Đang tải... (xem toàn văn)
Để đánh giá mức độ khác biệt kiểu gen giữa 8 mẫu tỏi tại Việt Nam, tác giả sử dụngkĩ thuật đa hình ADN khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) với 27 mồi, phân nhóm di truyền các mẫu khảo sát bằng phân mềm NTSYS pc2.1. Kết quả cho thấy tổng số băng thu được l 296 băng, số băng đa hình l 215 băng, tỉ lệ băng đa hình từ 50 – 100%, hệ số tương đồng di truyền của các mẫu khá cao, dao động từ 53,4% đến 93,6%. Các kết quả nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc chọn giống, lai tạo giống và bảo tồn nguồn quĩ gen cây tỏi tại Việt Nam.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số Phân tích mối quan hệ di truyền số giống tỏi (Allium sativum L., Alliaceae) Việt Nam kĩ thuật đa hình ADN khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) Nguyễn Thanh Tố Nhi Khoa Dược, ại học Nguyễn Tất Thành nttnhi@ntt.edu.vn, nandc04@gmail.com Tóm tắt ể đánh giá mức độ khác biệt kiểu gen mẫu tỏi Việt Nam, tác giả sử dụngkĩ thuật đa hình ADN khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) với 27 mồi, phân nhóm di truyền mẫu khảo sát phân mềm NTSYS pc2.1 Kết cho thấy tổng số băng thu l 296 băng, số băng đa hình l 215 băng, tỉ lệ băng đa hình từ 50 – 100%, hệ số tương đồng di truyền mẫu cao, dao động từ 53,4% đến 93,6% Các kết nghiên cứu cung cấp sở khoa học cho việc chọn giống, lai tạo giống bảo tồn nguồn quĩ gen tỏi Việt Nam ® 2019 Journal of Science and Technology - NTTU ặt vấn đề Tỏi loài thực vật lưỡng bội (2n=16), sinh sản sinh dưỡng thân hành (nhánh tỏi) Tuy nhiên, loài tỏi đa dạng đáng kể kiểu dáng, kích thước màu sắc, chiều d i lá, đặc tính sinh trưởng v đặc điểm nông học stress chịu hạn[1] Hiện nay, Việt Nam có số giống tỏi tiếng gọi tên theo vùng địa lí – nơi trồng tỏi, có huyện đảo Lí Sơn, Phan Rang, Hải Dương, ắc Giang, Phù Yên - Sơn La, Lạt, Khánh Hòa ác giống tỏi n y có khác biệt hình thái củ tỏi, b y bán nhiều chợ, siêu thị… Tuy nhiên, mối tương quan di truyền giống tỏi n y chưa biết đến, chúng đa dạng kiểu gen, số chúng có chung kiểu gen Bảng Nguồn gốc tỏi sử dụng nghiên cứu Kí hiệu mẫu Nhận 14.05.2019 ược duyệt 12.07.2019 Cơng bố 20.09.2019 Từ khóa tỏi, quan hệ di truyền, kĩ thuật đa hình khuếch đại ngẫu nhiên Trên sở nghiên cứu tính đa dạng di truyền tỏi số nơi giới, đề t i “Phân tích mối quan hệ di truyền số giống tỏi (Allium sativum L.) Việt Nam kĩ thuật đa hình khuếch đại ADN ngẫu nhiên (RAPD)” thực hiện, nhằm đánh giá mức độ khác biệt kiểu gen số giống tỏi Việt Nam, đồng thời định hướng cho việc xác định mối tương quan khác biệt kiểu gen v th nh phần hóa học, hoạt tính sinh học số giống tỏi Việt Nam ối tượng v phương pháp nghiên cứu 2.1 ối tượng nghiên cứu Tám loại củ tỏi tươi thu thập hệ thống siêu thị TPHCM, bao gồm mẫu HN, HD, BG, LS, PR, KH, DL, ST, sử dụng cho phân tích mối quan hệ di truyền Nguồn gốc HN Hà Nội ( ông ty TNHH TM DV XNK Trường An) BG Bắc Giang (thôn ao Thượng, xã Tân Hưng, huyện Lạng Giang, tỉnh Bắc Giang) HD Hải Dương ( ông ty TNHH TM DV Huy Vũ) LS Lí Sơn ( ơng ty ổ phần Thương mại Dịch vụ Du lịch Lí Sơn) PR Phan Rang ( ông ty ỉnh Lợi – Trang trại Quang Ninh) KH Khánh Hòa Lạt (Cơng ty TNHH SXTM Nơng sản Phong Thúy) Tổ 20, Liên Sóc Trăng (Hợp tácNghĩa, xã H nh ức tímTrọng, Vĩnh Lâm hâu – ồng Sóc Trăng) L ST Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 10 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết tách DNA DNA trích li từ củ tỏi tươi theo qui trình Doyle & Doyle[2] có cải biên, xử lí lần chloroform - isoamyl alcohol, tủa lần isopropanol cồn tuyệt đối Sau đó, nồng độ v độ tinh DNA xác định máy đo quang phổ (Gene Quant) bước sóng 260nm, 280nm 230nm DNA tinh bảo quản -20oC sử dụng 2.2.2 Thực phản ứng RAPD-PCR Thực phản ứng RAPD-PCR theo Williams cộng sự[3] với 40 mồi (Bảng 2), mồi dùng để khuếch đại mẫu tỏi ngẫu nhiên Các mẫu tỏi ngẫu nhiên dùng sàng lọc mồi l HN, G, ST Sau bước sàng lọc này, mồi có băng đa hình cao, phân biệt rõ ràng, chọn để tiến h nh phân tích đa hình RAPD-PCR mẫu khảo sát Thành phần phản ứng PCR, chu trình nhiệt cho phản ứng P R ảng 3, Kết P R phân tích phương pháp điện di gel agarose 2,5% Quá trình điện di thực 20 phút đầu với hiệu điện 120V 60 phút sau với hiệu điện 90V, sử dụng dung dịch đệm điện di TAE 1X, dung dịch nhuộm gel diamond nucleic acid dye, thang chuẩn 1kb hãng Promega Kết điện di hiển thị đèn UV v chụp lại máy chụp thông thường Bảng Các mồi sử dụng phản ứng RAPD-PCR [4] STT Tên mồi Trình tự (5'-3') A1 Nhà cung cấp STT Tên mồi Trình tự (5'-3') CAGGCCCTTC 21 J13 CCACACTACC B16 TTTGCCCGGA 22 K5 TCTGTCGAGG B17 AGGGAACGAG 23 K15 CTCCTGCCAA C5 GATGACCGCC 24 K20 GTGTCGCGAG C7 GTCCCGACGA 25 N1 CTCACGTTGG C9 CTCACCGTCC 26 N3 GGTACTCCCC C13 AAGCCTCGTC 27 N8 ACCTCAGCTC D3 GTCGCCGTCA 28 N13 AGCGTCACTC D5 TGAGCGGACA 29 N14 TCGTGCGGGT 10 F5 CCGAATTCCC 30 N16 AAGCGACCTG 11 G2 GGCACTGAGG 31 N17 CATTGGGGAG 12 G11 TGCCCGTCGT 32 N19 GTCCGTACTG 13 G12 CAGCTCACGA 33 O1 GGCACGTAAG 14 G14 GGATGAGACC 34 O4 AAGTCCGCTC 15 G19 GTCAGGGCAA 35 O9 TCCCACGCAA 16 G20 TCTCCCTCAG 36 O10 TCAGAGCGCC 17 H3 AGACGTCCAC 37 O18 CTCGCTATCC 18 I5 TGTTCCACGG 38 P13 GGAGTGCCTC 19 I7 CAGCGACAAG 39 AB18 CTGGCGTGTC 20 J12 GTCCCGTGGT 40 AC2 GTCGTCGTCT PHUSA BIOCHEM Bảng Th nh phần phản ứng RAPD-PCR [2] Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối / phản ứng PCR buffer 10X 1X MgCl2 50mM 2,5mM dNTPs 10mM 0,2mM Mồi 100µM 0,4µM Taq polymerase 5U/µl 1U ADN khn 25ng H2O Vừa đủ 25µl Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số Bảng hu trình nhiệt phản ứng RAPD-PCR [2] Bước Nhiệt độ (oC) 94 94 36 