Đang tải... (xem toàn văn)
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8566:2010 áp dụng cho việc kiểm tra mật độ và hoạt tính đối kháng của các vi sinh vật đối kháng đối với nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn (cây hàng năm). Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8566:2010 PHÂN BÓN VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH VÙNG RỄ CÂY TRỒNG CẠN Biofertilizer - Determination of antagonistic activity of microbes to fungi causing soiborn diseases of upland plant Lời nói đầu TCVN 8566:2010 chuyển đổi từ 10 TCN 867:2006 theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật TCVN 8566:2010 Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa biên soạn, Bộ Nơng nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố PHÂN BĨN VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH VÙNG RỄ CÂY TRỒNG CẠN Biofertilizer - Determination of antagonistic activity of microbes to fungi causing soiborn diseases of upland plant Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng cho việc kiểm tra mật độ hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ trồng cạn (cây hàng năm) Tài liệu viện dẫn TCVN 7185:2002, Phân hữu vi sinh vật Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ, định nghĩa sau 3.1 Vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ trồng cạn (antagonistic microbes to fungi causing soilborn diseases of upland plant) Các vi sinh vật có khả tiêu diệt ức chế phát triển hay làm giảm độc tính nấm gây bệnh vùng rễ trồng cạn 3.2 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ trồng cạn (antagonistic activity microbes to fungi causing soilborn diseases of upland plant) Khả vi sinh vật: - tạo vòng đối kháng (vòng tròn xuống) bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc nấm gây bệnh nuôi cấy môi trường nhân tạo - làm giảm tỷ lệ bị bệnh nấm bệnh vùng rễ gây khơng 20 % Mơi trường ni cấy - Môi trường PDA; - Môi trường Thạch - Thịt - Pepton; - Môi trường Czapeck Czapeck Dox; - Môi trường Gauze ISP-4 (xem Phụ lục A) Cách tiến hành 7.1 Chuẩn bị thử 7.1.1 Dụng cụ Các dụng cụ sử dụng nuôi cấy, nhiễm vi sinh vật xác định hoạt tính vi sinh vật phải khử trùng cách sau: - giữ nhiệt độ 180 0C khơng h tủ sấy (5.1.3) hoặc; - giữ nhiệt độ 121 0C khơng 30 nồi hấp áp lực (5.1.2) 7.1.2 Vật tư - Đất khử trùng phương pháp khử trùng ngưng đoạn [khử trùng ngày liên tiếp 121 C khơng 20 nồi hấp áp lực (5.1.2)] - Hạt, củ giống khử trùng bề mặt cách ngâm dung dịch H 2O2 4%, thời gian từ đến min, sau rửa - lần nước vô trùng 7.1.3 Dịch pha loãng - Dung dịch pha loãng nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa hợp chất nitơ, sau khử trùng có độ pH 7,0; - Lấy dịch pha loãng cho vào ống nghiệm, bình tam giác có dung tích thích hợp với lượng cho sau khử trùng, ống nghiệm chứa ml, bình tam giác chứa 90 ml Làm nút khử trùng 121 0C khơng 20 nồi hấp áp lực; CHÚ THÍCH 1: Để tránh làm ảnh hưởng đến vi sinh vật thay đổi nhiệt độ đột ngột nên điều chỉnh nhiệt độ dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm trước sử dụng 7.1.4 Dịch nấm gây bệnh - Cây giống: Lựa chọn bào tử chủng nấm gây bệnh có độc tính kiểm tra khả gây bệnh vùng rễ trồng, cấy thạch đĩa chứa môi trường PDA chuẩn bị sẵn (xem Phụ lục A) Nuôi cấy thời gian khoảng ngày đến ngày nhiệt độ khoảng 28 0C đến 30 0C bào tử nấm mọc đầy đĩa thạch - Pha mẫu: Dùng que cấy vô trùng lấy bào tử nấm gây bệnh vùng rễ đưa vào dịch pha loãng chuẩn bị sẵn (xem 7.1.3), trộn kỹ máy lắc hay máy trộn Vortex (5.1.9); mật độ bào tử không nhỏ 108 CFU/ml 7.1.5 Dịch mẫu - Đối với mẫu dạng đặc: Cân 10 g mẫu xác đến 0,01 g cho vào bình tam giác có sẵn 90 ml dịch pha lỗng (7.1.3) Trộn kỹ máy lắc hay máy trộn Vortex (5.1.9) từ đến 10 cho vi sinh vật dung dịch phân bố đồng Để cho phần tử nặng lắng