ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM LÊ THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU THU NHẬN BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN LACTOCOCCUS LACTIS ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số: 60540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2016 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Lại Quốc Đạt TS Nguyễn Quốc Bình Cán chấm nhận xét 1: TS Trịnh Khánh Sơn Cán chấm nhận xét : TS Huỳnh Ngọc Oanh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 07 năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giá luận thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận vãn thạc sĩ) GS.TS Đống Thị Anh Đào TS Trịnh Khảnh Sơn TS Huỳnh Ngọc Oanh PGS.TS Phạm Văn Hừng TS TônNữMinhNguyẹt Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trường Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu cố) CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Thị Huyền MSHV: 7140463 Ngày, tháng, năm sinh: 06/02/1990 Nơi sinh: Gia Lai Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60540101 I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN LACTOCOCCUS LACTIS ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactococcus sp có khả sinh tổng hợp bacteriocin - Thu nhận bacteriocin từ chủng Lactococcus lactis phân lập đuợc - Đánh giá khả kháng khuẩn bacteriocin thu nhận đuợc sữa III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 11/01/2016 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS Lại Quốc Đạt TS Nguyễn Quốc Bình Tp HCM, ngày 11 tháng 07 năm 2016 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) Lời cảm ơn Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học - Truờng Đại học Bách Khoa TP HCM dẫn dắt, dạy, truyền đạt kiến thức bổ ích suốt thời gian tơi học tập, nghiên cứu rèn luyện trường Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo hướng dẫn TS Lại Quốc Đạt TS Nguyễn Quốc Bình tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi thực khóa luận Để hồn thành tốt luận văn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị đồng nghiệp, nhóm nghiên cứu phòng Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm, Trung tâm Công nghệ Sinh học bạn học viên cao học khóa 2014 ln đồng hành, tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Trung tâm Công nghệ Sinh học TPHCM TPHCM, ngày tháng năm 2016 Học viên thực 1.1 Tóm tắt luận văn Bảo quản thực phẩm phương pháp sinh học ngày quan tâm nghiên cứu nhiều Từ nguồn mẫu thực phẩm lên men, tiến hành phân lập, tuyển chọn định danh phương pháp sinh học phân tử chủng vi khuẩn Lactococcus lactis có khả sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn từ mẫu nước lên men dưa cải chua Bacteriocin thô thu nhận từ vi khuẩn Lactococcus lactis subsp lactis môi trường Complex medium Nghiên cứu phương pháp thu nhận hợp chất kháng khuẩn dung môi ethanol với tỷ lệ thích hợp 7:3, dịch bacteriocin thu có hoạt tính kháng khuẩn khoảng 3000IƯ/ml, có khả kháng chủng thị Lactobacillus plantarum, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Dịch bacteriocin thô thu nhận nhạy cảm với enzyme phân hủy protein, bền với pH 4-5, chịu nhiệt tốt, có khả ứng dụng cao bảo quản thực phẩm Food preservation using biological products are increasingly attracting attendtion and well-studied strains of Lactococcus lactis were isolated and identified by molecular biological methods from fermented food samples showed the capable of antimicrobial compounds biosynthesis Bacteriocin production by Lactococcus lactis subsp lactis was studied in fermentation using a complex medium The antimicrobial compounds were obtained by using ethanol with the appropriate ratio 7:3, bacteriocin obtained showed the antibacterial activity of 2000 IU/ml, and the ability of resistant to Lactobacillus plantarum, Bacillus subtillis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Further studies showed that the obtained bacteriocin quite sensitive to proteolytic enzymes, stable at pH 4-5, active at wide range of temperature, promising the widely application