Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn tại Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh nhằm tạo nguồn tế bào phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị.
Tạp chí y - dợc học quân số 6-2018 PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MƠ DÂY RỐN Lê Thị Bích Phượng*; Đỗ Minh Trung**; Lê Văn Đơng** Đỗ Quyết**; Đồng Khắc Hưng** TĨM TẮT Mục tiêu: phân lập nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn Đối tượng phương pháp: mẫu dây rốn (n = 5) thu nhận Khoa Sản, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh, xử lý cắt thành mảnh mơ nhỏ kích thước khoảng mm nuôi cấy môi trường chuyên biệt để phân lập tế bào Tế bào sau phân lập nuôi cấy tăng sinh kiểm tra tính gốc thơng qua tiêu khả bám dính bề mặt dụng cụ ni cấy, biểu dấu ấn bề mặt cho dòng tế bào gốc trung mô giai đoạn nuôi cấy Đánh giá tính an tồn q trình phân lập qua kết kiểm tra nhiễm sắc thể đồ, nội độc tố mycoplasma Kết quả: phân lập nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn, tế bào thu nhận có khả bám dính vào bề mặt bình ni cấy, tế bào có dạng thn dài, giống với nguyên bào sợi, biểu dương tính với dấu ấn CD44, CD73, CD90 (> 95%) âm tính với dấu ấn CD14, CD45, HLADR (< 5%) Kết đánh giá tính an tồn mẫu tế bào MSC phân lập được, kết âm tính với nội độc tố mycoplasma Kết luận: phân lập nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mơ dây rốn, tế bào đạt tiêu chí tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn đảm bảo tính an tồn để ứng dụng điều trị lâm sàng * Từ khóa: Tế bào gốc trung mô; Mô dây rốn; Phân lập tế bào gốc trung mô Isolation and Culture of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Tissues Summary Objectives: To isolate and culture umbilical cord tissue mesenchymal stem cells Subjects and method: Using human umbilical cords (n = 5) for isolated mesenchymal stem cells were collected from the Obstetrics Department, Vanhanh General Hospital After harvested, cords were segmented into small pieces about mm in size, cultured in a specialized medium for isolation of mesenchymal stem cells These stem cells were tested stemness based on criteria such as their ability to stick on the surface of culture flasks, expression of surface markers of mesenchymal stem cell lines during the culturing period Safety evaluation was investigated by examining karyotype, and the presence of endotoxin, mycoplasma Results: Umbilical cord mesenchymal stem cells samples were successfully solated and cultured The obtained cells have ability to attach to the surface of culture flasks and having fibroblast-like shape * Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/03/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 15/05/2018 Ngày báo đăng: 25/06/2018 22 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2018 These cells were positive with markers: CD44, CD73, CD90 (> 95%) and negative with marker CD14, CD45, HLADR and passed the safety test with endotoxicity and mycoplasma Conclusions: We were successful in isolation, expansion of umbilical cord - mesenchymal stem cells The cell population met the criteria of UC-MSC and ensure safety for use in treatment * Keywords: Mesenchymal stem cell; Umbilical cord tissue; Isolation of mesenchymal stem cells ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc trung mô (TBGTM) nguồn tế bào gốc sử dụng phổ biến liệu pháp tế bào liệu pháp gen [1] Tương tự kiểu tế bào gốc khác, TBGTM nhóm tế bào gốc đa tiềm năng, có khả tự làm cao TBGTM biệt hóa in vitro hay in vivo