Đang tải... (xem toàn văn)
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6953:2001 - ISO 14718:1998 trình bày về thức ăn chăn nuôi - xác định hàm lượng aflatoxin B1 trong thức ăn hỗn hợp - phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Mời các bạn cùng tham khảo.
tcvn tIªu chn vIƯt nam TCVN 6953 : 2001 ISO 14718 : 1998 Thức ăn chăn nuôi - Xác định h m l ợng aflatoxin B1 thức ăn hỗn hỵp Ph Animal feeding stuffs Determination of aflatoxin B1 c ontent of mix ed feeding stuffs Method using high-performance liquid chromatography H Néi - 2001 TCVN 6953 : 2001 Lêi nói đầu TCVN 6953 : 2001 hoàn toàn t ơng víi ISO 14718 : 1998 TCVN 6953 : 2001 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F17 Thức ăn chăn nuôi biên soạn,Tổng cục Tiêu chuẩn Đo l nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi tr ợng đề TCVN 6953 : 2001 tiªu chn viƯt nam TCVN 6953 : 2001 Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm l Animal feeding stuffs Determination of aflatoxin B1 content of mixed feeding stuffs Method using high-performance liquid chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định ph ơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để xác định hàm l ợng aflatoxin B1 thức ăn chăn nuôi bao gồm thức ăn chăn nuôi có chứa bã cam quít Giới hạn xác định thấp g/kg Chú thích - Tiêu chuẩn áp dụng để xác định hàm l nguyên liệu thô thức ăn chăn nuôi nh gluten ngô, lạc nhân, hạt cọ dầu, cùi phấn hoa, hạt cải dầu, hạt (xem tài liệu tham khảo ) Tuy nhiên, loại không nằm thư nghiƯm phèi hỵp cđa ph Chó thÝch - Tiêu chuẩn áp dụng để xác định tổng hàm l nhiên thông số ch , B2, G1 G2 Tuy ơng pháp thử nghiệm phối hợp Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 6952 : 2001 (ISO 6498 : 1998) Thức ă n chă n nuôi Chuẩn bịmẫu thử Chiết mẫu clorofooc Phần chiết đ 1) cột C18 Sự xác định phân tách cuối thu đ cột C18 pha ng 1) Florisil ng xác nhận ISO sản phẩm Những sản phẩm t chúng cho kết t ơng tự TCVN 6953 : 2001 Thc thư vµ hãa chÊt Chỉ dùng thuốc thử đ 4.1 N loại khoáng khử ion, điện trở suất 10 M cm, n ớc có độ tinh khiết t 4.2 Axit sunfuric đậm đặc: c(H2SO4) = 18 mol/l, (H2SO4) = 1,84 g/ml Thªm tõ tõ 105 ml axit sunfuric đậm đặc (4.2) vào 895 ml n nãng 4.4 MÉu kiĨm tra Chn bÞ mÉu kiĨm tra gồm khoảng kg thức ăn chăn nuôi có chứa khoảng g/kg aflatoxin B1 cách trộn mẫu xác định tr ớc với g/kg aflatoxin B1 Hµm l cđa mÉu kiĨm tra hai ng mô tả điều Từ kết hàm l trung bình, độ lệch chuẩn hệ số biến động đ tính toán 4.6 Cột loại Florisil Sep-Pak, Waters No.51960, sản phẩm có chất l 4.7 Cột loại Sep-Pak C18, Waters No 51910, sản phÈm cã chÊt l ¬ng 3) 3) 4.8 Axeton 4.9 Metanol 4.10 Axetonitril 4.11 Clorofooc, đ ợc ổn ®Þnh víi etanol (tû lƯ khèi l 2) Celite 3) Florisil tên th Sep-Pak có số hạt nhồi 51960 loại cột C18 Sep-Pak có số hạt nhồi 51910, Hiệp hội N sẵn có Thông tin ® a t¹o ®iỊu kiƯn thn tiƯn cho ng tiêu chuẩn chất l ợng chúng Những sản phẩm t kết t ơng đ TCVN 6953 : 2001 Cảnh báo - Clorofooc chất độc Tránh hít phải tiếp xúc trực tiếp với clorofooc Khi làm việc với dung môi dung dịch phải tiến hành