in food preservation 1.2 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu thu thập qua thí nghiêm tơi bố trí thực Tơi xin cam đoan thí nghiêm để thu thập số liệu luận văn tơi thực phòng thí nghiệm phòng Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm, Trung tâm Công nghệ Sinh học TPHCM, với hướng dẫn TS Lại Quốc Đạt TS Nguyễn Quốc Bình, giúp đỡ đồng nghiệp, nhóm nghiên cứu phòng thí nghiệm TPHCM, ngày tháng năm 2016 Học viên thực 1.3 MỤC LỤC CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Hợp chất kháng khuẩn (bacteriocin) 2.1.1 Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin 2.2 Cơ chế tác động bacteriocin tế bào vi khuẩn Gram duơng 2.3 Phuơng pháp thu nhận bacteriocin 2.4 ứng dụng bacteriocin 10 2.5 Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacteriocin 12 2.6 Một số vi sinh vật gây hu hỏng thục phẩm 14 2.6.1 Staphylococcus aureus 14 2.6.2 Bacillus cereus 15 2.6.3 Escherichia colỉ 15 2.6.4 Listeria monocỵtogens 16 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.3 Nguyên vật liệu 17 3.4 Phuơng pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Phuơng pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactococcus sp có khả sinh tổng họp chất kháng khuẩn 18 3.4.2 Phuơng pháp thu nhận thu nhận bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactococcus lactis phân lập đuợc 24 3.4.3 Điện di SDS-PAGE 26 3.4.4 Đánh giá khả kháng khuẩn bacteriocin thu đuợc sữa tuơi 26 3.5 Phuơng pháp xử lý số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 4.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactococcus sp có tiềm sinh tổng họp bacteriocin 28 4.1.1 Kốt phân lập tuyển chọn 28 4.1.2 Kết khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng phân lập 30 1.4 4.1.3 Kết khảo sát sơ khả sinh bacteriocin chủng vi khuẩn phân lập ' 31 4.1.4 Kết định danh giải trình tự phuơng pháp sinh học phân tủ .33 4.2 Kết thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn Lactococcus lactis phân lập đuợc 34 4.2.1 Kết thu nhận thu nhận bacteriocin phuơng pháp kết tủa 34 4.2.2 Kết định luợng protein tổng 35 4.2.3 Kết xác định hoạt tính bacteriocin .35 4.2.4 Kết khảo sát số tính chất bacteriocin .35 4.2.5 Kết điện di protein 41 4.2.6 Quy trình thu nhận bacteriocin đề xuất 41 4.3 Kết đánh giá khả kháng khuẩn bacteriocin sữa tuơi 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 1.5 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacteriocin Hình 2.2 Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin Hình 2.3 Cơ chế xâm nhập vào tế bào vi khuẩn bacteriocin Hình 2.4 ứng dụng bacteriocin 10 Hình 2.5 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Lactococcus lactis 13 Hình 4.1 Một số kết kiểm tra sinh lý, sinh hóa chủng phân lập 31 Hình 4.2 Vòng kháng khuẩn dịch bacteriocin với chủng thị 32 Hình 4.3 Kết điện di gel Agarose 1% sản phẩm PCR vùng lóSrRNA 33 Hình 4.6 Vòng kháng khuẩn thể độ bền dịch bacteriocin pH - 36 Hình 4.7 Kết điện di SDS - PAGE 41 Hình 4.8 Quy trình thu nhận bacteriocin 42 1.6 DANH MỤC BẢNG Bảng 2-1 Một số bacteriocin sinh từ vi khuẩn lactic Bảng 3-1 Một số phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn lactic 19 Bảng 3-2 Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng 3-3 Hoạt tính dịch bacteriocin bị xử lý kết hợp pH nhiệt độ 26 Bảng 3-4 Nồng độ bacteriocin thử nghiệm 27 Bảng 4-1 Tổng hợp chủng vi khuẩn lactic phân lập 28 Bảng 4-2 Đặc điểm hình thái 11/31 chủng Lactococcus sp tuyển chọn 29 Bảng 4-3 Kết thử phản ứng sinh hóa chủng tuyển chọn 30 Bảng 4-4 Khả kháng khuẩn 11 chủng vi khuẩn tuyển chọn 31 Bảng 4-5 Đường kính vòng kháng khuẩn bacteriocin thu nhận phương pháp kết tủa ethanol 34 Bảng 4-6 Hàm lượng protein thu từ chủng DTI, DT2 35 Bảng 4-7 Hoạt tính bacteriocin chủng DT1 DT2 35 Bảng 4-8 Sự nhạy cảm bacteriocin với enzyme 35 Bảng 4-9 Khảo sát độ bền pH dịch bacteriocin thu từ chủng DTI, DT2 37 Bảng 4-10 Hoạt tính dịch bacteriocin sau bị xử lý kết hợp pH nhiệt độ 37 Bảng 4-11 Mật độ tế bào vi khuẩn aureus sữa sau bổ sung dịch bacteriocin.43 1.7 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn La Anh, “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chất bào quản sinh học bacteriocin phương pháp vi sinh có ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm”, 2010 Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly, Huỳnh Xuân Phong, “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn” Tạp chi Khoa học, số 19a, trl76-184, 2011 Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình, “Một số tính chất bacteriocin tổng hợp vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi” Tạp chi Khoa học Công nghệ, tập 46, số 6, tr 33-34, 2008 Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình, “Ảnh hường của nguồn c, N, NaCl sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin chủng Lactococus PDD14, PDD2.9 BV20”, Một số tính chất bcteriocin tổng hợp vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi” Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 49, (6), tr 15-23, 2011 Lương Đức Phẩm, “Vi sinh vật bảo quản thực phẩm”, NXB nông nghiệp Hà Nội, 2002 Đỗ Thị Huyền, “Nghiên cứu công nghệ sản xuất sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nisin enterocin) dùng bảo quản nông sản thực phẩm”, 2009 Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tường An, “Thu nhận Bacteriocin phương pháp len men tế bào Lactococcus lactic cố định chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiều”, Tạp phát triển Khoa học Công nghệ, tập 11, số 9, tr.100-108, 2008 Trần Linh Thước /‘Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm”, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội, 2002 Tài liệu tiếng anh A Hurst, “Nisin”, Advances in Applied Microbiology, vol.27, pp:85-123, 1981 Aly, E and Abo-Amer “Characterization of a Bacteriocin-Like inhibitory substance produced by Lactobacillus plantarum isolated from Egyptian homemade Yogurt”, Science Asia, 33, pp 313 - 319 2007 46 Andreja Miklic and Irena Rogelj, “Screening for natural defence mechnisms of Lactococcus lactis strains isolated from traditional starer cultures” International Journal of Food Science & Technology, vol.42, Issue 7, pp.777- 782, July 2007 Angela Faustino Jozalacorrespondenceemail, “Low-cost purification of nisin from milk whey to a highly active product”, Food and Bioproducts Processing, vol.93, pp.l 15-121, January 2015 Antonio Gálvez, Hikmate Abriouel, Rosario Lucas Lopez, Nabil Ben Omar “Bacteriocinbased strategies for food biopreservation” International Journal of Food Microbiology, vol 120, issues 1-2, pp:51-70, 2007 Bailey, F.J and A Hurst, “Preparation of a highly active form of nisin from Streptococcus lactis”, Revue canadienne de microbiologie, 17(1): 61-67,1971 Chan-Ick Cheigha, Hak-Jong Choia, “Influence of growth conditions on the production of a nisin-like bacteriocin by Lactococcus lactis subsp lactis A164 isolated from kimchi”, Journal of Biotechnology, vol 95, Issue 3, pp:225-235, 23 May 2002 Chen, H., and D Hoover, 2003 “Bacteriocins and theừ Food Applications”, Comprehensive reviews in food science and food safely, vol.2, issue 3, pp : 80- 100, 2006 Davis EA, Bevis HE, Delves Broughton J, “Antimicrobial edible packaging based on cellulose ethers, fatty acids and nisin incorporation to inhitbit Listeria innocua and Streptococcus aureus”, Applied and enviroment microbiology, 1991 10 D.G.Hoover, “Bacteriocins: Activities and applications Encyclopedia of Microbiology”, Academic Press, vol, pp 181-190, 1992 11 Delves-Broughton J, Blackburn p, Evans RJ, Hugenholtsz J, “Applications of the bacteriocin, nisin”, Antonie can Leeuwenhoek, 69(2): 193-202, 1996 12 De Vuyst L, Vandamme EJ, “Influence of the carbon source on nisin production in Lactococcus lactis subsp lactis batch fermentations”, Journal of General Microbiology, 138(3) : 571-8, 1992 13 De Vuyst, L., F.Leroy, “Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications”, J Mol Microbiol Biotechnol, 13(4): 194-9, 2007 47 14 Fowler G.G, Javis B, Tramer J, “The assay of nisin in foods”, Society of Applied Bacteriology Technology Ser 8:91-105, 1975 15 Gross, E, Morell