ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN HỮU TUẤN DŨNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ GEL AGAROSECURDLAN MANG THUỐC ETANERCEPT ỨC CHẾ YẾU TỐ HOẠI TỬ KHỐI U TNF-α VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN ĐẠI THỰC BÀO RAW264.7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN HỮU TUẤN DŨNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ GEL AGAROSECURDLAN MANG THUỐC ETANERCEPT ỨC CHẾ YẾU TỐ HOẠI TỬ KHỐI U TNF-α VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN ĐẠI THỰC BÀO RAW264.7 Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Phạm Thị Thu Hường Hà Nội – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, hỗ trợ dẫn tận tình từ phía thầy cơ, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thu Hường, người tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn quan tâm ủng hộ tạo điều kiện nghiên cứu PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, giúp đỡ, động viên tập thể nhóm nghiên cứu bạn sinh viên phòng Sinh học Nano Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym & Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHKHTN); tạo điều kiện thực nghiên cứu liên quan tới thí nghiệm tế bào PGS.TS Nguyễn Lai Thành, Trung tâm Khoa học Sự sống - Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN; hỗ trợ thiết bị chuyên dụng cho tạo phức hệ nanogel môn Khoa học Vật liệu - Khoa Vật lý, Trường ĐHKHTN Tôi vô cảm ơn thầy cô giáo Bộ mơn Hóa sinh thầy thuộc Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu trường Sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình, người thân bạn bè lời cảm ơn chân thành ln động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp Luận văn thực khn khổ kinh phí đề tài Khoa học Công nghệ cấp ĐHQGHN mã số KLEPT.16.01 TS Phạm Thị Thu Hường làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Hữu Tuấn Dũng MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Vai trò TNF-α phản ứng viêm viêm khớp dạng thấp 1.1.1 Yếu tố hoại tử khối u TNF alpha .3 1.1.2 TNF-α bệnh viêm khớp dạng thấp 1.2 Các phƣơng pháp điều trị viêm khớp dạng thấp 1.2.1 Điều trị phương pháp phẫu thuật 1.2.2 Điều trị thuốc chống viêm thuốc giảm đau 1.2.3 Thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp theo chế trung hòa TNF-α 1.3 Các hệ thống mang thuốc hƣớng đích 1.3.1 Hướng đích bị động 1.3.2 Hướng đích chủ động 10 1.3.3 Hệ thống giải phóng thuốc có kiểm sốt 11 1.4 Các vật liệu sử dụng cho hệ thống mang thuốc .12 1.4.1 Agarose 12 1.4.2 Curdlan 12 1.5 Thụ thể Dectin-1 .14 1.6 Kích thƣớc hệ thống mang thuốc 15 1.6.1 Kích thước hệ mang thuốc dạng hạt micro .15 1.6.2 Kích thước hệ mang thuốc dạng nano 15 1.7 Ý tƣởng hệ mang thuốc hƣớng đích chủ động 17 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Vật liệu 19 2.2 Phƣơng pháp .21 2.2.1 Xây dựng quy trình chế tạo phức hệ agarose-curdlan dạng nano 21 2.2.2 Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử 21 2.2.3 Phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) .22 2.2.4 Phương pháp khối phổ hồng ngoại (FTIR) .23 2.2.5 Phương pháp đánh giá khả phân tán phức hệ 24 2.2.6 Phương pháp đo quang phổ Bradford .24 2.2.7 Phương pháp RT-PCR 25 2.2.8 Phương pháp Western-Blotting .25 2.2.9 Phương pháp đánh giá độc tính tế bào sử dụng kit CCK-8 26 2.2.10 Phương pháp đánh giá tính hướng đích sử dụng Boyden-Chamber 28 2.2.11 Phương pháp ELISA 29 2.2.12 Các phương pháp thống kê 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Quy trình chế tạo phức hệ tính chất lý hóa phức hệ 31 3.1.1 Quy trình chế tạo phức hệ .31 3.1.2 Kích thước phức hệ 34 3.1.3 Phân bố kích thước phức hệ .35 3.1.4 Các thành phần hóa học phức hệ .36 3.2 Khả giải phóng thuốc hiệu suất bao gói phức hệ .38 3.3 Khả phân tán phức hệ .40 3.4 Tác động sinh học phức hệ lên tế bào 41 3.4.1 Ảnh hưởng phức hệ lên khả sinh trưởng dòng tế bào 41 3.4.2 Khả biểu Dectin-1 dòng tế bào ni cấy 43 3.4.3 Tính hướng đích phức hệ lên dòng đại thực bào RAW264 44 3.4.4 Thành phần tạo nên khả hướng đích phức hệ lên dòng đại thực bào RAW264.7 46 3.4.5 Khả trung hòa TNF-α phức hệ 49 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Sự kích hoạt đại thực bào biểu TNF-α thơng qua thụ thể TLR4 [56,58] Hình 1.2 Khớp xương người bình thường (Trái) khớp xương bệnh nhân VKDT (Phải) [19] .4 Hình TNF-α chế tác động phản ứng viêm [23] Hình 1.4 Một số loại thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp[66] Hình 1.5 Phức hệ tNG giải phóng ETA phụ thuộc nhiệt độ[21] .10 Hình 1.6 Tác dụng theo thời gian thuốc hòa tan hệ thống bao gói có kiểm sốt [24,31] 11 Hình 1.7 Curdlan [9] 13 Hình 1.8 Đại thực bào biểu thụ thể Dectin-1 [45] 14 Hình 1.9 Mơ hình hoạt động dự kiến phức hệ nanogel mang thuốc ức chế yếu tố hoại tử khối u TNF-α tương tác với đại thực bào 18 Hình 2.1 Đại thực bào RAW264.7 vật kính 10X (ATCC) 19 Hình 2.2 Ngun bào sợi phơi chuột STO (ATCC) .20 Hình 2.3 Nguyên lý phương pháp đo DLS 23 Hình 2.4 Phản ứng WTS-8 kit CCK-8 (Sigma) với tế bào sống [45] 27 Hình 2.5 Quy trình tiến hành thí nghiệm Boyden-Chamber 28 Hình 3.1 Quy trình chế tạo phức hệ nanogel agarose-curdlan mang thuốc Etanercept 32 Hình 3.2 Phức hệ kính hiển vi điện tử (A) SEM, (B) TEM 34 Hình 3.3 Phân bố kich thước phức hệ .35 Hình 3.4 Kết đo khối phổ hồng ngoại hấp thụ (FTIR) mẫu: Đối chứng Agarose (A); Đối chứng Curdlan (B); Mẫu phức hệ ACE (C) 37 Hình 3.5 Khả giải phóng ETA khỏi phức hệ ACE theo thời gian 39 Hình 3.6 Khả phân tán phức hệ dung dịch đệm PBS 1X 40 Hình 3.7 Ảnh hưởng phức hệ lên khả sinh trưởng tế bào RAW264.7 STO .42 Hình 3.8 Biểu Dectin-1 dòng tế bào STO RAW264.7 43 Hình 3.9 Tác dụng hướng đích phức hệ ACE dòng tế bào biểu Dectin-1 (RAW) không biểu Dectin-01 (STO); *P