tủ hốt §Ỉc tÝnh hÊp phơ cđa cét Florisil (4.6) cã thĨ biến đổi sử dụng chất ổn định etanol Nếu không dùng clorofooc, đặc tính hấp phụ phải đ 4.12 Hỗn hợp axeton n theo tỷ lƯ 98 : (theo thĨ tÝch) Trén 980 ml axeton (4.8) với 20 ml n ớc (4.1) Lắc 4.13 Hỗn hợp axeton n theo tỷ lệ 15 : 85 (theo thÓ tÝch) Trén 150 ml axeton (4.8) với 850 ml n 4.14 Hỗn hợp axeton n theo tû lƯ : 95 (theo thĨ tÝch) Trén 50 ml axeton (4.8) víi 950 ml n íc (4.1) Lắc 4.15 Hỗn hợp metanol n theo tỷ lƯ 20 : 80 (theo thĨ tÝch) Trén 200 ml metanol (4.9) víi 800 ml n 4.16 Axit nitric ®Ëm ®Ỉc, C(HNO3) = 14 mol/l, (HNO3) = 1,40 g/ml, HPLC cã dÉn xuÊt brom 4.17 Kali bromua (KBr), HPLC cã dÉn xuÊt brom 4.18 Pha ®éng cho HPLC 4.18.1 Pha ®éng cho HPLC víi dÉn xt ho¸ b»ng ièt Trén 120 ml axetonitril (4.10) víi 210 ml metanol (4.9) vµ 390 ml n ớc (4.1), lắc Lọc dung môi rửa giải qua màng lọc PTFE 0,45 m, sử dụng hệ thống lọc dung môi (5.1) tr ớc dùng, loại khí bể siêu âm 10 phút (5.2) tr ớc dùng Chú thích - Thành phần dung môi pha động cần đ sử dụng 4.18.2 Pha động cho HPLC với dẫn xuất hoá brom hợp 286 mg kali bromua (4.17) 152 l axit nitric đậm đặc (4.16) Lắc loại khí dòng khí trơ 15 phút 4.19 Dung dịch iốt b o hòa cho HPLC với dẫn xuất hoá ièt Cho g ièt vµo 400 ml n íc Khuấy 90 phút lọc qua màng lọc PTFE 0,45 m (xem 5.1) Chuẩn bị dung dịch ngày sử dụng TCVN 6953 : 2001 Bảo vệ dung dịch bão hòa khỏi ánh sáng để tránh t 4.20 Dung dịch natri hipoclorit, (chất th (clo hoạt tính) = 100 g/l 4.21 Dung dịch natri hipoclorit, tû lƯ thĨ tÝch % Pha 10 ml dung dịch natri hipoclorit (4.20) với 990 ml hỗn hợp n 4.22 Khí trơ, ví dụ khí nitơ 4.23 ChÊt tiªu chuÈn aflatoxin B1 (C17H12O6), 2,3,6a 2,3-h -tetrahydro-4-methoxycyclopenta furo benzopyran-1,11-dione; Cơ quan Đăng ký Những chất chiết dùng cho Hóa học (CAS) số 1162-65-8 Cảnh báo Mycotoxin chất độc Mọi thao tác phải tiến hành tủ hốt Thực biện pháp phòng ngừa đặc biệt chất độc dạng khô chúng có chất tĩnh điện mycotoxin có xu h Aflatoxin rÊt nh¹y víi bøc x¹ UV Vì vậy, tiến hành thao tác phải tránh ánh sáng mặt trời ánh sáng trắng nhân tạo Cần đảm bảo chiếu sáng đầy đủ nh ng không chói đèn dây tóc vonfram Có thể dùng đèn tỏa nhiệt l Những đồ thủy tinh tiÕp xóc trùc tiÕp víi dung dÞch aflatoxin B1 tr ngâm qua đêm dung dịch hipoclorit (4.21) để loại bỏ hoàn toàn vết aflatoxin B1 4.24 Dung dịch tiêu chuẩn aflatoxin B1, (aflatoxin B1) g/ml Cho toàn ống (ampul) aflatoxin B1 (4.23) vào bình hòa tan clorofooc (4.11) Chuyển dung dịch vào bình định mức có dung tích phù hợp pha loãng đến vạch clorofooc để thu đ dung dịch có chứa hàm l ợng aflatoxin B1 khoảng 10 g/ml Lắc C) chỗ tối, đ 4.25 Dung dịch tiêu chn gèc aflatoxin B1 Chun 2,5 ml dung dÞch hiƯu chuẩn aflatoxin B1 (4.24) vào bình định mức dung tích 50 ml pha loãng đến vạch clorofooc (4.11) Chuyển dung dịch vào bình có mầu hổ phách chai nút xoáy, kín khí bảo quản nơi mát (4 C) chỗ tối, bình đ ợc bịt chặt bọc giấy nhôm TCVN 6953 : 2001 4.26 Dung dÞch hiƯu chn aflatoxin B1 dïng cho HPLC 4.26.1 Dung dÞch hiƯu chn I, (aflatoxin B1) ng/ml Để bình định mức bọc giấy nhôm có chứa