JL, “The structure of nisin”, Journal of the American Chemical Society, 93(14): 4634-5, 1971 ló.Héchard Y, Sahl HG, “Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Grampositive bacteria”, Biochimie, 84(5-6): 545-57, 2002 17 Hurst, « A Nisin », Adv Appl Microbiol., 27: 85-123, 1981 18.Ivanova, I., p Kabadjova, A Pantev, s Danova, X.Dousset, “Detection, purification and partial characterization of a novel bacteriocin Substance produced by Lactoccocus lactis subsp lactis bl4 isolated from Boza- Bulgarian traditional cereal beverage”, Biocatalysis, 41(6): 47-53 19 Klaenhammer, T.D Bacteriocins of lactic acid bacteria Biochimie, 70: 337- 349,1988 20 Klaenhammer TR, “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria”, FEMS Microbiology Rev, 12(l-3):39-85,1993 21 Kojic, M., Svfrcevic, J., Banina, A.L., Topisữovic L, “Bacteriocin producing strain of Lactococcus lactis subsp diacetylactis S50”, Appl Environ Microbiol., 57: 1835-1837, 1991 22 Lucy H Deegana, et al, “Bacteriocins: Biological tools for bio-preservation and shelf-life extension”, International Dairy Journal, vol,16(9):1058-1071, 2006 23 Mary K Sandel and John L McKillip, “Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional Approaches”, Food control, vol 15, pp:5-10, 2002 24 M T Steen, Y J Chung, and J N Hansen,” Characterization of the nisin gene as a part of a polycistronic operon in the chromosome of Lactococcus lactis ATCC 11454” Applied and Environmental Microbiology, 57(4): 1181- 1188, 1991 25 M V Leal-Sanchez, R Jimenez-Diaz, “Optimization of Bacteriocin Production by Batch Fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10”, Appled and environmental microbiology, 68(9) : 4465-4471, 2002 48 26 ậanlibaba p., Akkoẹ N., Akẹelik M, “Identification and characterisation of antimicrobial activity of nisin A produced by Lactococcus lactis subsp.lactis LL27”, Czech J Food Sci„ 27(1): 55-64, 2009 27 Suganthi.v, E Selvarajan, c Subathredevi, V Mohanasrinivasan, “Lantibiotic Nisin: Natural predervative from lactococcus lactis”, Intemationanl research journal of pharmacy, pp:2230-8407, 2012 28 Tagg, J.R., Me Given, A.R, “Assay system bacteriocins”, Appl Microbiol, 21:943, 1971 29 Taylor, S.L., E.B Somers, L.A Krueger, “Antibotulinal effectiveness of nisin- nitrite combinations in culture medium and chicken frankfurter emulsions”, J Food Prot 48:234239, 1985 30 Todorov SD, Dicks LMT, “Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin by Lacỉococcus ỉactis subsp lactis ST34BR, a strain isolated from barley beer”, J Basic Microbiol, 44(4):305-316, 2004 31 Vandenberg, D.J.C., Smits, A., Pot, B., Ledeboer, A M., Kersters, K., Verbakel, J M A., Verrips, “T Isolation, screening and identification of lactic acid bacteria from fraditional food fermentation processes and culture collections”, Food Biotechn., 7: 189-205, 1993 32 Van der Meer JR, Rollema HS, et al, “Influence of amino acid substitutions in the nisin leader peptide on biosynthesis and secretion of nisin by Lactococcus lactis”, J Biol Chem, 269(5):3555-62, 1994 49 PHỤ LỤC 1: Môi trường vi sinh Tất hóa chất sử dụng đề tài mua từ hãng Merck nước Đức cung cấp Môi trường De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) (g/1) Proteose Pepton 10 Beef extract 10 Yeast extract Dextrose 20 CHaCOONa K2HPO4 Ammonium cihate MgSO4.7H2O 0.2 MnS04 0.04 Tween 80 ml Nước cat 1000ml pH 6.8 Môi trường CM (g/1) Saccharose 20 Pepton from soy 10 KH2PO4 10 NaCl MgSO4.7H2O 0.2 pH 6.8 50 Tryptone Soya Broth (g/1) Trypticase peptone 15 Peptone from soy NaCl pH 51 PHỤ LỤC 2: Kết định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử Chủng DT1 CọỊ^r key for alignment scares =200 I HOO I, 1000 Lactococcus laclis subsp lactis gene for 1SS nbosmial RNA partial sequence, strain JCM 1159 S-fcnuence IŨĨ aLilLdS'JM'j II Leogffii'14ỄS Humber 01 MHtcheit R.d»iifũ 1: lủ to 14X50 SmBaflk Graahicg T rio t Match À Previous I ĩcori E3|FFct Idml iti»i Caph strand 21335 bite{1.129) Ũ.D 1117/1145(99%) 0/1145(0%) FIUE/MUS Query sajrt 315 Query 51 Shirt 37ô Query 5td