72 72 2.2.3 Phân tích kết đa hình từ RAPD-PCR Thiết lập ma trận nhị phân từ kết RAPD – PCR với nguyên tắc “1” nghĩa l có xuất vạch khuếch đại, “0” l khơng có vạch khuếch đại Chỉ băng rõ, ổn định, lặp lại có kích thước 150-2500bp, dùng phân tích liệu Các vạch mờ loại bỏ ể hiển thị mối quan hệ di truyền mẫu khảo sát, sơ đồ hình xây dựng dựa số tương ứng đơn giản SM (Simple matching coefficient) xếp nhóm mẫu theo phương pháp UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1 11 Thời gian phút 45 giây phút phút phút 45 Kết thảo luận 3.1 Chiết tách DNA ác mẫu khảo sát tách chiết DNA tổng số phương pháp Doyle & Doyle có cải tiến , đồng thời xác định nồng độ v độ tinh phương pháp đo quang phổ Kết thu ảng cho thấy DNA tổng số thu có nồng độ DNA cao, dao động từ 315ng/µl đến 1405ng/µl, đạt độ tinh (tỉ số A260/280 từ 1,8 – 2) DNA tổng số pha loãng với TE0,1 tới nồng độ định v sử dụng cho phản ứng phân tích RAPD Bảng Nồng độ v độ tinh mẫu khảo sát Mẫu A230 A260 A280 A260/280 HN 0,153 0,246 0,127 1,937 BG 0,155 0,254 0,136 1,868 HD 0,05 0,076 0,042 1,809 LS 0,152 0,281 0,149 1,886 PR 0,035 0,083 0,046 1,804 KH 0,067 0,111 0,058 1,914 DL 0,046 0,101 0,056 1,804 ST 0,041 0,063 0,035 1,8 3.2 S ng lọc mồi Trong 40 mồi 10-mer oligonucleotit sử dụng với mẫu ngẫu nhiên để s ng lọc mồi cho phản ứng RAPD-PCR, chọn 27 mồi (ngoại trừ mồi OP 5, OPD5,OPG2, OPG19, OPH3, OPI5, OPI7, OPJ13, OPK15, OPK20, OPN14, OPN16, OPO18) cho kết băng đa hình phân biệt rõ, chúng sử dụng cho phản ứng RAPDP R to n mẫu khảo sát 3.3 Kết khuếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên 27 mồi sau s ng lọc tiến h nh phản ứng RAPD-P R với mẫu tỏi khảo sát v chạy điện di gel agarose nhằm đánh giá đa dạng chúng Sản phẩm P R mồi điển hình trình b y Số chu kì A260/230 1,608 1,639 1,542 1,849 2,371 1,657 2,196 1,537 Nồng độ (ng/µl) 1230 1270 380 1405 415 555 505 315 Hình Kết phân tích đa hình kiểu gen dựa sở điện di trình b y ảng v ảng Kết cho thấy số băng khuếch đại từ mồi dao động khoảng – 16 băng; tỉ lệ băng đa hình mồi dao động khoảng 50% - 100% Theo ảng 7, tổng số băng thu sau phản ứng P R l 296 băng, trung bình mồi khuếch đại khoảng 11 băng, số băng đa hình l 215, chiếm 72,6% tổng số băng l 296 Tuy tỉ lệ băng đa hình cao, khơng mồi n o sử dụng l marker để nhận diện mẫu tỏi khảo sát Tuy nhiên, số mồi, có phân biệt mẫu so với mẫu tỏi nghiên cứu Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 12 K5 HN BG HD LS PR KH DL ST A1 L1kb HN BG HD LS PR KH DL ST L1kb Hình Sản phẩm RAPD-P R mồi K5, A1 HN–Hà Nội, G– ắc Giang, HD–Hải Dương, LS–Lí Sơn, PR–Phan Rang, KH–Khánh Hòa, DL– Lạt, ST–Sóc Trăng, L1kb-thang 1kb Bảng Số sản phẩm khuếch đại, số băng đa hình v tỉ lệ băng đa hình mồi Mẫu Mồi A1 B16 B17 C7 C9 C13 D3 F5 G11 G12 G14 G20 J12 K5 N1 N3 