dung dịch hiệu chuẩn gốc (4.25) đạt nhiệt độ phòng (trong vài giờ) Chuyển 400 l dung dịch tiêu chuẩn gốc (t ) vào bình định mức dung tích 50 ml đ cặn 20 ml hỗn hợp n ớc-axeton (4.13) Pha loãng đến vạch hỗn hợp n lắc 4.26.2 Dung dịch hiệu chuẩn II, (aflatoxin B1) ng/ml Chun 7,5 ml dung dÞch hiệu chuẩn I (4.26.1) vào bình định mức dung tích 10 ml đ ợc rửa axit Pha loãng đến vạch hỗn hợp n 4.26.3 Dung dịch hiệu chn so s¸nh, (aflatoxin B1) ng/ml Chun 25 ml dung dịch hiệu chuẩn I (4.26.1) vào bình định mức dung tích 50 ml đ ợc rửa axit Pha loãng đến vạch hỗn hợp n Dung dịch đ ợc bơm lặp lại trình sắc ký (8.5) Chun 2,5 ml dung dÞch hiƯu chn I (4.26.1) vào bình định mức dung tích 10 ml đ ợc rửa axit Pha loãng đến vạch hỗn hợp n 4.27 Dung dịch thử cho sắc ký Chuẩn bị ống (ampul) chứa hỗn hợp aflatoxin B1, B2, G1 vµ G2 ml clorofooc nång độ t ơng ứng xấp xỉ 1,0 g/ml; 0,5 g/ml; 1,0 g/ml, 0,5 g/ml Cho toàn hỗn hợp ampul vào ống nghiệm có nút thủy tinh vào bình có nắp xoáy Chuyển 40 ợc rửa axit (5.4) Làm bay clorofooc dòng khí trơ (4.22) hoà tan cặn 10 ml hỗn hợp n Thiết bị, dụng cụ Tr ợc ngâm vài axit sunfuric (4.3), sau rửa (ví dụ lần) n ớc để loại bỏ hoµn toµn axit KiĨm tra tån d cđa axit b»ng giấy pH Trong thực tế khâu xử lý cần thiết bình đáy tròn thiết bị cất quay (5.12), bình định mức, xylanh đo, bình ống nghiệm dùng để đựng dung dịch xây dựng đ ờng chuẩn dịch TCVN 6953 : 2001 chiết cuối (đặc biệt bình lấy mẫu tự động) pipet Pasteur, dụng cụ dùng để chuyển dung dịch đ ờng chuẩn dịch chiết Chó thÝch - Nh÷ng dơng thđy tinh dïng phòng thí nghiệm tiếp xúc trực tiếp với dung dịch aflatoxin phải đ ợc ngâm axit làm tổn thất aflatoxin B1 Phải đặc biệt ý đến dụng cụ thủy tinh dụng cụ thủy tinh sử dụng nh bình lấy mẫu tự động pipét Pasteur Sử dụng thiết bị dùng phòng thí nghiệm sau: m 5.2 Bể siêu âm 5.3 Micro si-ranh, dung tÝch 100 l dïng cho chuÈn bÞ dung dịch đ Kiểm tra cách cân độ không xác không v 5.4 ống thủy tinh chuẩn cã n¾p, dung tÝch 10 ml 5.5 Phỉ kÕ, phï hợp với phép đo vùng UV phổ, gồm cuvét thạch anh có chiều dài đ 0,1 mm Bình tam giác, dung tích 500 ml, đ ợc làm từ thủy tinh borosilicat, cổ bình rộng có nút thủy 5.6 tinh nút xoáy có lót PTFE 5.7 Máy lắc cơ, lắc theo chiều ngang chuyển động tịnh tiến với tần số 250 - 300 vòng/phút 5.8 GiÊy läc gÊp nÕp, ® bỊn víi clorofooc 4) 5.10 Siranh bỊn vỊ mỈt hãa häc, dung tÝch 10 ml cã c¸c èng nèi Luer (4) 5.11 Cét thđy tinh, cã ® êng kÝnh tõ 10 - 15 mm, chiều dài khoảng 30 - 50 cm, cã nót Luer Chó thÝch - NÕu sư dơng cét thđy tinh cã ® bĨ chøa b»ng nhùa (bỊn vỊ mỈt hãa häc) Ýt nhÊt cã dung tÝch 70 ml 4) Luer tên th a tạo điều kiện thuận lợi cho ng nh ợng chúng Những sản phẩm t ơng tự (4) TCVN 6953 : 2001 5.12 Thiết bị cất quay chân không, có bình đáy tròn dung tích 150 - 250 ml 5.13 Hệ thống HPLC Xem hình giới thiệu sơ đồ hệ thống HPLC cho dẫn xuất hoá iốt brom, t Pha động HPLC 10 Cuộn dây phản ứng Bơm HPLC 11 Detector huỳnh quang Bơm nạp mẫu 12 Điện trở Cột bảo vệ 13 Bình chứa dung môi thải Dung dịch iốt bão hòa 15 Ngăn dẫn xuất (KOBRA ) Bơm dung môi 16 Vôn kế ống nối chữ T 17 Nguồn điện, 10 V d.c Nồi cách thuỷ (60 C) 18 Điện trở, 100 k Hình - Sơ đồ giới thiệu hệ thống HPLC cho dẫn xuất hoá iốt Hình - Sơ đồ giíi thiƯu hƯ thèng HPLC cho dÉn xt ho¸ b»ng brom (xem ghi sơ đồ 1) TCVN 6953 : 2001 5.13.1 Bơm, phải ổn định, có khả trì tốc độ dòng khoảng 0,1 ml/phút đến 1,0 ml/phút 5.13.2 Bơm nạp mẫu, có vòng nạp mẫu phù hợp với l ợng nạp mẫu 250 l 5.13.3 Detector huúnh quang, kÝch thÝch ë b thiÕt bị lọc có b ớc sóng phát > 400 nm) Có khả phát đ thấp 0,05 ng Có thể dùng áp lực ng polytetrafluoetylen (PTFE) nối với đầu detector) để loại bọt khí dòng chảy 5.13.5 Cột bảo vệ, dùng cét C18 cã kÝch th íc h¹t nhåi tõ 37 - 50 m, dài 10 - 20 mm, đ 3,9 mm; dùng cột bảo vệ khác có chất l ơng 5.13.6 Cột phân tích, dùng cột C18 có kích th m, dài 200 mm, đ ờng kính 3,0 mm; dùng cột bảo vệ khác có chất l ơng 5.13.7 Bộ tích phân điện tử (tuỳ chän) 5.14 HƯ thèng HPLC ®èi víi HPLC víi dÉn xuất hoá iốt 5.14.1 Bơm, phải ổn định, cung cÊp thc thư ièt cét ci 5.14.2 Van ch÷ T cã vïng thĨ tÝch chÕt b»ng kh«ng, b»ng thÐp kh«ng gØ kÝch th 1,59 mm x 0,75 mm 5.14.3 Cuén dây phản ứng hình xoắn ốc, polytetrafluoetylen (PTFE) thÐp kh«ng gØ Thùc tÕ cho thÊy kÝch th th m m 5.14.4 Bồn n ợc điều chỉnh ®Õn 60 C, cã thĨ chØnh nhiƯt ®é chÝnh x¸c ®Õn 0,1 C 5.15 HƯ thèng HPLC ®èi víi HPLC với dẫn xuất hoá brom 5.15.1 Ngăn điện hóa, thiÕt bÞ brom cđa Kok (KOBRA 5) ) 5.15.2 Ngn ®iƯn, V ®Õn 20 V mét chiỊu 5.15.3 Dơng cụ đo, dải đo từ V đến 10 V chiều, trở kháng > 50 k 5) tên th chuẩn nh đ 10 ợc sử dụng chúng cho kết t a tạo ®iỊu kiƯn thn tiƯn cho ng TCVN 6953 : 2001 5.15.4 5.16 Điện trở, 100 k Xi-lanh, thích hợp cho HPLC với l ợng mẫu đ a vào 250 l Lấy mẫu Ph Điều quan trọng phòng thí nghiệm phải nhận đ ợc mẫu có tính đại diện trung thực, không bị h hại Chuẩn bÞ mÉu thư Chn bÞ mÉu thư theo TCVN 6952 : 2001 (ISO 6498) Mẫu phòng thí nghiệm đ ợc nghiền (th sàng mm Trộn Cách tiến hành 8.1 Khái quát Đối với lần đo thêm vào mẫu trắng 10 g/kg aflatoxin B1 hóa chất đ mẫu kiểm tra (4.4) Thêm vào mẫu trắng hóa chất để kiểm tra nhiễm bẩn từ dụng cụ thủy tinh Kết đ 8.2 Xác định phổ hấp thụ dung dịch tiêu chuẩn aflatoxin B1 Xác định phổ hấp thụ dung dịch tiêu chuẩn aflatoxin B1 (4.24) cuvét khoảng b 330 nm 370 nm b»ng phỉ kÕ (5.5), lÊy clorofooc lµm mÉu trắng Đo độ hấp thụ (A) b 363 nm - gần b 8.3 Chiết Cân 50,0 g (chính xác ®Õn 0,1 g) mÉu thư ®· chn bÞ (xem ®iỊu 7) cho vào bình tam giác (5.6) Thêm lần l (4.5), 250 ml clorofooc (4.11) vµ 25 ml n íc Để bình cố định, khuấy nhẹ giải phóng áp suất Đặt bình vào máy lắc (5.7) lắc 30 phút Chú thích - Để giảm thể tích clorofooc sư dơng, cã thĨ dïng mét nưa l ®· chuẩn bị (xem điều 7), 12,5 g Celite (4.5), 125 ml clorofooc (4.11) vµ 12,5 ml n íc 11 TCVN 6953 : 2001 Läc qua giÊy läc gÊp nÕp (5.8) Nếu trình lọc diễn chậm, phải bọc toàn phễu để tránh t s ) Nếu cần lấy phần dịch pha loãng thành 50 ml (Vf) clorofooc để l không v ợt ng/ml Dùng dịch lọc mẫu làm theo 8.4 8.4 Làm 8.4.1 8.4.1.1 Làm Florisil Chuẩn bị cột làm Gắn van ba chạc (5.9) vào cuối cột Florisil (4.6) Rửa cột loại không khí cách lấy 10 ml