính (Kelly 1978; Appel et al., 1979; Hoelzer et al., 2008) CPV-2 coi mối đe dọa chó từ sau cai sữa đến sáu tháng tuổi Tuy nhiên, đợt bùng phát bệnh viêm ruột tử vong chó trưởng thành CPV-2 gây ghi nhận (Decaro et al., 2008) Bệnh xảy tất giống chó, lứa tuổi khơng phân biệt giới tính (Castro et al., 2007; Gombac et al., 2008) Bệnh diễn tiến nhanh, làm chủ nuôi chó khó phát sớm, phát chó bệnh nặng khó điều trị Các triệu chứng bệnh gồm sốt, nôn mửa, tiêu chảy phân lỏng có lẫn máu tươi với mùi khó chịu dẫn đến chó nhiều máu, nhiều nước chất điện giải, rối loạn chuyển hố, trụy tim mạch, mê chết (Sherding, 2000; Joshi et al., 2001; Ramprabhu et al., 2002; Miranda et al., 2016) Theo Chi cục Chăn nuôi Thú y thành phố Cần Thơ, Đồng Tháp Tiền Giang Bến Tre, Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) (12/2018), nhu cầu nuôi thú cưng người dân ngày cao; chó lồi vật người dân ưa chuộng nuôi làm thú cưng Đối với người cao tuổi, người độc thân neo đơn, trẻ con,… thân thiện xem thú cưng bầu bạn ngày, chí có xem thú cưng thành viên gia đình Mặc dù tỷ lệ bệnh viêm ruột CPV-2 chó 43,30% (Dung Nguyen Van et al., 2017) tỷ lệ điều trị khỏi triệu chứng bệnh cao 86,30% (Lê Minh Thành, 2009) Nhưng thú cưng bệnh, ngày điều trị chưa khỏi không điều trị khỏi bệnh, ngày không tránh khỏi làm chủ nuôi lo lắng, sa sút tinh thần, Tuy nhiên, tại, chưa có nghiên cứu bệnh Pavovirus phạm vi rộng cấp khu vực khu vực ĐBSCL Do vậy, việc nghiên cứu bệnh khu vực ĐBSCL cần thiết giúp cho công tác phòng can thiệp bệnh chủ động nhằm giảm thiệt hại kinh tế đặc biệt hạn chế tổn thất tình cảm người thú cưng Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu bệnh viêm ruột Parvovirus chó số tỉnh thành ĐBSCL tiến hành 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Giải trình tự, định genotype, lập phát sinh loài, xác định tỷ lệ nhiễm bệnh viêm ruột CPV-2 chó, đánh giá độ tương đồng đặc điểm di truyền học phân tử genotype CPV-2 gây bệnh với genotype CPV-2 vaccine ngân hàng gene; đánh giá hiệu điều trị khả bảo hộ vaccine phòng bệnh CPV-2, nhằm giúp cho ngành thú y có định hướng can thiệp khắc phục triệu chứng bệnh, sản xuất sử dụng vaccine phòng, chống bệnh viêm ruột CPV-2 đàn chó thuộc khu vực ĐBSCL đạt hữu hiệu 1.3 Những điểm luận án Đây cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách bản, có hệ thống, phạm vi rộng, cấp khu vực bệnh viêm ruột CPV-2 chó ni rộng rãi số tỉnh thành thuộc khu vực ĐBSCL Từ đó, lập phát sinh lồi, xác định tỷ lệ nhiễm bệnh viêm ruột CPV-2 chó lưu hành genotype CPV-2 gây bệnh Đánh giá độ tương đồng đặc điểm di truyền học phân tử genotype CPV-2 thực địa với genotype CPV-2 vaccine ngân hàng gene đánh giá khả bảo hộ vaccine phòng bệnh CPV-2 chó lưu hành số tỉnh thành thuộc ĐBSCL 1.4 Ý nghĩa thực tiễn khả ứng dụng luận án Kết nghiên cứu luận án nguồn tài liệu Việt Nam bệnh viêm ruột CPV-2 chó phạm vi rộng số tỉnh thành thuộc ĐBSCL Từ đó, hỗ trợ tích cực cho nhà thú y khu vực công tác chế tạo vaccine phòng bệnh, chẩn đốn, tiên lượng, điều trị bệnh, đồng thời làm sở khoa học cho nghiên cứu sau Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung 1: Xác định tỷ lệ nhiễm bệnh viêm ruột CPV-2 chó đến khám điều trị số Phòng mạch Thú y tỉnh thành ĐBSCL 3.1.1 Đối tượng thí nghiệm: đối tượng nghiên cứu 380 chó có triệu chứng ói, tiêu chảy, tiêu chảy phân có lẫn máu Lập phiếu theo dõi bệnh án theo dõi tuổi, giới tính, giống, theo tiêm phòng 3.1.2 Số lượng mẫu khảo sát: 380 mẫu từ Phòng mạch Thú y thành phố Cần Thơ, Tiền Giang, Đồng Tháp Bến Tre (mỗi tỉnh thành chọn 02 phòng