Đang tải... (xem toàn văn)
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5281:2007. Tiêu chuẩn giới thiệu về thức ăn chăn nuôi – xác định lysin hữu dụng. Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định lysin hữu dụng trong thức ăn chăn nuôi chứa các protein thực vật hoặc động vật.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5281 : 2007 THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH LYSIN HỮU DỤNG Animal feeding stuffs – Detemination of available lysine Lời giới thiệu Lysin sản phẩm thực phẩm thường coi dễ chuyển hóa nhóm amin cuối (amino ε ) chúng khơng kết hợp Phần lysin xác định nhóm kết hợp với 2,4-dinitrofluorobenzen Phạm vi lĩnh vực áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định lysin hữu dụng thức ăn chăn nuôi chứa protein thực vật động vật Tuy nhiên, so sánh với phép xác định sinh học phương pháp đánh giá lượng lysin hữu dụng cần phải ý phần giải thích kết Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu TCVN 4328 (ISO 5983), Thức ăn chăn ni – Xác định hàm lượng nitơ tính hàm lượng protein thô TCVN 6952:2001 (6498:1998), Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử Định nghĩa Lysin hữu dụng (available lysine): Lượng lysin lại sau lấy lượng lysin tổng số trừ lượng lysin không hữu dụng xác định điều kiện qui định tiêu chuẩn Lượng lysin hữu dụng biểu thị theo phần trăm khối lượng nguyên liệu thô Nguyên tắc Phần mẫu thử nghiền thủy phân axit clohydric, sau lysin tổng số tách sắc ký cột xác định đo phổ bước sóng 570 nm Phần mẫu thử nghiền thứ hai phản ứng với dung dịch etanol 2,4dinitrofluorobenzen môi trường kiềm, làm cho thủy phân axit clohydric, tách lysin không hữu dụng sắc ký cột, xác định đo phổ bước sóng 570 nm Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích Nước sử dụng phải nước nước cất nước có độ tinh khiết tương đương 5.1 Ete dietyl, không chứa peroxit 5.2 Natri bicacbonat, dung dịch 80g/l 5.3 2,4-Dinitrofluorobenzen (DNFB), dung dịch etanol Hòa tan 0,15 ml DNFB 12 ml etanol 95 % (theo thể tích) Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng 5.4 Axit clohydric, khoảng mol/l Trộn thể tích axit clohydric (p20 = 1,19 g/ml) với thể tích nước 5.5 Dung dịch natri xitrat, dung dịch đệm, pH khoảng 2,2 Hòa tan nước theo thứ tự sau: 21 g axit xitric ngậm phân tử nước; g natri hydroxit; 16 ml axit clohydric (p20 = 1,19 g/ml); 0,1 ml axit octanoic (caprylic); 20 ml thiodiglycol; ml dung dịch ete dodecyl polyoxyetylen 30 % (theo thể tích) với khoảng 23 phân tử oxy-etylen 1) Pha lỗng nước đến 000 ml 5.6 Natri xitrat, dung dịch đệm, pH = 5,28 Hòa tan nước theo thứ tự sau: 24,5 g axit xitric ngậm phân tử nước; 14 g natri hydroxit; 6,8 ml axit clohydric (p20 = 1,19 g/ml); 0,1 ml axit octanoic (caprylic); ml dung dịch ete dodecyl polyoxyetylen 30 % (theo thể tích) với khoảng 23 phân tử oxy-etylen 1) Pha lỗng nước đến 000 ml Dùng axit clohydric (p20 = 1,19 g/ml) dung dịch natri hydroxit 50 % (theo khối lượng) để chỉnh pH đến 5,28 ± 0,02 5.7 Thuốc thử ninhydrin 5.7.1 Natri propionat, dung dịch đệm, pH 5,5 ± 0,1 Hòa tan 168 g natri hydroxit khoảng 400 ml nước Làm nguội, thêm 498 ml axit propionic lắc liên tục Pha loãng nước đến 000 ml 5.7.2 Chuẩn bị thuốc thử Chuẩn bị thuốc thử ninhydrin môi trường nitơ nơi tối Cho lít peroxit khơng chứa ete monometyl glycol etylen, lít dung dịch đệm natri propionat (5.7.1) 40 g ninhyrin vào bình cầu lít, lắc hòa tan hết, sau thêm 1,33 g thiếc (II) clorua ngậm hai phân tử nước (SnCl2.2H2O) Lắc hòa tan hết (xem thích) Nếu giữ oC áp suất nhẹ môi trường nitơ nơi tối, thuốc thử bền tháng CHÚ THÍCH: Nếu xuất kết tủa SnCl2, thay kẽm (II) clorua 7,5 ml dung dịch thiếc (III) clorua 150 g/l 1,5 g hydrindantin lít thuốc thử 5.8 Lysin, dung dịch chuẩn, tương ứng với mmol lysin lít Hòa tan 182,5 mg lysin monohydroclorua 100 ml axit clohydric 0,1 mol/l Lấy xác 10 ml dung dịch pha lỗng đến 100 ml dung dịch đệm natri xitrat pH 2,2 (5.5) ml dung dịch chứa μ mol lysin Thiết bị, dụng cụ 1) Sản phẩm BRIJ 35 thích hợp có bán sẵn Thơng tin đưa để tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn ISO không ấn định sử dụng sản phẩm Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 6.1 Máy nghiền, có đặc tính sau đây: a) cấu tạo vật liệu không hút ẩm; b) dễ làm có khoảng trống khơng sử dụng tối thiểu; c) cho phép nghiền nhanh nghiền đều, khơng làm nóng q mức ngăn tiếp xúc với khơng khí bên ngồi nhiều tốt d) có khả điều chỉnh để thu hạt có kích cỡ qui định 7.1 6.2 Bình cầu, có dung tích 250 ml 000 ml, đáy phẳng, cổ ngắn có khớp nối mài hình nón bình sinh hàn khớp với bình cầu 6.3 Chén nung, thủy tinh thiêu kết loại P 16 (cỡ lỗ 10 μ m đến 16 μ m) 6.4 Bể dầu, khả trì nhiệt độ đảm bảo cho việc đối lưu (120 oC đến 130 oC) 6.5 Máy cất quay 6.6 Thiết bị phân tích tự động axit amin, khơng sẵn có, dùng hệ thống sắc ký thủ công bao gồm: a) sắc ký cột, chiều dài khoảng 250 mm đường kính mm trì nhiệt độ ổn định 55 oC túi nước bể tuần hoàn nhiệt, nhồi đầy đến 200 mm resin trao đổi cation với nhóm chức sulfonic, có cỡ hạt 13 ± μm 2) môi trường axit mạnh % b) bơm pittông nhỏ, tạo tốc độ 50 ml/giờ; c) thu nhận phần chiết; d) nồi cách thủy đun sôi; e) phổ kế cài đặt bước sóng 570 nm, có cuvét dày 10 mm 6.7 Pipet chia độ, có dung tích ml; ml 10 ml 6.8 Bình định mức, có dung tích 10 ml; 20 ml 100 ml 6.9 Cân phân tích Lấy mẫu TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị mẫu thử Nghiền từ g đến 10 g mẫu phòng thử nghiệm để thu hạt lọt hết qua sàng có cỡ lỗ 315 μm CHÚ THÍCH: Cỡ lỗ sàng qui định nhỏ so với khuyến cáo TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998) để đảm bảo tiếp xúc tối đa với DNFB 8.2 Phần mẫu thử Cân hai phần mẫu thử, phần tương ứng với khoảng 100 mg protein thơ xác đến 1mg cho vào hai bình cầu (6.2) [xem TCVN 4328 (ISO 5983) để xác định hàm lượng protein] 8.3 Lysin tổng số 8.3.1 Thủy phân axit clohydric 2) Sản phẩm Aminex A5 thích hợp có bán sẵn Thơng tin đưa để tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn ISO không ấn định sử dụng sản phẩm Cho 500 ml axit clohydric mol/l (5.4) vào bình cầu 000 ml (xem 8.2) Lập bình sinh hàn đặt bình cầu vào bể dầu (6.4) làm nóng trước từ 120 oC đến 130 oC Sau đun sôi nhẹ 24 giờ, làm nguội bình lọc lượng chứa bình qua chén nung (6.3) Sử dụng máy cất quay (6.5) làm bay dịch lọc nhiệt độ không 40 oC Cho nước vào cặn thu cho bay tiếp Lặp lại thao tác phần lớn axit clohydric loại bỏ hết; thông thường, tráng bốn lần, lần 30 ml nước đủ Hòa tan cặn dung dịch đệm natri xitrat có pH 2,2 (5.5) chuyển lượng sang bình định mức vạch 100 ml (6.8) Thêm dung dịch đệm natri xitrat pH 2,2 (5.5) vạch, lọc qua giấy lọc gấp nếp 8.3.2 Chuẩn bị cột lần cuối hấp thụ dịch thủy phân Nối bơm thiết bị (6.6) vào phận chứa dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6); sai chỉnh tốc độ dòng đến 50 ml/giờ Nối bơm vào cột resin, làm nóng trước đến 55 oC, cho dung dịch