clorofooc (4.11) cho nhanh ml qua van dùng si-ranh (5.10) bơm clorofooc vào cột Gắn vào phần dài cột thủy tinh (5.11) cho nốt ml clorofooc lại qua cột Khóa van Bỏ si-ranh 8.4.1.2 Làm Cho dịch lọc thu đ ợc (Vs Vf b»ng ml clorofooc (4.11), röa tiÕp b»ng 20 ml metanol (4.9), gạn phần dung môi rửa giải Trong trình phải đảm bảo dãy cột không bị khô Rửa giải aflatoxin B1 50 ml hỗn hợp axeton - n ớc (4.12) thu chất rửa giải vào bình đáy tròn thiết bị cất quay (5.12) Chó thÝch - ChÊt l ỵng cét Florisil thay đổi đợt Phụ thuộc vào chất l axeton - n ờng hợp xảy dùng 60 ml đến 70 ml hỗn hợp axeton - n Cô đặc phần dung môi rửa giải thiết bị cất quay khoảng nhiệt độ 40oC - 50 C đến không Chú thích - Lúc bình khoảng 0,5 ml chất lỏng Các thực nghiệm cho thấy việc cho bay thêm hại lại khoảng 0,5 ml chất lỏng, lúc không axeton Các vết axeton làm giảm aflatoxin B1 cột C18 Thêm ml metanol (4.9), khuấy để hòa tan aflatoxin B1 bám bình, thêm ml n Tháo bỏ cột Rưa cét thđy tinh b»ng n 12 íc lµm cột C18 TCVN 6953 : 2001 8.4.2 Làm cột C18 8.4.2.1 Chuẩn bị d y cột Gắn van ba chạc (5.9) vào phía cuối cột C18 (4.7) Rửa cột loại không khí cách dùng si-ranh (5.10) bơm nhanh 10 ml metanol (4.9) vào cột Có thể nhận thấy bọt khí cột nh điểm sáng xám Lấy 10 ml n ớc cho qua cột ml n ớc Tránh đ a không khí vào cột chuyển từ metanol sang n ớc Gắn vào phần dài cét thđy tinh (5.11) vµ cho nèt ml n si-ranh 8.4.2.2 Làm Cho phần chiết đ metanol (4.15) để chảy tác dụng trọng lực Trong trình này, đảm bảo dãy cột không bị khô Nếu thấy xuất bọt khí chỗ thắt, dừng dòng chảy mở vòi đỉnh cột thủy tinh để loại bỏ bọt khí Sau lại tiếp tục trình Rửa giải 25 ml hỗn hợp n B1 25 ml hỗn hợp n B Chú thích - a vào HPLC không cần thiết Nếu thấy cần xem xét không đ 8.5 Nên dùng màng lọc PTFE Sắc ký lỏng hiệu cao 8.5.1 Khái quát Phải có đủ thời gian để chuẩn bị ổn định thiết bị Tốc độ dòng pha động chất thử sau cột đ ợc xác định Chúng đ ợc điều chỉnh phụ thuộc vào đặc điểm cột HPLC chênh lệch Bằng việc nạp l ợng dung dịch hiệu chuẩn xác định (4.26.3) khoảng xác định (ví dụ lần nạp thứ ba) giá trị pic aflatoxin B1 nên đ ợc hiệu chỉnh cách lấy giá trị trung bình, để khẳng định khác lần đo liên tiếp dung dịch hiệu chuẩn nhỏ (< 10 %) Do lần nạp phải đ ợc tiến hành liên tục Nếu cần có gián đoạn, lần nạp cuối tr ớc dừng lần nạp sau dừng phải dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) 13 TCVN 6953 : 2001 Do đ ờng thẳng qua gốc nên l ợng aflatoxin B1 mẫu chiết đ ợc xác định trực tiếp cách so sánh kết thu đ 8.5.2 Đặt chế độ nạp cho HPLC Đặt chế độ nạp (5.13.1) để có tốc độ dòng chảy pha động (4.18) 0,5 ml/phút 0,3 ml/phút víi cét HPLC cã kÝch th m hc NÕu dùng dẫn xuất hoá iốt, làm theo 8.5.3 8.5.3 Đặt chế độ nạp sau cột cho HPLC với dẫn xuất hoá iốt Đặt chế độ bơm (5.14.1) để có tốc độ dòng dung dịch iốt bão hòa (4.19) nằm khoảng 0,2 ml/phút đến 0,4 ml/phút Nên đặt tốc độ dòng khoảng 0,4 ml/phút 0,2 ml/phút t ơng ứng với tốc độ dòng pha động (4.18) lµ 0,5 ml/phót vµ 0,3 ml/phót 8.5.4 Detector hnh quang Dïng detector huúnh quang (5.13.3) víi b íc sãng kích thích 365 nm b (đối với thiết bị lọc có b ớc sóng phát > 400 nm) Điều chỉnh suy giảm detector để phát đ 8.5.5 Nạp Đối với dung dịch, thể tích nạp 250 l theo h ớng dẫn nhà sản xuất 8.5.6 Kiểm tra phân tách sắc ký Nạp dung dịch thử sắc ký (4.27) Những phần lõm xuống phải nhỏ % tỉng chiỊu cao c¸c pic liỊn kỊ 8.5.7 KiĨm tra tính ổn định hệ thống Tr ớc lần phân tích, nạp liên tục dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) ®Õn thu ® ®é tuyÕn tÝnh (8.5.8) 8.5.8 Kiểm tra độ tuyến tính Nạp dung dịch hiệu chuẩn aflatoxin B1 (4.26.1 đến 4.26.4) Mỗi lần nạp thứ ba dùng dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) để hiệu chỉnh chênh lệch kết Các pic dung dịch hiệu chuẩn không đ khác 10 % 90 phút Hiệu chỉnh chênh lệch theo công thøc ë 9.3 14 TCVN 6953 : 2001 BiĨu ®å chuẩn đuờng thẳng qua gốc toạ độ Các giá trị thu đ ợc không khác 3% giá trị danh định Nếu yêu cầu đ ợc thỏa mãn tiến hành trình phân tích Và ng ợc lại ch mãn, phải xác định hiệu chỉnh nguồn gốc nguyên nhân tr ớc 8.5.9 Nạp mẫu chiết Nạp liên tiếp dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3), dịch chiết thức ăn chăn nuôi aflatoxin B1, dịch công nhận mẫu kiểm tra (4.4) dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) Nạp dịch chiết mẫu đ hiệu chuẩn (4.26.3) Khi nạp 10 mẫu, lần nạp cuối dung dịch hiệu chuẩn aflatoxin B1 (4.26.1 đến 4.26.4) Tính toán kết 9.1 Tính l Hàm l 1 dung dịch hiệu chuẩn aflatoxin B1 dung dịch hiệu chuẩn aflatoxin B1 đ p= dxk p hàm l B dung dịch tiêu chuẩn aflatoxin B1 (4.24), tính miligam mililít; M khối luợng phân tử gam cña aflatoxin B1, (M = 312 g/mol), tÝnh b»ng gam mol; A độ hấp thụ đo 8.2, đ ợc hiệu chỉnh với mẫu trắng; d chiều dài đ ờng quang cuvét, (d = cm), tính centimét; k hệ số hấp thụ phân tư gam cđa aflatoxin B1 clorofooc ë b 9.2 Tính l Hàm l ợng aflatoxin B1 dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) đ mc = f x p x Vic 15 TCVN 6953 : 2001 ®ã mc hàm l ợng aflatoxin B1 dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) đuợc nạp vào, tính nanogam; f hệ số pha loãng hiệu chỉnh đơn vị, (f = 200 ng/mg) tính nanogam miligam; p hàm l ợng aflatoxin B1 dung dịch tiêu chuẩn aflatoxin B1 (4.24), đ ợc tính 9.1, tính nanogam mililit; Vic thể tích dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) đ ợc nạp, (Vic = 0,25 ml), tính b»ng mililit 9.3 TÝnh hµm l Hµm l 1 dung dịch thử dung dịch thử đ ợc tÝnh theo c«ng thøc: As x mc ma = Ac1 + Ac2 ma hàm l ợng aflatoxin B1 dung dÞch thư, tÝnh b»ng nanogam; As diện tích pic ứng với hàm l ợng aflatoxin B1 dung dịch thử, đơn vị diện tích; mc hàm l dung dịch hiệu chuẩn (4.26.3) đ ợc nạp, đ Ac1 diện tích pic ứng với hàm l ợng aflatoxin B1 thu đ (4.26.3), đơn vị diện tích; Ac2 diện tích pic ứng với hàm l ợng aflatoxin B1 thu đ (4.26.3), đơn vị diƯn tÝch Chó thÝch - Cã thĨ dïng chiỊu cao pic (tính theo đơn vị đo chiều dài) thay cho diƯn tÝch pic 9.4 TÝnh hµm l Hµm l 1 mÉu cã mÉu thư ® c wa = ms x Vis x Vf ®ã 16 wa lµ hµm l cã mÉu thư, tÝnh b»ng microgam kilogam; ma hàm l dung dÞch thư, tÝnh b»ng nanogam; TCVN 6953 : 2001 Vs thể tích dịch chiết mẫu không pha loãng