xuống thời gian không 15 min, gạn dung dịch huyền phù ban đầu (a); - Đối với mẫu dạng - lỏng: dùng pipet khử trùng lấy 10 ml mẫu cho vào bình tam giác có sẵn 90 ml dịch pha lỗng (7.1.3), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng Trộn kỹ máy lắc hay máy trộn Vortex (5.1.9) từ đến 10 cho vi sinh vật dung dịch phân bố đồng Dung dịch tạo gọi dung dịch huyền phù ban đầu (b); - Dùng micropipet vô trùng lấy ml dịch huyền phù ban đầu (a b) cho vào ống nghiệm có sẵn chứa ml dịch pha lỗng (7.1.3), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, trộn máy trộn Vortex (5.1.9) để có dịch pha lỗng mẫu có nồng độ pha lỗng 10 -2 Q trình lặp lại liên tục để có dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 7.2 Xác định mật độ vi sinh vật đối kháng 7.2.1 Cấy mẫu - Dùng micropipet vô trùng hút 0,1 ml dịch nấm gây bệnh (7.1.4) cấy vào đĩa petri (5.2.4) chứa 30 ml môi trường PDA (lớp thạch thứ nhất) chuẩn bị sẵn; - Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch nấm gây bệnh tràn bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt dịch nấm gây bệnh thấm hoàn toàn bề mặt thạch Chú ý khơng để dịch nấm gây bệnh dính vào thành đĩa petri; - Sau bề mặt thạch khô (khoảng h), phủ tiếp khoảng 15 ml đến 20 ml mơi trường thích hợp với vi sinh vật đối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ cấy nấm gây bệnh Các đĩa thạch để khô 45 min; CHÚ THÍCH 2: Nhiệt độ mơi trường phủ lên lớp thạch thứ từ 35 0C đến 45 0C Độ dày lớp thạch thứ hai từ mm đến mm - Dùng micropipet vô trùng hút 0,1 ml dung dịch mẫu (xem 7.1.5) cấy lên bề mặt lớp thạch thứ hai Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch mẫu tràn bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt dịch mẫu thấm hoàn toàn bề mặt lớp thạch thứ hai Chú ý không để dịch mẫu dính vào thành đĩa petri; - Các đĩa thạch nuôi cấy điều kiện nhiệt độ khoảng 280C đến 320C thời gian từ ngày đến ngày; - Mỗi mẫu lặp lại từ đến lần 7.2.2 Tính kết - Vi sinh vật có hoạt tính đối kháng tính số khuẩn lạc tạo vòng đối kháng (vòng suốt) bao quanh khuẩn lạc; - Mật độ vi sinh vật đối kháng đơn vị kiểm tra tính gam hay mililit, theo công thức (1) N C d (n1 0,1n2 ) (1) đó: N số vi sinh vật đối kháng đơn vị kiểm tra (được tính CFU gam hay mililit); C tổng số khuẩn lạc đặc trưng đếm tất đĩa petri giữ lại n1 số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ nhất; n2 số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai; d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha lỗng thứ CHÚ THÍCH 3: 1) Giữ lại đĩa có chứa khơng q 300 khuẩn lạc hai độ pha loãng điều cần thiết đĩa có chứa 15 khuẩn lạc; 2) Làm tròn kết đến hai chữ số có nghĩa; 3) Biểu thị mật độ vi sinh vật đơn vị kiểm tra cách lấy giá trị từ 1,00 đến 9,99 nhân với 10x, x số mũ 10 7.3 Xác định hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng 7.3.1 Xác định hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng thơng qua kích thước vòng đối kháng 7.3.1.1 Cấy mẫu (xem 7.2.1) 7.3.1.2 Tính kết Hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng thể thông qua kích thước vòng đối kháng (vòng tròn suốt bao quanh khuẩn lạc), tính mm theo cơng thức (2): Kích thước vòng đối kháng = D - d (2) Trong D đường kính vòng đối kháng, tính mm; d đường kính khuẩn lạc, tính mm kết giá trị trung bình cộng lần lặp lại 7.3.2 Xác định hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng thông qua tỷ lệ bệnh 7.3.2.1 Tiến hành thử nghiệm - Thử nghiệm tiến hành với công thức: Đối chứng (nhiễm nấm gây bệnh), thí nghiệm (nhiễm phân bón vi sinh vật nấm gây bệnh) Mỗi công thức lặp lại khơng lần với tổng số khơng 50 cây; - Phân bón vi sinh vật bón vào đất vơ trùng trước gieo trồng, đảm bảo mật độ vi sinh vật đối kháng đạt 106 CFU/g đất; - Ngâm hạt củ giống dịch nấm gây bệnh mật độ 108 