mạch), thực lấy mẫu theo công thức Thrusfiel (1995): P (1-P) 0,433 (1- 0,433) N = 1,962 = 377,262 n = (z)2 x 0,05 d2 Ghi chú: n: dung lượng mẫu cần có z: tương ứng với độ tin cậy kết ước tính (z=1.96 với độ tin cậy 95%) P: tỷ lệ ước tính d: mức khác biệt tối đa (không 5%) tỷ lệ bệnh quan sát tỷ lệ bệnh có thật Số mẫu thực thí nghiệm trình bày qua Bảng 3.1 Bảng 3.1: Số mẫu thực STT Địa điểm Số mẫu Thành phố Cần Thơ 101 Đồng Tháp 90 Tiền Giang 97 Bến Tre 92 Tổng 380 3.1.3 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang, tiên cứu phân tích Tiến hành thu thập mẫu phân chó bệnh có triệu chứng ói, tiêu chảy Phòng mạch Thú y tỉnh thành để xác định dương tính với bệnh viêm ruột CPV-2 test kít Antigen Rapid CPV Cơng ty Bionote Mỹ Tiến hành theo dõi, giám sát ghi nhận q trình phòng bệnh trị bệnh Hàng ngày trước cấp thuốc, tiến hành khảo sát ghi nhận thân nhiệt, tình trạng tiêu chảy, tình trạng nước, máu, trạng thái phân,… tiên lượng tiến triển bệnh lập phiếu theo dõi bệnh án cho đối tượng, sau tiến hành cấp thuốc điều trị hỗ trợ, liệu trình điều trị đến ngày 3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột theo lứa tuổi, giới tính, giống theo tiêm phòng; tần suất xuất triệu chứng lâm sàng điển hình hiệu điều trị triệu chứng bệnh viêm ruột CPV-2 chó điều trị Phòng mạch Thú y tỉnh thành nêu 3.2 Nội dung 2: Xác định genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó đến khám điều trị số Phòng mạch Thú y tỉnh thành ĐBSCL 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm: chọn 80 mẫu có kết dương tính với CPV-2 nội dung 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu: thu 80 mẫu phân từ 80 cá thể chó có kết dương tính rõ với CPV-2 nội dung Sau chọn tỉnh thành 20 mẫu (có thời gian xuất vạch hồng vị trí C sớm phút sau nhỏ dung dịch mẫu vào test thử có vạch màu hồng rõ nét) tiến hành ly trích DNA, thực phản ứng PCR cặp mồi VP2 GMCOM (Gurpreet Kaur et al., 2015) trình bày qua Bảng 3.2 Bảng 3.2: Cặp mồi VP2 GMCOM (Gurpreet Kaur, 2015) Tên mồi Số ký hiệu Genbank Trình tự (5’-3’) VP2 GGTCAACCTGCTGTCAGAAA GMCOMF VP2 AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCAT GMCOMR Chiều dài sản phẩm Vị trí genome 2816-2835 M19296.1 4525-4503 1710 bp Điều kiện phản ứng: 95oC phút, 95oC 30 giây, 58oC 30 giây, 72oC phút chu kỳ lặp lại 35 lần, cuối 72oC phút Sau phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,5% phương pháp điện di sản phẩm DNA tinh gửi đến Công ty TNHH Phù Sa Biochem để giải mã trình tự gene VP2 (bằng phương pháp Sanger hệ thống ABI 3130 (Mỹ) kiểm tra trình tự thu nhận phần mềm BioEdit) Khi có kết giải trình tự gene CPV-2, tiến hành đối chiếu trình tự gene CPV-2 mẫu giải trình tự theo cặp mồi so sánh với vị trí nucleotide mẫu đối chứng để xác định CVP-2, CPV-2a CPV-2b 3.2.3 Chỉ tiêu theo dõi: xác định type CPV-2 genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó: CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c, new CPV-2a new CPV-2b đến khám điều trị Phòng mạch Thú y thành phố Cần Thơ, Đồng Tháp, Tiền Giang Bến Tre 3.3 Nội dung 3: Xác định đánh giá độ tương đồng đặc điểm di truyền học phân tử genotype CPV-2 thực địa (ĐBSCL) với genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó ngân hàng gene (Genbank), với genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó vaccine ngân hàng gene NCBI 3.3.1 Đối tượng thí nghiệm: chọn 32 mẫu đại diện có kết rõ, đẹp nội dung cho tỉnh thành ĐBSCL (mỗi tỉnh mẫu) 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu: sau giải trình tự mẫu nghiên cứu, trình tự hồn chỉnh đọc