Đang tải... (xem toàn văn)
Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8182:2009 - ISO 9232:2003. Tiêu chuẩn giới thiệu nội dung về sữa chua - nhận biết các vi sinh vật đặc trưng. Tiêu chuẩn này quy định các phép thử đặc biệt nhận biết các vi sinh vật đặc trưng trong sữa chua bằng kỹ thuật dựa trên các đặc tính hình thái, sinh lý và nuôi cấy của chúng.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8182 : 2009 ISO 9232 : 2003 SỮA CHUA – NHẬN BIẾT CÁC VI SINH VẬT ĐẶC TRƯNG (Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Streptococcus thermophilus) Yogurt – Identification of characteristic microorgranisms (Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus and Streptococcus thermophilus) Lời nói đầu TCVN 8182 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 9232 : 2003; TCVN 8182 : 2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố SỮA CHUA – NHẬN BIẾT CÁC VI SINH VẬT ĐẶC TRƯNG (Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Streptococcus thermophilus) Yogurt – Identification of characteristic microorgranisms (Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus and Streptococcus thermophilus) Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phép thử đặc biệt nhận biết vi sinh vật đặc trưng sữa chua kỹ thuật dựa đặc tính hình thái, sinh lý ni cấy chúng Phương pháp áp dụng cho chủng phân lập từ sữa chua có mặt sống hai loại vi sinh vật đặc trưng Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn chung chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân TCVN 8177 : 2009 (ISO 7889 : 2003), Sữa chua – Định lượng vi sinh vật đặc trưng – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 37oC Định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: Vi sinh vật đặc trưng sữa chua (characteristic microorganisms in yogurt) Là Lactibacillus delbrueckii subsp bulgaricus Streptococcus thermophilus 4 Nguyên tắc 4.1 Xác định đặc trưng sinh hóa, ni cấy hình thái Lactibacillus delbrueckii subsp bulgaricus 4.2 Xác định đặc trưng sinh hóa, ni cấy hình thái Streptococcus thermophilus Mơi trường cấy, dịch pha loãng thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích nước phải nước cất thủy tinh nước loại khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có qui định khác Nước dùng để chuẩn bị dung dịch enzym phải nước cất hai lần dụng cụ thủy tinh Xem TCVN 6404 (ISO 7218) TCVN 6263 (ISO 8261) Đối với vật liệu khác, xem TCVN 8177 : 2009 (ISO 7889 : 2003) 5.1 Môi trường nuôi cấy Chỉ sử dụng môi trường nuôi cấy vừa chuẩn bị không để tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng Nếu môi trường nuôi cấy chuẩn bị mà chưa sử dụng chúng phải làm mát bảo quản từ 2oC đến 4oC không tuần điều kiện không làm thay đổi thành phần mơi trường, trừ có qui định khác Cũng thuốc thử, xem điều kiện bảo quản qui định TCVN 6404 (ISO 7218) 5.1.1 Sữa gầy 5.1.1.1 Thành phần Sữa gầy sấy phun, xử lý nhiệt độ thấp, không chứa chất gây ức chế Nước, đến 100 g 000 ml 5.1.1.2 Chuẩn bị Hòa tan sữa bột nước Phân phối lượng 10 ml dung dịch thu vào ống nghiệm 16 mm x 160 mm (6.5) Khử trùng hấp áp lực 110 oC ± 1oC 30 115oC ± 1oC 20 Sau khử trùng trước sử dụng, kiểm tra độ vô trùng cách ủ ống nghiệm tủ ấm (6.1) 37oC ngày 5.1.2 Canh thang MRS 5.2.1.1 Thành phần Pepton (sản phẩm thủy phân tryptic casein) 10,00 g Chất chiết thịt 10,00 g Chất chiết nấm men (khô) 5,00 g Glucoza (C6H12O6) 20,00 g Tween 80 (sorbitan mono-oleat) 1,00 ml Dikali hydro ortophosphat (K2HPO4) 2,00 g Natri axetat ngậm ba phân tử nước (CH3CO2Na.3H2O) 5,00 g Diamoni xitrat [C6H6O7(NH4)2] 2,00 g Magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O) 0,20 g Mangan sulfat ngậm bốn phân tử nước (MnSO4.4H2O) 0,05 g Nước, đến 5.1.2.2 Chuẩn bị 000 ml Hòa tan thành phần riêng lẽ nước sôi Làm nguội nồi cách thủy (6.8) đến 50oC Chỉnh pH để sau khử trùng, pH 6,5 ± 0,2 25oC ±1oC cách thêm thuốc thử (5.2) kiểm tra máy đo pH (6.4) Chuyển lượng 20 ml môi trường thu sang ống nghiệm 20 mm x 200 mm (6.5) Khử trùng hấp áp lực 121oC ± 1oC 15 CHÚ THÍCH: Khi sử dụng mơi trường MRS có bán sẵn, nhà sản xuất khác cho kết thu khác Do đó, sử dụng mơi trường MRS chuẩn bị sẵn cần kiểm tra lại theo môi trường chuẩn bị theo tiêu chuẩn 5.1.3 Môi trường cho phép thử lên men 5.1.3.1 Thành phần Sử dụng thành phần 5.1.2.1 canh thang MRS, không dùng chất chiết thịt glucoza 5.1.3.2 Chuẩn bị Chuẩn bị thành phần theo 5.1.2.2 canh thang MRS, sử dụng thành phần 5.1.3.1 chỉnh pH cho sau khử trùng, pH 6,95 ± 0,05 thay cho 6,5 ± 25 oC ± 1oC 5.1.4 Môi trường nuôi cấy để sản sinh CO2 5.1.4.1 Thành phần Sử dụng thành phần 5.1.2.2 canh thang MRS, không dùng chất chiết thịt thay 20 g glucoza 50 g glucoza 5.1.4.2 Chuẩn bị Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 5.1.2.2 canh thang MRS, sử dụng thành phần 5.1.4.1 chỉnh pH cho sau khử trùng, pH 6,95 ± 0,05 thay cho 6,5 25 oC ± 1oC Chuyển lượng 10 ml thay cho 20 ml (như qui định 5.1.2.2) môi trường thu vào ống nghiệm 16 mm x 160 mm (6.5) Khử trùng hấp áp lực 121 oC ± 1oC 15 5.1.5 Thạch để phủ 5.1.5.1 Thành phần Thạch dùng cho phân tích vi khuẩn Nước, đến 20 g 000 ml 5.1.5.2 Chuẩn bị Hòa tan thạch nước Phân phối lượng 10 ml dung dịch thu vào ống nghiệm 16 mm x 160 mm (6.5) Khử trùng hấp áp lực 121 oC ±1oC 15 5.1.6 Sữa quỳ (litmus milk) 5.1.6.1 Thành phần Bột quỳ Sữa gầy (5.1.1), đến 0,70 g 000 ml 5.1.6.2 Chuẩn bị Chuẩn bị sữa quỳ 5.1.1.2 sữa gầy, sử dụng thành phần 5.1.6.1 CHÚ THÍCH: Bột quỳ sữa bột gầy với quỳ có bán sẵn thị trường 5.1.7 Canh thang M17 5.1.7.1 Môi trường 5.1.7.1.1 Thành phần Pepton (sản phẩm thủy phân tryptic casein) 2,50 g Pepton (sản phẩm thủy phân peptit thịt) 2,50 g Pepton (sản phẩm thủy phân papain đậu tương) 5,00 g Chất chiết nấm men (khô) 2,50 g Chất chiết thịt 5,00 g -Glyxerophosphat (muối dinatri) (C3H7O6PNa2) 19,00 g Mangan sulfat ngậm bốn phân tử nước (MnSO4.7H2O) 0,25 g Axit ascorbic (C6H8O6) 0,50 g Nước, đến 950 ml 5.1.7.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần riêng rẽ nước sôi Làm nguội nồi cách thủy (6.8) đến 50oC Chỉnh pH để sau khử trùng, pH 6,8 ± 0,2 25oC ±1oC cách thêm thuốc thử (5.2) kiểm tra máy đo pH (6.4) Chuyển lượng 19 ml môi trường thu sang ống nghiệm 20 mm x 200 mm (6.5) Khử trùng hấp áp lực 121oC ± 1oC 15 5.1.7.2 Dung dịch lactoza 5.1.7.2.1 Thành phần Lactoza (C12H22O11) Nước, đến 10 g 100 ml 5.1.7.2.2 Chuẩn bị Hòa tan lactoza nước Khử trùng hấp áp lực 121 oC ± 1oC 15 5.1.7.3 Mơi trường hồn chỉnh 5.1.7.3.1 Thành phần Dung dịch lactoza (5.1.7.2) ml Môi trường (5.1.7.1) 19 ml 5.1.7.3.2 Chuẩn bị Ngay trước sử