thành hai dòng tế bào thuộc không thuộc trung mô TBGTM ngày ứng dụng rộng rãi thử nghiệm lâm sàng điều trị bệnh miễn dịch thối hóa bệnh mơ ghép chống túc chủ (Graft versus host disease - GVHD), bệnh Crohn, bệnh tiểu đường, suy thận, bệnh lý thần kinh chấn thương tủy sống [5, 6] gần nghiên cứu liệu pháp gen đích điều trị ung thư [7] Kết thử nghiệm khả quan tính an tồn hiệu liệu pháp điều trị, đặc biệt không ghi nhận tác dụng phụ lâu dài hay hình thành khối u loại thải tế bào trình điều trị thử nghiệm [8] Nhiều nghiên cứu gần cho thấy, dây rốn người nguồn giàu TBGTM [2] So với nguồn khác, mẫu dây rốn có ưu điểm: thu nhận mẫu dây rốn tương đối dễ dàng, không gặp phải rào cản vấn đề đạo đức y khoa trường hợp thu nhận tế bào gốc phôi; không gây xâm lấn, không ảnh hưởng tới sản phụ trẻ sơ sinh; số lượng tế bào nhiều đặc điểm tự làm nhanh [2, 3] sử dụng nguồn dây rốn sẵn có từ việc lưu trữ ngân hàng tế bào gốc Với kết thử nghiệm với nhu cầu điều trị nay, TBGTM từ mô dây rốn thật giải pháp an toàn, tiện lợi, kịp thời cho bệnh nhân (BN) mắc bệnh hiểm nghèo không đủ điều kiện thu nhận tế bào tự thân cho lộ trình điều trị tế bào gốc Đảm bảo tiết kiệm thời gian giảm thiểu nguy gây xâm lấn tới sức khỏe, tinh thần BN thời gian điều trị Với đặc tính ưu việt trên, tính sinh miễn dịch thấp, biểu thấp HLA lớp I không biểu HLA lớp II nên TBGTM giải pháp hữu hiệu cho liệu pháp điều trị ghép tế bào gốc đồng loài [4] Xuất phát từ vấn đề trên, nghiên cứu đã: Tiến hành phân lập nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô dây rốn Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh nhằm tạo nguồn tế bào phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng điều trị 23 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2018 I TNG V PHNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu dây rốn (n = 5) sử dụng cho phân lập nuôi cấy TBGTM thu nhận điều kiện vô trùng Khoa Sản, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh, thỏa mãn điều kiện: sản phụ < 30 tuổi, sinh đủ tháng; kết xét nghiệm âm tính với HIV, HAV, HBV, HCV giang mai; dây rốn trơn, nhẵn, hồng Dây rốn sau thu nhận đặt dung dịch nước muối vô trùng (natri clorid 0,9%), bảo quản điều kiện nhiệt độ khoảng 40C chuyển mẫu phòng thí nghiệm, thời gian lưu mẫu tối đa không 72 Phương pháp nghiên cứu 5% C02 Theo dõi khả bám dính mẫu mô sau 24 72 trải mẫu Thay môi trường ngày/lần Đến tế bào xuất hiện, mọc dày bao quanh mảnh mô, tiến hành tách tế bào chuyển qua bình ni để ni tiếp tục ni cấy mẫu mơ bình nuôi chứa môi trường MSC Cult Clinic completed * Nuôi cấy TBGTM: Nuôi TBGTM môi trường MSC Cult, thay môi trường ngày/lần tiến hành cấy chuyền tế bào bám dính, tăng sinh mật độ đạt khoảng 70 - 80% diện tích bề mặt bình ni cấy Tách tế bào enzym Detachment (RegenmedLab, Việt Nam), ly tâm tốc độ 2.500 vòng/ phút Tiến hành cấy chuyển tế bào với tỷ lệ 1:2 1:3, cấy chuyển TBGTM tới lần cấy chuyển thứ * Nuôi cấy mô dây rốn phân lập tế bào gốc: * Đánh giá chất lượng quần thể tế bào phân lập: Mẫu mơ phân lập theo quy trình chuyển giao từ Viện Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên: tiến hành giải xoắn dây rốn, cắt chỗ xoắn thành đoạn ngắn, xẻ dọc đoạn ngắn, mở trải thành tấm, cạo lớp màng phía trên, loại bỏ mạch máu, cắt mẫu mơ thành mảnh nhỏ có kích thước nhỏ khoảng mm2 Rửa mẫu mô nước muối sinh lý vơ trùng từ - lần, trải vào bình ni (flasks 75 cm2) Bổ sung vào bình ni ml môi trường MSC Cult Clinic completed (RegenmedLab, Việt Nam), lắc nhẹ cho mẫu mô dàn mà không cụm lại với Nuôi cấy nhiệt độ 