thu đ ợc dùng trình tiếp theo, (Vs = 50 ml không cần pha loãng dịch lọc thu đ ms l ợng mẫu thử, (ms = 50,0 g), tính gam ; Vis thể tích dịch chiÕt mÉu ® is = 0,25 ml), tÝnh b»ng mililit; Vf thể tích dịch lọc sử dụng cho làm s¹ch (8.4), (Vf = 50 ml), tÝnh b»ng mililit; Vc thể tích clorofooc sử dụng để chiết mẫu (xem 8.3), (Vc = 250 ml), tÝnh b»ng mililit NÕu ms = 50,0 g, Vs = 50 ml, Vis = 0,25 ml, Vf = 50 ml vµ Vc = 250 ml công thức trở thành: wa = 20 g-1 x ma 10 §é chơm 10.1 Sai sè hƯ thèng ThÈm định việc áp dụng ph chuẩn đ ơng pháp thực nghiệm mẫu trắng bổ sung Độ lệch trung bình so với giá trị thực tế đ ợc biểu diễn phần trăm giá trị thực không đ 10.2 Độ chụm 10.2.1 Thử nghiệm liên phòng thí nghiệm Thông tin chi tiết thử nghiệm liên phòng thí nghiệm độ chụm ph ợc tóm tắt phụ lục A Các giá trị không áp dụng với dải nồng độ thành phần với dải nồng độ thành phần cho Phụ lục B tóm tắt kết thống kê thử nghiệm liên phòng thí nghiệm đ xuất hoá iốt brom 10.2.2 Độ lặp lại Sự chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn độc lập kiểm nghiệm viên thực ph ơng pháp mẫu kiểm tra thiết bị phòng thí nghiệm 5% tr ờng hợp v ợt giới hạn lặp lại (r) đ (wa wa r g/kg) g/kg; giới hạn lặp lại, g/kg 17 TCVN 6953 : 2001 10.2.3 Độ tái lập Sự chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm kiểm nghiệm viên áp dụng phuơng pháp mẫu kiểm tra thiết bị khác phòng thí nghiệm khác 5% tr ợc tính theo công thức sau: (wa g/kg) wa giá trị trung bình hai kết quả, g /kg 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải thể hiện: 18 - tất thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu; - ph ơng pháp lấy mẫu, biết; - ph ơng pháp thử áp dụng, viện dẫn theo tiêu chuẩn này; - chi tiết tiến hành không qui định tiêu chuẩn đ - kết thử nghiệm thu đ ợc; - kiểm tra độ lặp lại, ghi c¶ kÕt qu¶ cuèi cïng TCVN 6953 : 2001 Phụ lục A (tham khảo) Kết thử nghiệm liên phòng thí nghiệm Độ chụm ph theo TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Cã 22 phßng thí nghiệm từ 11 quốc gia thành viên EU tham gia thử nghiệm Nghiên cứu mẫu tr nuôi có hàm l ợng aflatoxin B1 < g /kg 14 g /kg Bảng A.1 - Kết thống kê thử nghiệm liên phòng thí nghiệm áp dơng ph MÉu a) Sè phßng thÝ nghiệm đ 15 15 15 Hàm l ợng aflatoxin B1 trung bình, g/kg 0,8 7,0 12,6 Độ lệch chuẩn lặp lại (sr), g/kg 0,20 0,44 1,20 Hệ số biến động lặp lại, % 25,0 6,3 9,5 0,55 1,24 3,37 Độ lƯch chn t¸i lËp (sR), g/kg 0,34 1,02 1,80 HƯ số biến động tái lập, % 42.5 14.6 14,3 0,95 2,86 5,05 Thông số Giới hạn lặp lại (r) r = 2,8 x sr g/kg Giới hạn tái lập (R) R = 2,8 x sR g/kg a) MÉu 1: MÉu trắng; hàm l g/kg; gồm: 10 % đại mạch, 20 % sắn, 15 % bã cam, 20 % đậu t ờng, 20 % thức ăn gia súc viên cho bò, 1,7 % chất béo, 1,5 % dicanxi phốtphát 0,7 % muèi MÉu 2: Hµm l =8 MÉu 3: Hàm l g/kg, thành phần khác giống mẫu *) Số phòng thí nghiệm đ Chú thích - Trong báo cáo kết phòng thí nghiệm (xem tham khảo 3), giá trị r R (xem bảng A.2) đ mẫu đ nghĩa t Bảng A.2 - Tóm tắt kết thống kê thử nghiệm liên phòng thí nghiệm đ công bố Hàm l r g/kg) vµ 14 ( 1,4 R HƯ số biến động lặp lại Hệ số biến động