dụng, cho dung dịch lactoza vào môi trường (5.1.7.1) đựng ống nghiệm Xoay bình để trộn CHÚ THÍCH: Khi sử dụng mơi trường M 17 có bán sẵn, kết thu từ mơi trường nhà cung cấp khác khác đáng kể Do đó, mơi trường M17 cần kiểm tra dựa vào môi trường chuẩn bị theo tiêu chuẩn 5.1.8 Môi trường ni cấy có chứa NaCl 6,5% 5.1.8.1 Thành phần Sử dụng thành phần 5.1.7.1.1 canh thang M17, thay 19 g thành phần -Glyxerophosphat 65 g muối natri clorua (NaCl) 5.1.8.2 Chuẩn bị Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 5.1.7.1.2 canh thang M17, phân phối lượng 10 ml thay cho 19 ml (như 5.1.7.1.2) môi trường thu vào ống nghiệm 16 mm x 160 mm (6.5) Khử trùng hấp áp lực 121 oC ± 1oC 15 5.2 Thuốc thử để điều chỉnh pH 5.2.1 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l 5.2.2 Axit clohydrit loãng, c(HCl) = 0,1 mol/l 5.3 Thuốc nhuộm, dung dịch xanh metylen etanol, g/l 5.4 Thuốc thử phản ứng catalaza, hydro peroxit (H2O2), 1,5% (thể tích) Thiết bị, dụng cụ Khử trùng tất dụng cụ tiếp xúc với mẫu thử, với dịch pha lỗng, với dung dịch mơi trường ni cấy phù hợp với yêu cầu TCVN 6263 (ISO 8261) Các dụng cụ thủy tinh phải bền với việc khử trùng nhiều lần Sử dụng thiết bị thông thường phòng thử nghiệm vi sinh (xem TCVN 6404 (ISO 7218) cụ thể sau: 6.1 Tủ ấm, có khả trì nhiệt độ 10oC ± 1oC, 15oC ± 1oC, 37oC ± 1oC 45oC ±1oC 6.2 Máy xoay trộn ống nghiệm, ví dụ: máy trộn Vortex 6.3 Thấu kính phóng đại, phóng đại từ lần đến 10 lần 6.4 Máy đo pH, có bù nhiệt, có độ xác tới ± 0,1 đơn vị pH 25oC ± 1oC [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 6.5 Ống nghiệm, có nắp đậy nút cao su, kích thước 16 mm x 160 mm 20 mm x 200 mm, để đựng môi trường nuôi cấy 6.6 Pipet chia độ, dùng cho vi sinh vật, khử trùng hiệu chuẩn tồn dải đo, phân phối ml ± 0,02 ml 10 ml ± 0,2 ml [xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1)] Trước khử trùng sử dụng pipet làm hợp chất nhân tạo thay cho pipet thủy tinh 6.7 Đũa thủy tinh 6.8 Nồi cách thủy, có khả trì nhiệt độ 10oC ± 1oC, từ 44oC đến 47oC, 45oC ± 1oC 50oC ± 1oC nhiệt độ sơi Cách tiến hành 7.1 Phân lập khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc từ đĩa dùng để đếm, thu TCVN 8177 : 2009 (ISO 7889 : 2003), cách sử dụng thấu kính phóng đại (6.3), cần Cấy vào canh thang qui định để thu khuẩn lạc khiết sau ủ Ủ tủ ấm (6.1) 37 oC 24h, điều kiện khơng khí qui định TCVN 8177 : 2009 (ISO 7889 : 2003) 7.2 Các đặc trưng kiểu hình cần để nhận biết L delbrueckii subp bulgaricus 7.2.1 Môi trường nuôi cấy 7.2.1.1 Sử dụng sữa gầy (5.1.1) canh thang MRS (5.1.2) dịch cấy thông thường phép thử sinh lý, sau 7.2.1.2 Đối với phép thử lên men, sử dụng kit thử có bán sẵn thích hợp cho mục đích với vi sinh vật cần nghiên cứu Tuân thủ hướng dẫn nhà sản xuất cách xác CHÚ THÍCH: Mơi trường phép thử lên men (5.1.3) cung cấp kit thử chẩn đoán sử dụng để chuẩn bị chất cấy khuẩn lạc 7.2.2 Các đặc tính cần xem xét 7.2.2.1 Hình thái Sử dụng dịch cấy khiết chuẩn bị vòng 24h phát triển sữa gầy (5.1.1) tủ ấm (6.1) 37oC 24h Nhuộm màu dịch cấy xanh metylen (5.3) vài phút trước lấy để kiểm tra kính hiển vi Về hình dạng cách xếp tế bào, xem Bảng A.1 Phụ lục A Trong tế bào phải nhìn thấy hạt volutin 7.2.2.2 Phản ứng catalaza Trộn thể tích dịch cấy canh thang MRS (xem 7.1), ủ tủ ấm (6.1) 37oC từ 