ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -*** - VŨ QUANG THẮNG NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT PROTODIOSCIN TỪ CÂY BẠCH TẬT LÊ (Tribulus terrestris L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -*** - VŨ QUANG THẮNG NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT PROTODIOSCIN TỪ CÂY BẠCH TẬT LÊ (Tribulus terrestris L.) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM HƢƠNG SƠN TS LÊ HỒNG ĐIỆP Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học thực nghiệm thầy cô Khoa Sinh học giảng dạy truyền đạt kiến thức cho năm tháng học tập nghiên cứu trƣờng Tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Hƣơng Sơn – Phó viện trƣởng, Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học Cơng nghệ, ngƣời hƣớng dẫn tơi Cơ giúp định hƣớng nghiên cứu dành nhiều tâm huyết, thời gian, công sức, động viên tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Hồng Điệp, ngƣời đồng hƣớng dẫn Thầy ngƣời truyền dạy kiến thức cho tôi, giúp định hƣớng nghiên cứu quan tâm tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Đốc, Khoa Hóa Sinh, Trung tâm Kiểm sốt Bệnh tật tỉnh Quảng Ninh, tạo điều kiện tốt cho hồn thành khóa học Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè ngƣời thân, ln bên, động viên cho tơi có thêm nghị lực để vƣợt qua lúc khó khăn suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 11 năm 2018 Học viên Vũ Quang Thắng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Bạch tật Lê (Tribulus terrestris L.) 1.1.1 Đặc điểm hình thái, phân loại phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học tác dụng dƣợc lí Bạch Tật Lê 1.2 Protodioscin 14 1.2.1 Cấu trúc Protodioscin 14 1.2.2 Tác dụng dƣợc lí Protodiscin 15 1.3 Các phƣơng pháp tách chiết hơp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật 22 1.3.1 Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất từ thực vật 22 1.3.2 Tách chiết Protodioscin 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 28 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phƣơng pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch Tật Lê 29 2.2.2 Phƣơng pháp lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch Tật Lê 29 2.2.3 Phƣơng pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch Tật Lê 29 2.2.4 Phƣơng pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin 30 2.2.5 Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn định lƣợng protodioscin 30 2.2.6 Phƣơng pháp thử nghiệm thay đổi hormon sinh dục chuột 31 2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Lựa chọn dung môi điều kiện chiết tổng Bạch Tật Lê 32 3.2 Lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ chiết tổng Bạch Tật Lê 33 3.3 Lựa chọn thời gian chiết tổng Bạch Tật Lê 35 3.4 Nghiên cứu chiết phân đoạn dịch chiết tổng Bạch Tật Lê 37 3.5 Nghiên cứu tách sắc ký làm giàu Protodioscin 38 3.6 Xây dựng quy trình tách chiết Protodioscin quy mơ phòng thí nghiệm 40 3.7 Nghiên cứu thay đổi hormon sinh dục chuột sử dụng dịch chiết chứa Protodioscin từ Bạch Tật Lê 42 CHƢƠNG KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh phƣơng pháp tiền tách chiết 23 Bảng 1.2 So sánh phƣơng pháp tách chiết truyền thống 24 Bảng 1.3 So