tái lËp g/kg) (%) (%) 1,7 11 18 19 TCVN 6953 : 2001 Phụ lục B (tham khảo) Đ Đ 4) Hơn đ Landbouwkundige Laboratoria: Ban Chất l từ tháng 10/1992 đến tháng 7/1994 Trong giai đoạn phòng thí nghiệm tiến hành theo hai ph ơng pháp dẫn xuất mẫu có thành phần khác thức ăn chăn nuôi có hàm l aflatoxin B1 khoảng từ g/kg đến 90 g/kg Các kết thử nghiệm nằm bảng B.1 Bảng B.1 - Kết thống kê thí nghiệm đ ợng dẫn xuất hoá iốt dẫn xuất hoá brom Dẫn xuất hoá iốt a Mẫu wa Thức ăn cho bò (dạng viên) Gluten ngô Cùi dừa khô Nhân hạt cọ dầu lạc Lạc cơm dừa khô a) wa hàm l Mức ý nghÜa b s wa n s 2,1 0,4 2,1 0,3 n.s 2,2 0,3 2,2 0,3 n.s 2,2 0,5 1,9 11 0,3 n.s 2,3 0,5 2,0 11 0,4 n.s 4,5 0,2 4,8 0,4 n.s 4,7 0,2 4,7 0,5 n.s 5,0 0,8 5,4 11 0,9 n.s 5,1 0,7 5,4 11 0,8 n.s 8,3 1,6 9,0 10 1,0 n.s 9,6 1,1 10,1 10 1,7 n.s 10,8 1,6 9,5 1,6 n.s 12,1 1,4 11,8 1,8 n.s 16,3 2,3 16,4 11 2,0 n.s 17,6 2,4 18,9 11 1,5 n.s 19,7 4,4 17,7 2,7 n.s 20,2 3,1 18,6 2,3 n.s 27,9 3,4 29,3 1,6 n.s 29,0 3,1 33,2 1,7 p < - 0,01 38,1 7,4 35,3 11 5,3 n.s 53,7 10,7 48,7 11 7,3 n.s 83,0 9,9 86,0 10,7 n.s 80,0 5,5 86,1 7,3 n.s 85,5 9,2 94,1 9,3 n.s trung bình, g/kg; s độ lệch chuẩn 20 a n n số kết quả; b) Dẫn xuất hoá brom n.s ý nghĩa thống kê theo Student TCVN 6953 : 2001 Tài liệu tham khảo Traag W.A.,van Trijp J.M.P., Tuinstra L.G.M.Th Kok W.Th, Làm mẫu dẫn xuất sau cột để xác định aflatoxin B1 thức ăn chăn nuôi sắc ký lỏng J Chrom., 396, pp 389-394 (1987) Nông nghiệp (DLO), Grondstoffen voor veevoeder Xác định trực tiếp aflatoxin B1 - Sắc ký lỏng phân giải cao - Dẫn xt sau cét - Ph¸t hiƯn b»ng detector hnh quang (Xác định trực tiếp aflatoxin B1 thức ăn chăn nuôi sắc ký lỏng phân giải cao v dùng detector huúnh quang) B Van Egmond H.P., Heisterkamp S.H Paulsch W.E EC-Cộng tác nghiên cứu xác định aflatoxin B1 B thức ăn chăn nuôi Phụ gia thực phÈm v c¸c ChÊt nhiƠm bÈn, 8, pp.17-29 (1991) Van Egmond H.P., Patel S., Paulsch W.E., Sizoo E.A Tuinstra L.G.M.Th., Wood G., Boenke A., Schurer B, vµ Wagstaffe P.J Xây dựng nguyên liệu tham khảo dùng làm thức ăn chăn nuôi, xác định tr ớc hàm l cđa chóng Phơ gia thùc phÈm v c¸c ChÊt nhiƠm bẩn, 11, pp.449-477 (1994) v kết đo Phần 1: Nguyên tắc v định nghĩa chung TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Độ xác (độ v độ chụm) ph v kết đo Phần 2: Ph ISO 6497 Thức ăn chăn nuôi độ tái lặp ph Lấy mẫu (Ani mal feeding stuffs - Sam pling) TCVN 6599 : 2000 (ISO 6651) Thức ăn chăn nuôi Xác định h pháp TLC) 21 ... 4.23 Chất tiêu chuẩn aflatoxin B1 (C17H12O6), 2,3,6a 2,3-h -tetrahydro-4-methoxycyclopenta furo benzopyran-1,11-dione; Cơ quan Đăng ký Nh÷ng chÊt chiÕt dïng cho Hãa häc (CAS) sè 116 2-6 5-8 Cảnh... 18 - tất thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu; - ph ơng pháp lấy mẫu, biết; - ph ơng pháp thử áp dụng, viện dẫn theo tiêu chuẩn này; - chi tiết tiến hành không qui định tiêu chuẩn đ - kết... TCVN 6953 : 2001 tiêu chuẩn việt nam TCVN 6953 : 2001 Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm l Animal feeding stuffs Determination of aflatoxin B1 content of mixed feeding stuffs Method using high-performance