18h đến 24h với hydro peroxit 1,5% ống nghiệm (6.5) đậy nút cao su Đồng thời chuẩn bị canh thang kiểm chứng không cấy Lật ngược ống nhẹ nhàng lần để trộn quan sát bọt khí oxi hình thành canh thang nhiệt độ phòng sau 20 L delbrueckii subp bulgaricus khơng sinh khí oxi Phép thử âm tính có sinh khí ống kiểm chứng 7.2.2.3 Phát triển canh thang 150C 450C Sử dụng giọt dịch cấy chủng thử nghiệm, ủ canh thang MRS (xem 7.1) tủ ấm (6.1) 370C 18 h đến 24 h, để cấy vào hai canh thang MRS (5.1.2.2) Một canh thang trước cần đưa 150C nồi cách thủy (6.8) canh thang lại đưa 450C nồi cách thủy khác Ủ canh thang tủ ấm (6.1) 15 0C canh thang lại 450C đến ngày Quan sát độ đục L delbrueckii subp bulgaricus khơng phát triển 15oC có phát triển 45oC cho thấy đục 7.2.2.4 Sinh khí CO2 Cấy vào 10 ml môi trường nuôi cấy (5.1.4) 0,1 ml chủng cấy canh thang MRS chủng thử nghiệm (xem 7.1) ủ tủ ấm (6.1) 37 oC từ 18h đến 24h Không để dịch cấy bị nhiễm bẩn phía canh thang bên ống nghiệm Phủ bề mặt canh thang lớp thạch phủ (5.1.5) dày khoảng cm làm tan chảy, làm nguội đến 47 oC ± 1oC Ủ tuần tủ ấm (6.1) 37oC Sự có mặt khí chứng lớp thạch tách khỏi lượng chứa phía Dưới điều kiện L delbrueckii subp bulgaricus khơng sinh khí 7.2.2.5 Lên men loại đường Để chuẩn bị dịch cấy đọc kết quả, cần thực hướng dẫn kit thử chẩn đoán 7.2.2.6 Xác định chất đồng phân đối ảnh (đồng phân quang học) axit lactic dịch cấy sữa 7.2.2.6.1 Yêu cầu chung Khi sử dụng kit thử chẩn đốn có bán sẵn, cần tuân theo dẫn nhà sản xuất 7.2.2.6.2 Chuẩn bị Cấy truyền liên tiếp hai lần dịch cấy khiết chủng thử nghiệm sữa gầy hấp áp lực (5.1.1) cách ủ tủ ấm (6.7) để 37 oC dịch cấy kết thành khối (khoảng 16h) Kiểm tra dịch cấy kính hiển vi độ khiết sử dụng đốm nhuộm xanh metylen (5.3) [xem 9.2 TCVN 8177 : 2009 (ISO 7889 : 2003)] Cấy truyền lần thứ ba sữa gầy hấp áp lực (5.1.1), sử dụng 0,1 ml chất cấy Ủ tiếp 48h tủ ấm (6.7) để 37 oC Sau kiểm tra kính hiển vi độ khiết, đồng hóa lượng chứa ống nghiệm đũa thủy tinh (6.7) Dưới điều kiện này, L delbrueckii subsp bulgaricus tạo 95% D(-) lactic Do nên xác định hàm lượng axit lactic chất đồng phân đối ảnh lactat dịch cấy mẫu theo phương pháp Phụ lục B 7.2.2.6.3 Phương pháp tính Tính hàm lượng axit D(-) lactic mẫu, theo công thức sau: w D( CD( ) CD( ) ) CL ( x100% ) wD(-) phần trăm khối lượng dạng D(-) hàm lượng axit lactic tổng số mẫu; CD(-) phần khối lượng axit D(-) lactic, tính phần trăm (%); CL(+) phần khối lượng axit L(+) lactic, tính phần trăm (%) 7.2.2.6.4 Biểu thị kết Biểu thị kết thu đến hai chữ số thập phân 7.3 Các đặc trưng kiểu hình yêu cầu để nhận biết S thermophilus 7.3.1 Môi trường nuôi cấy Đối với dịch cấy thông thường phép thử sinh lý, sử dụng sữa quỳ (5.1.6.2) canh thang M 17 (5.1.7.1.2) 7.3.2 Các đặc trưng cần xem xét 7.3.2.1 Hình thái Sử dụng dịch cấy sữa quỳ vừa chuẩn bị (5.1.6.2) Nhuộm tiêu dịch cấy xanh metylen (5.3) vài phút trước kiểm tra kính hiển vi Đối với hình dạng cách bố trí tế bào, xem Bảng A.2 7.3.2.2 Phản ứng catalaza Xem 7.2.2.2 Dưới điều kiện S thermophilus không sinh oxi Xem Bảng A.2 7.3.2.3 Phát triển sữa quỳ 10oC 45oC Cấy vào ống nghiệm chứa sữa quỳ (5.1.6.2) giọt dịch cấy canh thang M 17 (xem 7.1) chủng cần thử nghiệm ủ qua đêm tủ ấm (6.1) 37 oC Giữ ống nghiệm có liên quan tủ ấm 10 oC