xử lý phần mềm Bioedit 7.0.5.3, file chứa trình tự đại diện cho type gồm tất genotype CPV-2 (CPV-2a, CPV-2b, CPV2c), genotype CPV-2 gốc genotype CPV-2 gần thu thập từ ngân hàng gene NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov/genbank/) Các trình tự xếp toàn (Global alignment) phần mềm Clustal-W 2.0.11 Đoạn CPV-2 tất trình tự, sau xếp xuất dạng file fasta dùng để vẽ phát sinh loài phần mềm MEGA Cây phát sinh loài vẽ phương pháp Neighbour Joining với mơ hình biến đổi nucleotide (substitution model) Maximum Composite Likelihood 1000 lần lấy mẫu có hồn lại (Boostrap relication) Tỷ lệ phần trăm lần xuất nhóm tổng số lần lấy mẫu có hồn lại, số cho thấy mức độ tin cậy (Bootstrap support value) nhóm Phần trăm khác biệt trình tự nucleotide CPV-2 nhân từ mẫu trình tự tham khảo tính phần mềm MEGA 6, từ xác định khoảng cách hệ phát sinh loài 3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi: xác định đánh giá độ tương đồng đặc điểm di truyền học phân tử genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó số tỉnh thành ĐBSCL với genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó ngân hàng gene (Genbank); với genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó vaccine ngân hàng gene NCBI 3.4 Nội dung 4: Đánh giá khả bảo hộ loại vaccine Parvovirus chó lưu hành số tỉnh thành ĐBSCL 3.4.1 Đối tượng thí nghiệm: chó giống ngoại giống nội từ tuần tuổi khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vaccine Parvovirus Các chó chó mẹ tiêm phòng vaccine phòng bệnh viêm ruột CPV-2 3.4.2 Bố trí thí nghiệm: 15 chó giống ngoại 15 chó giống nội nêu thực tiêm loại vaccine chọn (có ký hiệu giải trình tự V1, V2 V3 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu: chó giống nội giống ngoại nêu chăm sóc, ni dưỡng, phòng trị bệnh suốt thời gian nghiên cứu (chỉ khác loại vaccine phòng bệnh) Tiêm vaccine lần lúc tuần tuổi, tiêm lặp lại lần hai sau lần tuần (theo khuyến cáo nhà sản xuất) Tiến hành lấy mẫu máu thí nghiệm (mỗi chó từ 1-2 ml máu) thời điểm trước tiêm ngừa vaccine; sau tiêm vaccine lặp lại lần hai: tháng, tháng, tháng, tháng 12 tháng, ly tâm (3000 vòng/phút) phút trích lấy huyết (bảo quản nhiệt độ âm 20oC) Sau tiến hành xác định hàm lượng kháng thể kít ELISA (Asan Easy Test ® CPV Ab) Hàn Quốc 3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi: so sánh khả bảo hộ loại vaccine phòng bệnh CPV-2 chó lưu hành số tỉnh thành ĐBSCL theo nhóm chó giống nội, nhóm chó giống ngoại 3.5 Phương pháp phân tích số liệu: số liệu thơ xử lý tính tốn phần mềm Microsoft Excel 2010 (để tính tốn số liệu tổng, tỷ lệ phần trăm, ) số liệu tổng hợp báo cáo xử lý phép thử Chi bình phương (χ2) ANOVA two-way anlysis of variance chương trình thống kê Minitab 16.0 Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định tỷ lệ nhiễm bệnh viêm ruột CPV-2 chó đến khám điều trị số Phòng mạch Thú y tỉnh thành ĐBSCL 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột trình bày qua Bảng 4.1 Bảng 4.5: Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột theo tiêm phòng Số mẫu dương Số mẫu quan sát Tiêm phòng tính với CPV-2 Tỷ lệ (%) (n=380) (n=123) Chưa tiêm phòng 281 109 38,79 Có tiêm phòng 99 14 14,14 (P0,05) Kết điều trị triệu chứng bệnh viêm ruột CPV-2 chó bình qn tỉnh thành 85,37% 4.2 Xác định genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó đến khám điều trị số Phòng mạch Thú y tỉnh thành ĐBSCL Tỷ lệ genotype CPV-2 trình bày qua Bảng 4.8 11 Bảng 4.8: Kết xác định genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó (CPV -2a, CPV-2b, CPV-2c, New CPV-2a