đệm (5.6) qua cột 20 phút để tạo cân Tháo bơm Loại bỏ phần lớn chất lỏng phía cột resin, ý cho bề mặt cột resin không bị khô Dùng pipet (6.7) lấy 0,5 ml dịch thủy phân (hoặc ml sử dụng hệ thống thủ cơng) cho lên cột, sau cho qua cột resin có hỗ trợ áp suất nitơ nhẹ Tráng thành cột 0,5 ml dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) cho qua cột resin Điền đầy cột đến đỉnh dung dịch đệm natri xitrat (5.6) nối với bơm 8.3.3 Xác định 8.3.3.1 Hệ thống tự động Cài đặt thiết bị phân tích Hiệu chuẩn thiết bị 0,25 μmol lysin [0,25 ml dung dịch chuẩn lysin (5.8)] theo lượng qui định dẫn nhà sản xuất, tiến hành mô tả 8.3.2 8.3.3.2 Hệ thống thủ công 8.3.3.2.1 Định vị lysin Phần chất rửa giải chứa lysin phải kiểm tra cách dùng dung dịch lysin biết trước nồng độ, ví dụ dung dịch μmol/ml (5.8) Đối với mục đích này, loại bỏ 25 ml đến 30 ml chất rửa giải thu lấy phần ml vào ống thử nghiệm phần thứ 50 tính từ bắt đầu rửa giải Thêm vào phần ml thuốc thử ninhydrin (5.7) vào phần từ phần 30 đến phần 50 Trộn đều, chuyển vào nồi cách thủy đun sôi để 15 phút Để nguội Pha loãng cách thêm 10 ml dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) Trộn đo chất hấp thụ 570 nm phổ kế, dùng dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) làm dịch lỏng đối chứng CHÚ THÍCH: Dưới điều kiện qui định, lysin thường rửa giải phần từ phần 39 đến phần 45, thông tin để tham khảo 8.3.3.2.2 Xác định Nếu lysin rửa giải từ phần từ phần 39 đến phần 45 loại bỏ 38 ml chất rửa giải đầu tiên, thu lấy gộp phần (phần thứ 39 đến phần thứ 45) tương ứng với pic lysin cho bay máy cất quay (6.5) CHÚ THÍCH: Sau thu hồi phần có chứa lysin, cho khoảng 200 ml dung dịch đệm qua cột để loại bỏ hết thành phần khơng mong muốn sót lại Hòa tan cặn ml dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) thêm ml thuốc thử ninhydrin (5.7) Trộn đều, chuyển vào nồi cách thủy đun sôi để 15 phút Để nguội Pha loãng hỗn hợp dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) cho nồng độ lysin dung dịch thử khoảng 0,02 μmol/ml (V1 phần thể tích mẫu thử thu được) Đo độ hấp thụ 570 nm phổ kế, dùng hỗn hợp phần thể tích dung dịch đệm natri xitrat (5.6) phần thể tích thuốc thử ninhydrin (5.7) làm dịch lỏng đối chứng, cho vào nồi cách thủy đun sơi 15 phút sau làm nguội pha lỗng đến thể tích V1 8.3.3.2.3 Hiệu chuẩn phổ kế Lấy xác ml dung dịch lysin chuẩn (5.8) Cho ml thuốc thử ninhydrin (5.7) Trộn đều, chuyển sang nồi cách thủy đun sôi để 15 phút Để nguội pha loãng đến 100 ml dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) Đo độ hấp thụ phổ kế điều kiện 8.3.3.2.2 8.4 Lysin không hữu dụng 8.4.1 Phản ứng dinitrophenylation Dùng pipet (6.7) chuyển ml dung dịch natri bicacbonat (5.2) cho vào bình cầu 250 ml (xem 8.2) Để khoảng 10 phút, khuấy liên tục Sau thêm dung dịch DNFB (5.3), đậy nắp bình, lắc đảm bảo hạt không bám lên thành bình, để hỗn hợp qua đêm nhiệt độ phòng nơi tối 8.4.2 Làm Dùng máy cất quay (6.5) làm bay khô nhiệt độ nhỏ 40 oC Cho 75 ml ete dietyl (5.1) vào bình cầu, khuấy để tách pha Loại bỏ hết ete dietyl, ý tránh kéo theo hạt rắn Lặp lại thao tác hai lần, lần dùng 50 ml ete dietyl Làm bay vết dietyl ete cuối cách đun nóng máy cất quay 8.4.3 Thủy phân axit clohydric Chuyển sang bình cầu 150 ml axit clohydric (5.4) tiến hành mô tả 8.3.1 chuyển hết lượng cặn hòa tan dung dịch đệm natri xitrat có pH 2,2 (5.5) bình định mức 20 ml (6.8) (hoặc 10 ml dùng hệ thống thủ công) 8.4.4 Làm lắng