ống nghiệm khác để tủ ấm khác 45oC đến ngày Ở nhiệt độ 10oC ± 1oC S thermophilus không đổi màu sữa quỳ, 45oC ± oC thay đổi theo mẫu Acr (7.3.2.4) (xem Bảng A.2) 7.3.2.4 Phản ứng sữa quỳ (Arc = axit hóa, ngưng tụ, khử) Sữa quỳ axit hóa S thermophilus thành màu hồng sau đơng tụ Sau đơng tụ giữ màu hồng quỳ khử chậm phần lớn khơng hồn tồn với vòng phía có màu đậm (xem Bảng A.2) 7.3.2.5 Phát triển có mặt natri clorua Cấy vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy (5.1.8.2) với giọt dịch cấy canh thang M 17 (xem 7.1) chủng cần thử nghiệm ủ qua đêm tủ ấm 37 oC Giữ ống nghiệm đến ngày tủ ấm (6.2) 370C Dưới điều kiện này, không xuất đục với S thermophilus (xem Bảng A.2) 7.3.2.6 Sử dụng đường Bảng A.1 cho thấy phần lớn loại đường có giá trị để phân biệt L delbrueckii subsp bulgaricus với lồi khác thuộc nhóm phân lồi lactobacilli lên men đồng hình bắt buộc Kiểm tra dải thử nghiệm có bán sẵn nuôi cấy phản ứng với đường theo hướng dẫn nhà sản xuất Biểu thị kết 8.1 So sánh kết thử nghiệm thu 7.2 với thuộc tính L delbrueckii subsp bulgaricus Bảng A.1 8.2 So sánh kết thử nghiệm thu 7.3 với thuộc tính S thermophilus Bảng A.2 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; e) kết thử nghiệm thu Phụ lục A (Qui định) Các bảng thuộc tính Bảng A.1 – Các thuộc tính L delbrueckii subsp bulgaricus, L delbrueckii subsp Lactis, L helveticus L acidophilus Thuộc tính L delbrueckii subsp bulgaricus L delbrueckii subsp Lactis L helveticus L acidophilus Hình thái học Hình que có đầu tròn Thay đổi theo thời gian, môi trường, chủng Nhiều cá thể đổi màu tế bào chủng cấy nhuộm xanh metylen lâu ngày Như L delbrueckii subsp bulgaricus Hiện tượng nhiều hình thái dịch cấy lâu ngày không đánh dấu L delbrueckii subsp bulgaricus L delbrueckii subsp Lactis Khơng có cá thể đổi màu Hình que có đầu tròn, đơn lẻ ghép thành cặp chuỗi ngắn Khơng có cá thể đổi màu Phản ứng catalaza - - - - Sinh CO2 từ glucoza - - - - Phát triển 15oC ± 1o C - - - - Phát triển 45oC ± 1o C + + + + + + +/- + Các đường lên men Fructoza Galactoza - +/- + + Glucoza + + + + Lactoza + + + + Maltoza - + +/- + Mannoza +/- + +/- + Sacaroza - + - + Trehaloza - + +/- +/- Gluconat - - - - Xellobioza - - - + Esculin - - - + D(-) D(-) DL DL Chất đồng phân đối ảnh axit lactic + = phản ứng dương tính 90% nhiều chủng - = phản ứng âm tính 90 % nhiều chủng +/- = phản ứng thay đổi, yếu, chậm âm tính Các mẫu lên men đường liên quan đến kết đạt với kit thử chẩn đốn có bán sẵn để nhận biết vi khuẩn axit lactic Xem Phụ lục B Bảng A.2 – Các thuộc tính S thermophilus Thuộc tính Hình thái học Vẻ bên ngồi Chú ý Các tế bào hình cầu hình trứng kết thành cặp thành chuỗi dài, nhiều hình thái khỏe tế bào lâu ngày Phản ứng catalaza o o Phát triển 10 C ± C - Lactococci mọc 10oC Phát triển 45oC ± 1oC + Lactococci khơng mọc 45oC Nhóm D streptococci mọc 10oC 45oC Phần ứng sữa quỳ - axit hóa nhanh A - ngưng tụ C Lactococci nhóm D streptococci phản ứng RAC - chậm thường khơng hồn tồn Khử quỳ R Phát triển có mặt NaCl (6,5 %) - S thermophilus nhạy với NaCl Nhóm D streptococci mọc có mặt NaCl 6,5% + = phản ứng dương tính 90% nhiều chủng - = ln phản ứng âm tích Phụ lục B (Qui định) Dịch cấy sữa vi khuẩn axit lactic – Xác định hàm lượng axit lactic chất đồng phân đối ảnh lactat