N8 N13 N17 N19 O1 O4 O9 O10 P13 AB18 AC2 HN BG HD LS PR KH DL ST Σ băng 6 9 11 4 9 11 10 10 8 6 9 2 8 10 5 7 6 9 11 9 11 10 8 6 12 10 13 8 11 9 10 10 11 6 12 11 11 11 10 11 11 11 10 4 11 11 13 7 9 5 8 6 9 8 10 9 10 11 7 6 7 10 10 10 8 14 13 10 16 12 10 10 10 11 16 11 13 12 12 10 14 10 10 12 14 3.4 Phân tích mối quan hệ di truyền bên lo i tỏi Tương quan di truyền mẫu tính tốn phần mềm NTSYS-pc 2.1 dựa hệ số tương ứng đơn giản SM (Simple matching coefficient) Kết có 28 cặp tạo nên từ mẫu khảo sát, với hệ số tương quan di truyền cặp nằm khoảng 53,4% – 93,6% ặp mẫu G v PR l cặp có hệ số tương quan di truyền thấp Đại học Nguyễn Tất Thành Băng đa hình 8 12 10 6 13 10 10 11 8 13 % băng đa hình 70 100 75 57 54 60 75 57 83 40 83 86 60 80 55 81 91 69 67 83 90 79 80 60 89 50 93 (53,4%) cặp mẫu LS v PR l cặp có hệ số tương quan di truyền cao (93,6%) Trung vị (median) tính l 68,4%, 18/28 cặp có hệ số tương quan thấp 68,4% v 10/28 cặp có hệ số tương quan từ 68,4% trở lên Ma trận hệ số tương quan di truyền tức ảng 8, dùng làm sở liệu để xây dựng sơ đồ hình cây, nhằm Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 13 phân nhóm di truyền cho mẫu khảo sát Sơ đồ n y xếp nhóm dựa thuật tốn UPGMA, theo phương pháp SAHN Kết Hình cho thấy có nhóm lớn hình th nh xét mức độ 69% tương quan di truyền, nhóm I gồm mẫu ST, nhóm II chứa mẫu KH, LS, PR v chia th nh hai phân nhóm A (mẫu KH) v (LS v PR có mức độ tương quan di truyền cao nhất, khoảng 94%) xét mức độ 88,6% tương quan di truyền, nhóm III gồm mẫu lại, v chia thành hai phân nhóm A (mẫu G), (mẫu DL) v (mẫu HN, HD với mức độ tương quan di truyền chúng l 92,2%) xét mức độ 85% tương quan di truyền Bảng Số sản phẩm khuếch đại, số băng đa hình v tỉ lệ băng đa hình tổng số mồi sử dụng Mồi Trình tự (5’ – 3’) ∑ băng Băng đa hình % băng đa hình A1 CAGGCCCTTC 10 70 B16 TTTGCCCGGA 8 100 B17 AGGGAACGAG 75 C7 GTCCCGACGA 14 57 C9 CTCACCGTCC 13 54 C13 AAGCCTCGTC 10 60 D3 GTCGCCGTCA 16 12 75 F5 CCGAATTCCC 57 G11 TGCCCGTCGT 12 10 83 G12 CAGCTCACGA 10 40 G14 GGATGAGACC 83 G20 TCTCCCTCAG 86 J12 GTCCCGTGGT 10 60 K5 TCTGTCGAGG 10 80 N1 CTCACGTTGG 11 55 N3 GGTACTCCCC 16 13 81 N8 ACCTCAGCTC 11 10 91 N13 AGCGTCACTC 13 69 N17 CATTGGGGAG 12 67 N19 GTCCGTACTG 12 10 83 O1 GGCACGTAAG 10 90 O4 AAGTCCGCTC 14 11 79 O9 TCCCACGCAA 10 80 O10 TCAGAGCGCC 10 60 P13 GGAGTGCCTC 89 AB18 CTGGCGTGTC 12 50 AC2 GTCGTCGTCT 14 13 93 Tổng cộng 296 215 Số băng trung bình 11 Qua kết thấy, mẫu tỏi khảo sát có tương quan di truyền cao, có phân nhóm chúng, chứng tỏ có khác biệt di truyền đáng kể số mẫu tỏi đại diện thuộc Miền Trung, Tây Nguyên Miền Nam ắc, Miền Bảng Tỉ lệ tương đồng 24 mẫu tỏi dựa hệ số tương ứng đơn giản (SM coefficient) Địa phương HN HN BG 0.79 HD 0.92 0.8 LS 0.64 0.55 0.66 PR 0.64 0.53 0.65 0.94 KH 0.62 