sánh phƣơng pháp tách chiết đại 25 Bảng 1.4 Dung môi khách dùng chiết xuất nhóm hoạt chất từ dƣợc liệu 26 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết theo dung môi chiết khác (g cao chiết/2kg nguyên liệu, đun hồi lƣu 2h) 33 Bảng 3.2 Hiệu suất chiết theo phƣơng pháp chiết khác (g cao chiết/2 kg nguyên liệu) 34 Bảng 3.3 Hiệu suất chiết theo nhiệt độ chiết khác (g cao chiết/2 kg nguyên liệu) 35 Bảng 3.4 Hiệu suất chiết theo thời gian chiết khác (g cao chiết/2 kg nguyên liệu, đun hồi lƣu với 50% ethanol h) 36 Bảng 3.5 Hiệu suất chiết theo điều kiện khác (g cao chiết/2 kg nguyên liệu) 36 Bảng 3.6 Nồng độ hormon sinh dục chuột bình thƣờng chuột uống chiết xuất chứa protodioscin từ Bạch Tật Lê 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái tồn Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris) Hình 1.2 Đặc điểm hình thái Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris) Hình 1.3 Các loại khung carbon saponin spiroston Bạch Tật Lê Hình 1.4 Các loại khung carbon saponin furostane Bạch Tật Lê Hình 1.5 Một số saponin có hoạt tính sinh học tách chiết từ Bạch Tật Lê Hình 1.6 Cấu trúc hóa học flavonoid tách chiết từ Bạch Tật Lê Hình 1.7 Cấu trúc alkaloid tách chiết từ Bạch Tật Lê Hình 1.8 Cấu trúc hóa học protodioscin 15 Hình 1.9 Cơ chế hoạt động protodioscin cải thiện chức tình dục 19 Hình 2.1 Mẫu Bạch Tật Lêđƣợc phơi khô mẫu khơ 28 Hình 2.2 Đƣờng chuẩn định lƣợng chất chuẩn protodioscin 31 Hình 3.1 Sắc ký mỏng mẫu cao chiết tổng phân đoạn: (1) cao A, (2) cao chiết ethyl acetate, (3) dịch chiết B Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển khai dichloromethane-methanol 1:1 38 Hình 3.2 Sắc ký mỏng mẫu cao B (1), cao C (2) Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển khai ethyl acetate:cồn 20:1 38 Hình 3.3 Sắc ký đồ UV 210nm chất chuẩn protodioscin 39 Hình 3.4 Sắc ký đồ UV 210nm mẫu Bạch Tật Lê thân 39 Hình 3.5 Sắc ký đồ UV 210nm mẫu Bạch Tật Lê 39 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC cao D chứa protodioscin 40 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT kDa kilodalton HepG2 Tế bào ung thƣ gan E coli Escherichia coli S aureus Staphylococcus aureus NO Nitric oxit nmol/L Nanomole/Lite Hormon LH Luteinizing Hormone Hormon FSH Follicle Stimulating Hormone Hormon GnRH Gonadotropin Releasing Hormone DHEA Dehydroepiandrosterone DNA Deoxyribonucleic acid VietGAP Vietnamese Good Agricultural Practices cAMP Cyclic adenosine monophosphate ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch tật lê (Tribulus terrestris) loại thảo dƣợc đƣợc trồng quanh năm khu vực Địa Trung Hải vùng có khí hậu ấm Châu Âu, Châu Á, Mỹ, Châu Phi Australia Từ lâu, loại đƣợc sử dụng y học cổ truyền Trung Quốc, Ấn Độ, Iraq, Bulgari, Nam Phi Iran Bạch tật lê có nhiều thành phần có hoạt chất sinh học nhƣ steroid, saponin, flavonoid, alkaloid, acid béo khơng bão hòa, vitamin, tannin, acid aspartic acid glutamic Trong saponin đƣợc coi thành phần đặc trƣng đƣợc nghiên cứu ứng dụng từ lâu để làm tăng khả sinh sản động vật thí nghiệm ngƣời Cây Bạch tật lê đƣợc dùng điều trị cho bệnh nhân nam giới vơ sinh có tác dụng tăng số lƣợng tinh trùng khả di động tinh trùng Bên cạnh đó, Bạch tật lê làm cải thiện