B.1 Yêu cầu chung Phụ lục qui định phương pháp enzym để xác định chất đồng phân đối ảnh (đồng phân quang học) axit lactic lactat Phương pháp áp dụng cho chủng sữa gầy lactobacilli phân lập từ sữa chua CHÚ THÍCH: Phương pháp soạn thảo dựa kết phép thử vòng, thay phép thử sinh hóa riêng lẻ (B.4.6 đến B.4.9) tổ hợp phép thử thích hợp có bán sẵn B.2 Thuật ngữ định nghĩa Trong Phụ lục sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: B.2.1 Hàm lượng axit lactic chất đồng phân đối ảnh lactat dung dịch cấy sữa L delbrueckii subsp bulgaricus (content of lactic acid and lactates enantiomers of L delbrueckii subsp bulgaricus) Phần khối lượng chất xác định qui trình qui định phụ lục CHÚ THÍCH: Các hàm lượng biểu thị phần trăm khối lượng B.3 Nguyên tắc B.3.1 Các dịch cấy mẫu chuẩn bị sữa gầy hấp áp lực Chuẩn bị dung dịch pha lỗng thích hợp mẫu cho kết tủa protein chất béo, sau lọc Xử lý dịch lọc với enzym chất sinh hóa sau đây, thêm lúc theo thứ tự sau: a) L-lactat dehydrogenaza (L-LDH, EC 1.1.1.27) D-lactat dehydrogenaza (D-LDH, EC 1.1.1.28) có mặt nicotilamid adenin dinucleotid (NAD) để oxi hóa lactat thành pyruvat chuyển NAD thành dạng khử (NADH); b) glutamat-pyruvat transaminaza (GPT, EC 2.6.1.2) có mặt L-glutamat để chuyển pyruvat L-alanin chuyển L-glutamat thành α-ketoglutarat B.3.2 Hàm lượng NADH xác định đo phổ cách đọc độ hấp thụ dung dịch thử 340 nm B.3.3 Hàm lượng axit lactic chất đồng phân đối ảnh lactat đo lượng pháp với lượng NADH theo phản ứng sau đây: L/D-lactat + NAD pyruvat + NADH + H+ Pyruvat + L-glutamat + GPT L-alanin + - ketoglutarat B.4 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích nước phải nước cất thủy tinh nước loại khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có qui định khác Nước dùng để chuẩn bị dung dịch enzym phải nước cất hai lần dụng cụ thủy tinh Xem TCVN 6404 (ISO 7218) TCVN 6283 (ISO 8261) B.4.1 Dung dịch kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (K 4[Fe(CN)6].3H2O) Hòa tan 3,6 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (K 4[Fe(CN)6].3H2O) nước đựng bình định mức vạch dung tích 100 ml (B.5.5) Thêm nước đến vạch trộn B.4.2 Dung dịch kẽm sulfat Hòa tan 7,2 g kẽm sulfat ngậm bảy phân tử nước (ZnSO 4.7H2O) nước đựng bình định mức vạch 100 ml (B.5.5) Thêm nước đến vạch trộn B.4.3 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l Hòa tan 0,4 g natri hydroxit nước đựng bình định mức vạch dung tích 100 ml (B.5.5) Thêm nước đến vạch trộn B.4.4 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mol/l Hòa tan 40 g natri hydroxit (NaOH) nước đựng bình định mức vạch dung tích 100 ml (B.5.5) Thêm nước đến vạch trộn B.4.5 Dung dịch đệm đến pH 10,0: c(glyxylglyxin) = 0,6 mol/l; c(L-glutamat) = 0,1 mol/l Hòa tan 4,75 g glyxylglyxin 0,88 g axit L-glutamic khoảng 50 ml nước bình nón (B.5.4) Chỉnh pH đến 10,0 khoảng 4,6 ml dung dịch natri hydoxit 10 mol/l (B.4.4) thêm nước đến 60 ml dung dịch bền tháng bảo quản oC B.4.6 Dung dịch nicotilamide-adenine dinucleotide, c(NAD) = 47 mmol/l Hòa tan 420 mg NAD với 12 ml nước bình nón (B.5.4) Dung dịch bền tuần bảo quản 4oC B.4.7 Glutamat-pyruvat transaminaza, c(GPT) = 20 mg/ml Ly tâm ml huyền phù GPT máy ly tâm (B.5.1) với tần số quay khoảng 4000 -1 10 Hút loại bỏ 1,0 ml phần phía suốt