CFU/ml thời gian 30 min; - Gieo (trồng) hạt (hoặc củ) nhiễm nấm gây bệnh vào đất công thức đối chứng đất nhiễm phân bón vi sinh vật cơng thức thí nghiệm; - Thí nghiệm chăm sóc theo quy trình phù hợp với đối tượng chủ; đảm bảo phát triển, phát sinh nấm bệnh Sử dụng nước vô trùng để giữ ẩm độ tương đối (RH) không nhỏ 70% nhiệt độ đạt từ 25 0C đến 30 0C; - Trong thời gian từ 30 đến 45 ngày kể từ gieo trồng, phải quan sát ghi nhận hàng ngày tình trạng sức khỏe trồng (khơng có triệu chứng bệnh có triệu chứng bệnh) CHÚ THÍCH 4: Thử nghiệm phải bảo đảm hạn chế tối đa ảnh hưởng yếu tố phi thí nghiệm 7.3.2.2 Tính kết Tỷ lệ bị bệnh (%) tính theo cơng thức: Tỷ lệ bị bệnh (%) = Trung bình cộng số bị bệnh Trung bình cộng số điều tra x 100 So sánh tỷ lệ bị bệnh công thức thí nghiệm với cơng thức đối chứng đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật theo cấp độ nêu Bảng Bảng - Mức độ hoạt tính đối kháng vi sinh vật Tỷ lệ bị bệnh (%) Cấp độ đối kháng Mức độ hoạt tính đối kháng Khơng lớn 30 Cao Từ 31 đến 50 Khá Từ 51 đến 70 Trung bình Từ 71 đến 80 Yếu Không nhỏ 80 Khơng có Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thơng tin sau: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - tất thao tác không quy định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng đến kết quả; - kết thử nghiệm thu được; - độ lặp lại kiểm tra, nêu kết cuối thu Phụ lục A (Tham khảo) Môi trường nuôi cấy A.1 Môi trường nuôi cấy nấm bệnh: Môi trường PDA Dextrose 20,0 g Khoai tây 20,0 g Thạch 20,0 g Nước 1000 ml pH 6,7 đến 6,8 CHÚ THÍCH A.1: - Khoai tây thái nhỏ, cho vào l nước đun sôi 20 min; - sau lọc lấy nước để sử dụng làm môi trường A.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật đối kháng A.2.1 Trong trường hợp biết rõ loài vi sinh vật đối kháng cần xác định, môi trường sử dụng để nuôi cấy mơi trường đặc hiệu mơi trường có thành phần thích hợp cho sinh trưởng phát triển loài vi sinh vật biết A.2.2 Trường hợp chưa biết xác vi sinh vật cần xác định lựa chọn môi trường nuôi cấy sau A.2.2.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường Thạch - Thịt-Pepton Pepton 10,0 g Cao thịt 3,0 g Thạch 20,0 g Nước 1000 ml pH 6,5 đến 7,5 CHÚ THÍCH A.2: pH mơi trường điều chỉnh HCl 1N NaOH 1N A.2.2.2 Môi trường nuôi cấy nấm A.2.2.2.1 Môi trường Czapek NaNO3 3,0 g Sacaroza 30,0 g KH2PO4 1,0 g MgSO4.7H2O 0,5 g Thạch 20,0 g Nước 1000 ml pH 6,0 đến 6,5 CHÚ THÍCH A.3: pH môi trường điều chỉnh HCl 1N NaOH 1N A.2.2.2.2 Môi trường Czapek-Dox NaNO3 2,0 g KCl 1,0 g KH2PO4 1,0 g MgSO4.7H2O 0,5 g FeSO4 0,01 g Thạch 20,0 g Nước 1000 ml pH 6,0 đến 6,5 A.2.2.3 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn A.2.2.3.1 Môi trường Gauze Tinh bột tan 20,0 g KNO3 1,0 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g NaCl 0,5 g FeSO4 0,01 g Thạch 20,0 g Nước 1000 ml pH 7,0 đến 7,2 CHÚ THÍCH A.4: pH mơi trường điều chỉnh HCl 1N NaOH 1N A.2.2.3.2 Môi trường ISP-4 Tinh bột tan 10,0 g KH2PO4 1,0g MgSO4.7H2O 1,0 g NaCl 1,0 g (NH4)2SO4 2,0 g CaCO3 1,0 g Thạch 15,0 g Nước 1000 ml pH 7,0 đến 7,2 CHÚ THÍCH A.5: pH môi trường điều chỉnh HCl 1N NaOH 1N Ngồi điều kiện hạn hẹp sử dụng môi trường PDA cho phát triển đa số vi khuẩn, hầu hết số xạ khuẩn ... nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - tất thao tác không quy định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng đến kết quả; - kết thử nghiệm thu được; - độ... nấm gây bệnh có độc tính kiểm tra khả gây bệnh vùng rễ trồng, cấy thạch đĩa chứa môi trường PDA chuẩn bị sẵn (xem Phụ lục A) Nuôi cấy thời gian khoảng ngày đến ngày nhiệt độ khoảng 28 0C đến 30... đĩa thạch - Pha mẫu: Dùng que cấy vô trùng lấy bào tử nấm gây bệnh vùng rễ đưa vào dịch pha loãng chuẩn bị sẵn (xem 7.1.3), trộn kỹ máy lắc hay máy trộn Vortex (5.1.9); mật độ bào tử không nhỏ 108