0.56 0.63 0.88 0.86 DL 0.85 0.7 0.84 0.69 0.68 0.66 ST 0.54 0.58 0.55 0.66 0.65 0.61 0.55 BG HD LS PR KH DL ST Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 14 C II B A B II A I Hình Sơ đồ hình thể mối tương quan di truyền mẫu tỏi sở kiểu gen Theo kết xếp nhóm mẫu tỏi khảo sát, thấy có phân nhóm di truyền theo khu vực địa lí, mẫu khu vực có mối quan hệ di truyền gần v ngược lại mẫu khác khu vực có mối quan hệ di truyền xa Trong đó, mẫu ST l đại diện tỏi miền Nam xếp độc lập th nh nhóm, mẫu đại diện cho tỏi miền ắc HN, HD, G xếp th nh nhóm v nhóm gồm mẫu đại diện cho tỏi miền Trung LS, PR, KH Tuy nhiên, mẫu DL thuộc khu vực Tây Nguyên lại xếp chung nhóm với mẫu tỏi miền ắc, điều n y lại phù hợp với nghiên cứu aghalian v cộng (2005) cho việc phân loại kiểu gen theo đặc điểm hình thái v tế b o học không tương ứng với việc phân nhóm địa lí kiểu gen tỏi Iran[5] Nguyên nhân trao đổi giống tỏi người nông dân vùng khác nhau, xét theo mối quan hệ di truyền mẫu DL có tương quan kiểu gen cao với mẫu HN v HD với hệ số tương quan di truyền l 85% v 84%, khu vực địa lí, khí hậu v điều kiện mơi trường, thổ nhưỡng Lạt khác xa so với H Nội v Hải Dương Trong tổng số 28 cặp mẫu khảo sát, cặp mẫu LS v PR có quan hệ di truyền gần với hệ số tương quan di truyền khoảng 94%, việc n y nh vườn mua giống trồng nơi khác nhau, du nhập nguyên liệu thực vật góp phần l m cá thể có khoảng cách địa lí xa lại có mức độ tương đồng cao kiểu gen Đại học Nguyễn Tất Thành Sử dụng kĩ thuật RAPD để xây dựng sơ đồ hình nhằm thể mức độ tương đồng di truyền cá thể thuộc lo i tỏi thực nhiều nghiên cứu trước đây: năm 2003, Meryem Ipek v cộng cho thấy đa hình tỏi ngân h ng giống tỏi thị AFLP đa dạng m phương pháp RAPD hay isozyme không phân biệt được[6] hay nghiên cứu Mario Paredes v cộng (2008) phân tích mối quan hệ di truyền loại tỏi hile, cho thấy 65 giống tỏi chia th nh nhóm, 46 giống tỏi nằm nhóm với hệ số tương quan di truyền khoảng 94 – 98% iều n y cho thấy giống tỏi hile có tính đa dạng di truyền thấp sử dụng thị RAPD – PCR[7] Kết luận v đề xuất Nghiên cứu phân nhóm di truyền mẫu tỏi khảo sát thành công, nhờ phần mềm NTSYS pc2.1 Hệ số tương quan di truyền mẫu cao, dao động từ 53,4% đến 93,6% iều cho thấy tính đa dạng di truyền mẫu tỏi thấp Mặt khác, có mối liên hệ phân nhóm di truyền với khu vực địa lí mẫu tỏi Với kết đạt trên, số định hướng nghiên cứu đề xuất nghiên cứu mối quan hệ di truyền tỏi phương pháp RAPD với số lượng mẫu lớn nguồn thu thập đa dạng nước, kết hợp RAPD phân tích giải trình tự ADN vùng nhân hay lục lạp để đánh giá tương quan di truyền tỏi thêm phần xác Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 15 Tài liệu tham khảo Pooler MR and Simon PW Characterization and classification of isozyme and morphological variation in a diverse collection of garlic clones Euphytica 1993; 68 (1, 2): 121 - 30 Doyle, J.J., J.L Doyle(1987), "A rapid DNA isolation procedure for small quantities from fresh leaf tissue", Phytochemistry Bulletin, 19, p 11-15 Williams, J G., A R Kubelik, K J Livak, et al.