Huyền phù GPT thu bền năm bảo quản 4oC B.4.8 Dung dịch L-lactat dehydrogenaza, c(L-LDH) = 10 mg/ml Chỉ sử dụng dung dịch L-lactat dehydrogenaza không pha lỗng Dung dịch bền năm bảo quản 4oC B.4.9 Dung dịch D-lactat dehydrogenaza, c(D-LDH) = mg/ml Chỉ sử dụng dung dịch D-lactat dehydrogenaza khơng pha lỗng Dung dịch bền năm bảo quản 4oC B.5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị thông thường phòng thử nghiệm cụ thể sau: B.5.1 Máy ly tâm, có tần số quay 000 min-1 B.5.2 Cân phân tích, cân xác đến 10 mg B.5.3 Ống nghiệm, có nắp đậy nút cao su, kích thước 20 mm x 200 mm B.5.4 Bình nón, dung tích 25 ml, 50 ml 150 ml B.5.5 Bình định mức vạch, dung tích 100 ml B.5.6 Pipet, phân phối ml, ml, 0,2 ml, 0,05 ml 0,02 ml B.5.7 Pipet chia độ, dung tích ml, có vạch chia 0,1 ml B.5.8 Phễu lọc, đường kính khoảng cm B.5.9 Giấy lọc gấp nếp, loại trung bình, đường kính khoảng 15 cm, khơng chứa axit lactic lactat B.5.10 Đũa thủy tinh B.5.11 Cánh khuấy chất dẻo, trộn lượng chứa cuvet đo phổ B.5.12 Máy đo phổ, đo 340 nm B.5.13 Cuvet UV sử dụng lần, có chiều dài đường quang cm B.6 Chuẩn bị mẫu thử B.6.1 Chuẩn bị dịch cấy theo 7.2.2.6 B.6.2 Chuẩn bị “mẫu trắng” cách cấy ống nghiệm sữa gầy hấp áp lực chuẩn bị theo 5.1.1 với 1% nước tiệt trùng Ủ tủ ấm (6.1) 37 oC 48h B.6.3 Bảo quản dịch cấy mẫu chuẩn bị (B.6.1) đông lạnh đông lạnh sâu phân tích B.7 Cách tiến hành CHÚ Ý – Tránh làm nhiễm bẩn, đặc biệt đổ mồ chứa axit L(+) lactic Chú ý khơng chạm vào đầu típ pipet, đũa chất dẻo, giấy lọc… Nên sử dụng găng tay chất dẻo B.7.1 Phần mẫu thử Cân 2,00 g dịch cấy mẫu (B.6.3), xác đến 10 mg bình định mức (B.5.5) B.7.2 Phép thử trắng Tiến hành phép thử trắng lên “mẫu trắng” chuẩn bị B.6.2 lô bột sữa gầy sử dụng Tiến hành theo B.7.1, B.7.3 B.7.4, sử dụng tất thuốc thử không dùng phần mẫu thử Sử dụng cơng thức để tính (xem B.8) B.7.3 Khử protein B.7.3.1 Cho vào phần mẫu thử (B.7.1) 50 ml nước thứ tự sau: 5,0 ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (B.4.1), 5,0 ml dung dịch kẽm sulfat (B.4.2) 10,0 ml dung dịch natri hydroxit (B.4.3), xoay bình để trộn sau lần thêm Pha loãng nước đến vạch 100 ml trộn Để yên hỗn hợp 30 B.7.3.2 Lọc qua giấy lọc (B.5.9), loại bỏ vài mililit dịch lọc Dịch lọc màu trắng đục sử dụng để thử nghiệm B.7.4 Phương pháp xác định B.7.4.1 Yêu cầu chung Lượng axit L(+) D(-) lactic lactate có cuvet (B.5.13) cần dao động khoảng từ µg đến 20 µg Do đó, dịch lọc cần pha lỗng lỗng đủ để có dung dịch mẫu có nồng độ đồng phân đối ảnh L(+) D(-) từ 0,02 g/l đến 0,2 g/l B.7.4.2 Xác định axit L(+) lactic lactat Dùng pipet cho vào cuvet UV dùng lần (B.5.13) sau: Dung dịch đệm (B.4.5) 1,00 ml NAD (B.4.6) 0,20 ml GPT (B.4.7) 0,02 ml Nước 0,90 ml Sau đó, sau khoảng thời gian định (ví dụ: 30 s), thêm 0,10 ml nước (trắng) mẫu trắng (B.6.2), dịch cấy mẫu thử (B.6.1) Dùng cánh khuấy chất dẻo (B.5.11) trộn kỹ Đọc độ hấp thụ dung dịch dựa vào khơng khí (A 1) sau Bắt đầu cho phản ứng enzym cách thêm 0,02 ml L-LDH (B.4.9) vào cuvet khoảng thời gian định (ví dụ 30 s) Trộn kỹ Khi kết thúc phản ứng (sau 10 min), đọc lại độ hấp thụ dung dịch (A2) Tính chênh lệch độ hấp thụ (A2 - A1) mẫu trắng (∆Ab), với phép thử mẫu trắng ∆Asb) (B.6.2) mẫu thử (∆As) (B.6.1) Lấy chênh lệch độ hấp thụ phép thử mẫu trắng phép thử trắng