khả cƣơng cứng hành vi tình dục động vật thí nghiệm Các tác dụng Bạch tật lê có chứa thành phần protodioscin saponin tăng hormon sinh dục ảnh hƣởng lên hệ thống sinh sản Protodioscin làm tăng hormon sinh dục testosterone tự máu, dihydrotrestosterone (DHT), dehydroepiandrosterone (DHEA) dehydroepiandrosterone sulfat (DHEAS), đồng thời cân nồng độ estrogen, progesterone pregnenolone Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Nghiên cứu điều kiện tách chiết hoạt chất protodioscin từ Bạch tật lê nhằm tìm hoạt chất sinh học an tồn, hiệu điều trị tăng cƣờng sinh lực nam giới CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Bạch tật lê (Tribulus terrestris L.) 1.1.1 Đặc điểm hình thái, phân loại phân bố 1.1.1.1 Phân loại Chi Tribulus thuộc họ Zygophyllaceae bao gồm khoảng 20 lồi giới, có ba lồi: Tribulus cistoides, Tribulus terrestris, Tribulus alatus xuất phổ biến Ấn Độ Trong số đó, Bạch tật lê (T terrestris) đƣợc sử dụng nhƣ dƣợc liệu quý nhằm hỗ trợ cải thiện sức khỏe ngƣời Bạch tật lê lồi bụi, đƣợc tìm thấy Địa Trung Hải, cận nhiệt đới sa mạc vùng khí hậu tồn giới nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, quốc gia Nam Mỹ, Mexico, Tây Ban Nha, Bulgaria [16] Phân loại Giới: Plantae Phân giới: Phanerogams Phân ngành: Angiospermae Lớp: Dicotyledonae Phân lớp: Polypetalae Dòng: Disciflorae Bộ: Giraniales Họ: Zygophyllaceae Chi: Tribulus Lồi: terrestris Linn [16] 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái phân bố Trên giới Bạch tật lê đƣợc mô tả với đặc điểm nhƣ sau: Thân thấp nhỏ, cao 10-60 cm, tối màu Gốc hình trụ, dài 7-18 cm đƣờng kính 0,3-0,7 cm Lá kép mọc đối từ đến cặp hình elip hình trụ nhiên bất đối xứng Hoa có màu vàng Quả có nhiều hình dạng (tròn, dẹt, năm góc) thƣờng đƣợc bao phủ màu vàng nhạt, có nhiều hạt Rễ xơ, hình trụ, thƣờng phân nhánh, mang số rễ nhỏ có màu nâu nhạt (Hình 1.1) [16] Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC cao D chứa protodioscin bƣớc sóng 210nm Từ kết trên, xác định đƣợc hàm lƣợng protodioscin từ Bạch tật lê 3.6 Xây dựng qui trình tách chiết protodioscin qui mơ phòng thí nghiệm Từ kết thu đƣợc trên, tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất làm giàu protodioscin qui mơ phòng thí nghiệm theo sơ đồ sau: Thuyết minh qui trình: Bƣớc 1: Phần cành Bạch tật lê đƣợc sơ chế phơi khơ bóng râm sau xay thành bột mịn Bƣớc 2: Đun hồi lƣu 950C kg mẫu nguyên liệu bột khô lít ethanol 50% 2h Dịch chiết đƣợc rút kiệt bổ sung lít ethanol 50% vào chiết tiếp Sau lần ngâm chiết nhƣ vậy, dịch chiết đƣợc gom lại, lọc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 210 g cao chiết tổng, ký hiệu cao chiết A Bƣớc 3: Thêm lít nƣớc vào cao chiết A chiết phân bố dung mơi ethyl acetate (1lít x 3lần) Tách loại lớp dung môi hữu cơ, dịch nƣớc đƣợc quay lít để loại bỏ dung môi hữu tồn dƣ thu đƣợc dịch B Bƣớc 4: Lọc dịch B lại bƣớc qua cột diaion HP20 Rửa giải hệ dung môi nƣớc, dung môi ethanol 80% Gom dịch rửa giải ethanol 80% cất loại dung môi thu đƣợc cao chiết C 41 Bƣớc 5: Tách phân đoạn cao chiết C thu đƣợc cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel pha thƣờng, tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ = 1/5 theo khối lƣợng, cột