(1990), "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers", Nucleic Acids Res, 18(22), p 6531-5 M Al-Zahim, H.J Newbury, B.V Ford- Lloyd (1997), “ lassification of Genetic Variation in Garlic (Allium sativum L.) Revealed by RAPD”, Hort Science, 32(6): 1102-1104 Abdoli M, agHalian K (2009), “ lassification of Iranian Garlic (Allium sativum L.) using RAPD marker”, Journal of Medicine Plants, 8(5): p 45-51 Meryem Ipek, Ahmet Ipek, Philipp W Simon (2003), “ omparison of AFLPs, RAPD markers, and Isozymes for Diversity Assessment of Garlic and Detection of Putative Duplicates in Germplasm Collections”, Journal American Society for Horticultural Science, 128(2):246-252 Mario Paredes , Viviana ecerra V., María I González A (2008), “Low genetic diversity among garlic (Allium sativum L.) accessions detected using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)”, Chilean Journal of Agricultural Research, 68(1): 3-12 Analysis on Genetic relations of some garlic varieties in Vietnam using random amplification polymorphism (RAPD) Nguyen Thanh To Nhi Faculty of Pharmacy, Nguyen Tat Thanh University nttnhi@ntt.edu.vn, nandc04@gmail.com Abstract In order to assess the level of genotype differences between garlic samples in Vietnam, random amplification DNA polymorphism technique (RAPD) with 27 primers, genetic grouping of survey samples by NTSYS pc2.1 software was used in this study The results showed that the total number of DNA fragments was 296 bands, that of polymorphic bands was 215, the rate of polymorphic bands was from 50 to 100%, and the genetic similarities of the samples were quite high, ranging from 53.4 % to 93.6% The results of this study will provide a scientific basis for selecting breeds, hybriding, and for the conservation of garlic gene fund in Vietnam Keywords garlic, Alliium sativum L., RAPD, genetic analysis Đại học Nguyễn Tất Thành ... có hệ số tương quan di truyền cao (93,6%) Trung vị (median) tính l 68,4%, 18/28 cặp có hệ số tương quan thấp 68,4% v 10/28 cặp có hệ số tương quan từ 68,4% trở lên Ma trận hệ số tương quan di truyền. .. có phân nhóm di truyền theo khu vực địa lí, mẫu khu vực có mối quan hệ di truyền gần v ngược lại mẫu khác khu vực có mối quan hệ di truyền xa Trong đó, mẫu ST l đại di n tỏi miền Nam xếp độc lập... dùng để khuếch đại mẫu tỏi ngẫu nhiên Các mẫu tỏi ngẫu nhiên dùng sàng lọc mồi l HN, G, ST Sau bước sàng lọc này, mồi có băng đa hình cao, phân biệt rõ ràng, chọn để tiến h nh phân tích đa hình