dịch thủy phân xác định Tiến hành mô tả 8.3.2 8.3.3 Trong trường hợp hệ thống thủ cơng, đọc lần cuối phổ kế thực cách pha lỗng thể tích lysin với hỗn hợp thuốc thử đến 20 ml dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) (V2 thể tích dung dịch thử thu được) 8.5 Số lần xác định Tiến hành hai lần xác định mẫu thử, hai cặp phần mẫu thử khác Biểu thị kết 9.1 Phương pháp tính cơng thức 9.1.1 Lysin tổng số 9.1.1.1 Xác định cách sử dụng dụng cụ phân tích tự động Lysin tổng số, w1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, tính công thức sau đây: 0,365 m V S S đó: S0 diện tích pic tương ứng với 0,25 μmol lysin; S1 diện tích pic tương ứng với lysin tổng số xác định 8.3.3.1; m1 khối lượng phần mẫu thử cho vào bình thứ nhất, tính gam; V0 thể tích dịch thủy phân chuyển vào cột (thơng thường, V0 = 0,5 ml), tính mililít 9.1.1.2 Xác định cách sử dụng hệ thống phân tích thủ cơng Lysin tổng số, w1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, tính cơng thức sau đây: V 0,073 m V A A đó: A0 độ hấp thụ dung dịch lysin chuẩn xác định 8.3.3.2.3; A1 độ hấp thụ xác định 8.3.3.2.2; V0 thể tích dịch thủy phân chuyển sang cột (thơng thường, V0 = ml), tính mililít m1 khối lượng phần mẫu thử cho vào bình cầu thứ nhất, tính gam; 9.1.2 Lysin không hữu dụng 9.1.2.1 Xác định cách sử dụng dụng cụ phân tích tự động Lysin khơng hữu dụng, w2, biểu thị phần trăm khối lượng, tính cơng thức sau đây: 0,073 m V S S đó: S0 diện tích pic tương ứng với 0,25 μmol lysin; S2 diện tích pic tương ứng với lysin khơng hữu dụng, xác định 8.4.4; m2 khối lượng phần mẫu thử cho vào cầu bình thứ hai, tính gam; V0 thể tích dịch thủy phân chuyển sang cột (thông thường, V0 = 0,5 ml), tính mililít 9.1.2.2 Xác định cách sử dụng hệ thống thủ công Lysin không hữu dụng, w2, biểu thị phần trăm khối lượng, tính công thức sau đây: V 0,0073 m V A A đó: A0 độ hấp thụ dung dịch lysin chuẩn xác định 8.3.3.2.3; A2 độ hấp thụ xác định 8.4.4; V0 thể tích dịch thủy phân chuyển sang cột (thông thường, V0 = ml), tính mililít; V2 thể tích dung dịch thử (thơng thường, V2 = 20 ml), tính mililít; m2 khối lượng phần mẫu thử cho vào bình thứ hai, tính gam; 9.1.3 Lysin hữu dụng Lysin hữu dụng, w3, biểu thị phần trăm khối lượng, tính cơng thức sau đây: w1 – w2 w1 lysin tổng số (xem 9.1.1); w2 lysin khơng hữu dụng (xem 9.1.2) CHÚ THÍCH: Lysin hữu dụng, biểu thị phần trăm khối lượng lysin tổng số, tính cơng thức sau đây: (w1 w2 ) w1 100 9.2 Độ lặp lại Chênh lệch kết thu hai lần xác định tiến hành đồng thời nhanh người phân tích khơng q 10 % giá trị trung bình kết thu 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu phương pháp sử dụng kết thu Báo cáo phải đề cập đến chi tiết không qui định tiêu chuẩn tùy ý lựa chọn, với chi tiết ảnh hưởng đến kết Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu ... nước Làm nguội, thêm 498 ml axit propionic lắc liên tục Pha loãng nước đến 000 ml 5.7.2 Chuẩn bị thuốc thử Chuẩn bị thuốc thử ninhydrin môi trường nitơ nơi tối Cho lít peroxit khơng chứa ete monometyl... cụ 1) Sản phẩm BRIJ 35 thích hợp có bán sẵn Thơng tin đưa để tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn ISO không ấn định sử dụng sản phẩm Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường... Bình định mức, có dung tích 10 ml; 20 ml 100 ml 6.9 Cân phân tích Lấy mẫu TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị mẫu thử Nghiền từ g đến 10 g mẫu phòng thử nghiệm để thu hạt lọt