New CPV-2b) Tổng số mẫu Tổng số mẫu Kiểu gene CPV-2 Tỷ lệ (%) xét nghiệm dương tính CPV -2a 80 01 1,25 CPV -2b 80 0 CPV -2c 80 79 98,75 New CPV-2a 80 0 New CPV-2b 80 0 (P0,05 Ghi chú: KTBH: Kháng thể bảo hộ; HLKT: Hàm lượng kháng thể CPV-2 Qua Bảng 4.10 cho thấy hàm lượng kháng thể tạo qua 01, 03, 06, 09 12 tháng sau tiêm phòng loại vaccine theo nhóm chó giống nội theo nhóm chó giống ngoại khơng có khác biệt thống kê (P>0,05) Qua kết cho thấy khả đáp ứng miễn dịch vaccine phòng bệnh CPV-2 khơng phụ thuộc vào nhóm giống chó Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết khảo sát, phân tích ứng dụng rút kết luận sau: CPV-2 nguyên nhân quan trọng gây bệnh viêm ruột chó khu vực Đồng sơng Cửu Long, chiếm tỷ lệ trung bình 32,37% 22 P> 0,05 Bệnh xảy nhiều chó có độ tuổi từ đến tháng tuổi (49,65%), sau giảm dần qua tháng tuổi thấp độ tuổi >6 tháng tuổi (10,42%) Khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó theo giới tính giống (nhóm chó giống nội nhóm chó giống ngoại) Chó tiêm ngừa vaccine phòng bệnh tỷ lệ bệnh thấp so với chó khơng tiêm ngừa vaccine (14,14% so với 38,79%) Bệnh phát sớm, điều trị kịp thời tỷ lệ phục hồi triệu chứng bệnh cao (85,37%) Genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó lưu hành khu vực ĐBSCL genotype CPV-2c chiếm tỷ lệ 98,75%; genotype CPV-2a 1,25%; chưa phát genotype CPV-2b, genotype new CPV-2a genotype new CPV-2b Có tương đồng cao đặc điểm di truyền học phân tử genotype CPV-2 nghiên cứu với nhau; với genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó ngân hàng gene (Genbank), với genotype CPV-2 gây bệnh viêm ruột chó vaccine ngân hàng gene NCBI Lập phát sinh loài genotype CPV-2 khu vực ĐBSCL Các genotype CPV-2c nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với genotype SD-14-12 (KR611522.1) YANJI-1 (KP749854.1) xuất phát từ Trung Quốc Hàn Quốc Genotype TG40 Tiền Giang xác định genotype CPV-2a nằm chung phân nhóm với genotype CPV new 2a từ nước Uruguay: UY306 (KM457135.1), UY243 (KM457102.1), UY364 (KM457143.1); Trung Quốc: CPV/CN/SD9/2014 (KR002802.1),CPV/CN/SD18/2014 (KR002804.1), SC02/2011 (JX660690.1) Cả ba loại vaccine phòng bệnh CPV-2, lưu hành khu vực ĐBSCL có thời gian bảo hộ 12 tháng sau tiêm phòng, với tỷ lệ bảo hộ 100%, (lần lượt hiệu giá kháng thể V1: 224, V2: 225 V3 227,5 HI titer) 23 5.2 Đề nghị Các phòng mạch Thú y nên chẩn đoán sớm, áp dụng liệu pháp điều trị bệnh kịp thời, cấp nước điện giải, sử dụng kháng sinh chống phụ nhiễm, cầm máu, tăng sức kháng bệnh phục hồi cao Trong ni chó ngồi việc chăm sóc ni dưỡng tốt, thực tiêm vaccine phòng bệnh biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh viêm ruột CPV-2 gây chó Định kỳ, nghiên cứu lại tình hình nhiễm bệnh viêm ruột CPV-2 gây đàn chó khu vực đột biến genotype CPV-2 thực địa phức tạp Căn phát sinh loài nhà sản xuất vaccine nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh CPV-2 gây bệnh dàn chó ni khu vực ĐBSCL./ 24 ... Xác định tỷ lệ nhiễm bệnh viêm ruột CPV-2 chó đến khám điều trị số Phòng mạch Thú y tỉnh thành ĐBSCL 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột trình bày qua... nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột theo giới tính số tỉnh thành ĐBSCL khơng có ý nghĩa thống kê (P>0,05) 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột theo giống Tỷ lệ nhiễm CPV-2 chó bệnh viêm ruột theo... phòng bệnh CPV-2 chó lưu hành số tỉnh thành thuộc ĐBSCL 1.4 Ý nghĩa thực tiễn khả ứng dụng luận án Kết nghiên cứu luận án nguồn tài liệu Việt Nam bệnh viêm ruột CPV-2 chó phạm vi rộng số tỉnh thành