nhồi  10cm dung môi giải hấp lần lƣợt ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol (50:1), ethyl acetate:ethanol (10:1) ethanol 95% Dịch rửa giải từ hệ ethyl acetate:ethanol (10:1) đƣợc gom lại, cất loại hết dung môi đến khô thu đƣợc cao chiết D 42 3.7 Nghiên cứu thay đổi hormon sinh dục chuột sử dụng dịch chiết chứa protodioscin từ Bạch tật lê: Bảng 3.6 Nồng độ hormon sinh dục chuột bình thƣờng chuột sử dụng dịch chiết xuất chứa protodioscin từ Bạch tật lê Nhóm Nhóm I Nhóm sử dụng 43 P (Đối chứng) Nhóm II Nhóm III Nhóm IV Hormon ̅ ± SD ̅ ± SD ̅ ± SD ̅ ± SD LH (IU/L) < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 FSH (IU/L) < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Testosterone (ng/ml) P21 = 0,75 1,83 ± 1,56 9,73±20,76 15,43±18,53 25,03±17,19 P31= 0,03 P41 = 0,03 Từ kết bảng 3.8 ta thấy: nồng độ hai hormon sinh dục FSH LH thấp dƣới ngƣỡng phát nhỏ máy xét nghiệm ( 0,05) Ở hai nhóm lại nhóm III nhóm IV nồng độ hormon sinh dục testosterone máu sau điều trị tuần cao nhóm chứng, nồng độ hormon sinh dục testosterone nhóm điều trị với liều lƣợng 10 mg/kg cao 25,03±17,19 mg/mL Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Khi đánh giá ảnh hƣởng chiết xuất chứa protodioscin từ Bạch tật lê lên nồng độ hormon sinh dục gonatropin thùy trƣớc tuyến yên chúng tơi gặp khó khăn khơng đánh giá đƣợc nồng độ hai hormon sinh dục FSH LH thấp dƣới ngƣỡng phát Lý giải kết Bệnh viện Phụ Sản Trung Ƣơng sử dụng hệ thống để định lƣợng hormon sinh dục với ngƣỡng phát nhỏ FSH LH 0,1 IU/L Cho tới có nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng thực chiết xuất chữa protodioscin từ Bạch tật lê lên hormon sinh dục kết nghiên cứu khác Nghiên cứu Adaay Matta (2012) sử dụng chiết xuất chứa protodioscin từ Bạch tật lê cho thấy nồng độ hormon sinh dục FSH nhóm chuột bình thƣờng 1,34 ± 0,03 mIU/mL nhóm đƣợc cho sử dụng hỗn hợp thức ăn có chứa chiết xuất chữa protodioscin từ Bạch tật lê 1,98 ± 0,01 mIU/mL Giá trị 44 hormon sinh dục LH hai nhóm lần lƣợt 1,57 ± 0,01 mIU/mL 2,17 ± 0,01 mIU/mL [4] Một nghiên cứu khác Moghaddam cộng (2013) sử dụng ELISA kits (Labsystem, Finland) để định lƣợng nồng độ hormon sinh dục gonadotropin máu thu đƣợc kết nhóm chứng khoảng 0,3 mIU/mL, nhóm đƣợc sử dụng tinh chiết chứa protodioscin từ Bạch tật lê 0,271 mIU/mL, giá trị hormon sinh dục LH nhóm đối chứng khoảng 0,2 mIU/mL, nhóm dùng thuốc 0,207 mIU/mL, chuột gây nghiện 0,0125 ± 0,017 mIU/mL [39] Chứng tỏ ngƣỡng phát kit xét nghiệm có giá trị thấp kit xét nghiệm thân ngƣỡng phát kít xét nghiệm khác Nhƣng xét điều kiện kinh phí đề tài điều kiện xét nghiệm Việt Nam chúng tơi chƣa thể sử dụng kit xét nghiệm có ngƣỡng phát thấp chúng tơi hi vọng nghiên cứu sau khắc phục đƣợc nhƣợc điểm Khi đánh giá ảnh hƣởng chiết xuất chứa protodioscin từ Bạch tật lê lên hormon sinh dục testosterone hormon có vai trò quan trọng lên q trình sinh tinh chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.8 Sau tuần cho chuột sử dụng tinh chiết chứa protodioscin từ Bạch tật lê với liều khác 2,5mg/kg; 5,0mg/kg; 10mg/kg chúng tơi thấy so với nhóm khơng đƣợc dùng thuốc hai nhóm dùng liều 5,0mg/kg/ngày 10mg/kg/ngày có nồng độ hormon sinh dục testosterone cao với P