trừ chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng sau: AL(+)=∆As - ∆Ab Asb = ∆Asb - ∆Ab B.7.4.3 Xác định axit D(-) lactic lactat Dùng pipet lấy lượng thành phần theo qui trình B.7.4.2 đến trộn cánh trộn chất dẻo Đọc độ hấp thụ dung dịch dựa vào khơng khí (A 1) sau Bắt đầu cho phản ứng enzym cách thêm 0,05 ml D-LDH (B.4.9) vào cuvet khoảng thời gian định (ví dụ 30 s) Trộn kỹ Khi kết thúc phản ứng (sau 30 min), đọc lại độ hấp thụ dung dịch (A2) Tính chênh lệch độ hấp thụ (A2-A1) mẫu trắng (∆Ab), với phép thử mẫu trắng ∆Asb) (B.6.2) mẫu thử (∆As) (B.6.1) Lấy chênh lệch độ hấp thụ phép thử mẫu trắng phép thử trắng trừ chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng sau: AL(-)=∆As - ∆Ab Asb = ∆Asb - ∆Ab B.8 Tính biểu thị kết B.8.1 Tính Tính nồng độ, C, axit L(+) D(-) lactic chủng cấy, theo cơng thức sau: C= xA Trong C hàm lượng axit L(+) D(-) lactic 100 g chủng cấy, tính gam (g); V1 thể tích cuối cùng, tính mililit (ml); V2 thể tích mẫu, tính mililit (ml); Mr khối lượng phân tử tương đối chất cần phân tích; A độ hấp thụ đọc dung dịch (B.7.4.2 B.7.4.3) dựa vào khơng khí; lp chiều dài đường quang, tính centimet (cm); hệ số hấp thụ phân tử NADH 340 nm, 6,3 [l.mol -1cm-1]; m khối lượng phần mẫu thử (B.7.1) mẫu trắng (B.7.2), tính gam (g); d hệ số pha loãng Đối với axit L(+) lactic mẫu: CL(+) = dx 2,24x 90,1x100 xA L ( mx x1x 0,1x10000 ) CL( ) dx 20,18 xA L ( mx ) Trong CL(+) hàm lượng axit L(+) lactic, tính gam 100 g dịch cấy mẫu (B.6.1) Đối với axit L(+) lactic mẫu trắng: C’sb = dx 20,18 xA'sb mx Trong C’sb hàm lượng axit L(+) lactic, tính gam 100 g mẫu trắng (B.6.2) Lấy nồng độ dịch cấy mẫu (C’s) trừ nồng độ mẫu trắng (C’sb) để điều chỉnh L-lactat có mặt chất: C’L(+) = C’s – C’sb Tương tự, axit D(-) lactic mẫu: CD( ) dx 2,27 x 90,1x100 xA D ( mx x1x 0,1x10000 CD( ) dx 20,45 xA D ( mx ) ) Trong CD(-) hàm lượng axit D(-) lactic, tính gam 100 g dịch cấy mẫu (B.6.1) Khi đó, axit D(-) lactic mẫu trắng: Csb dx 20,45 xA sb mx Trong Csb hàm lượng axit D(-) lactic, tính gam 100 g mẫu trắng (B.6.2) Lấy nồng độ dịch cấy mẫu (Cs) trừ nồng độ mẫu trắng (Csb) để điều chỉnh D-lactat có mặt chất: C’D(-) = Cs-Csb B.8.2 Biểu thị kết Biểu thị kết đến hai chữ số thập phân B.9 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; e) kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6836 : 2007 (ISO 8069 : 2005), Sữa bột – Xác định hàm lượng axit lactic lactat [2] TCVN 8128-1 : 2009 (ISO 11133-1 : 2009), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị sản xuất môi trường nuôi cấy – Phần 1: Hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng việc chuẩn bị mơi trường ni cấy phòng thử nghiệm ... + + + + Lactoza + + + + Maltoza - + + /- + Mannoza + /- + + /- + Sacaroza - + - + Trehaloza - + + /- + /- Gluconat - - - - Xellobioza - - - + Esculin - - - + D (-) D (-) DL DL Chất đồng phân đối ảnh... màu Phản ứng catalaza - - - - Sinh CO2 từ glucoza - - - - Phát triển 15oC ± 1o C - - - - Phát triển 45oC ± 1o C + + + + + + + /- + Các đường lên men Fructoza Galactoza - + /- + + Glucoza + + + +... khác Nước dùng để chuẩn bị dung dịch enzym phải nước cất hai lần dụng cụ thủy tinh Xem TCVN 6404 (ISO 7218) TCVN 6263 (ISO 8261) Đối với vật liệu khác, xem TCVN 8177 : 2009 (ISO 7889 : 2003) 5.1