37ºC, Tế bào ni cấy phân lập theo quy trình Phòng Thí nghiệm Tế bào gốc, Đơn vị Tế bào gốc Vạn Hạnh Chuyển mẫu kiểm tra, đánh giá chất lượng độc lập Viện Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh 24 * Xác định dấu ấn TBGTM: Xác định dấu ấn tế bào gốc thông qua kháng nguyên bề mặt tế bào, lần cấy chuyển thứ (P4), tế bào tách nhuộm với panel kháng thể đơn clon kháng CD44, CD73, CD90, CD14, CD45, HLADR Kết phân tích kỹ thuật flowcytometry hệ thống FACS Calibur (Becton Dickinson) T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2018 v tri t bào lame kính Quan sát enzym, chuyển ADP thành ATP Dựa vào đo ATP thông qua kết đo mật độ quang với máy Luminometter xác định diện hay vắng mặt mycoplasma chụp hình nhiễm sắc thể (NST), xếp Sau đặt vật liệu thí nghiệm NST sử dụng phần mềm metasystem nhiệt độ phòng, ly tâm ml dịch nuôi tế NST đồ thực lần cấy chuyển bào 1.500 vòng/5 phút Chuyển 100 µl thứ 5, mật độ tế bào đạt gần 80%, dịch huyền phù vào cuvetter máy tiến hành thay mơi trường bắt đầu Luminometter, thêm 100 µl dung dịch kiểm tra NST MycoAlert reagent vào ống, đợi phút, * Kiểm tra nhiễm sắc thể đồ: Tế bào nuôi cấy làm ngừng phân bào pha metaphase colcicin Sau đó, nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa Nhuộm G-banding Nhúng mẫu đọc kết Reading A máy lame trypsin 37ºC, PBS lạnh Luminometter Thêm 100 µl MycoAlert 10 giây, thuốc nhuộm Giemsa phút substrate vào mẫu, đợi 10 phút, Để mẫu lame phút nhiệt độ phòng đọc kết Reading B Xác định tồn dùng bình tia rửa phần thuốc nhuộm thừa mycoplasma qua tỷ số Reading Xử lý tiêu hệ thống IKAROS B/Reading A sau: * Kiểm tra nội độc tố chế phẩm LAL: Nội độc tố (endotoxin) kiểm tra kỹ thuật tạo gel với Limulus Amebocyte Lysate - LAL (Lonza) theo quy trình FDA (Mỹ) Trộn chế phẩm LAL với mẫu tế bào cần kiểm tra Sau thời gian ủ 60 phút, + Nếu B/A < 0,9: kết âm tính cho mycoplasma + Nếu B/A từ 0,9 - 1,2: lặp lại thí nghiệm sau 24 + Nếu B/A > 1,2: kết nhiễm mycoplasma (dương tính) cẩn thận lấy ống mẫu thử, ghi lại phản ứng ống Mẫu dương tính với nội độc tố tạo gel, mẫu âm tính khơng * Kiểm tra mycoplasma: Kiểm tra mycoplasma phương pháp đánh giá hoạt tính enzym đặc hiệu mycoplasma sử dụng kít MycoAlert mycoplasma detection, kít chứa chất chất giải phóng enzym khỏi mycoplasma Những chất tác động KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết nuôi cấy mô dây rốn phân lập tế bào gốc: sau 24 mảnh mẫu mô nuôi cấy bắt đầu bám dính vào bề mặt bình ni cấy, số lượng đạt khoảng 30 - 50%, sau 72 mẫu mơ bám dính hồn tồn vào bề mặt bình ni cấy sau - ngày, tế bào di cư xuất rìa mnh mụ (hỡnh 1A) 25 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 6-2018 A B C D Hình 1: Sự di cư TBGTM từ mẫu mô dây rốn thời gian nuôi cấy - 21 ngày (Hình 1A: Sau ngày ni; hình 1B: Sau 10 ngày ni; hình 1C: Sau 14 ngày ni; hình 1D: Tế bào P1 sau ngày cấy chuyển) TBGTM thu từ mẫu mơ dây rốn có khả bám dính bề mặt dụng cụ ni cấy, dạng thn dài gần giống với hình dạng nguyên bào sợi (hình 1D) Sau 14 - 21 ngày, tế bào bình mơ ni cấy trải đều, mật độ đạt khoảng 70%, thời điểm tiến hành đợt cấy chuyền (P0 cấy P1) (hình 1B-C) Bảng 1: Kết kiểm tra marker TBGTM từ mơ dây rốn flowcytometry Marker dương tính (%) Mẫu TBGTM từ mơ dây rốn 26 Marker âm tính (%) CD44 CD73 CD90 CD14 CD45 HLADR Mẫu 95,64 97,50 98,57 5,98 3,80 0,24 Mẫu 99,94 99,74 99,86 0,73 0,06 0,01 Mẫu 99,94 98,21 99,77 0,72 0,26 Mẫu 99,64 96,65 98,02 4,81 0,38 0,51 Mẫu 99,7 99,37 99,63 3,04 4,33 0,64 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2018 0.73 % 0.06 % 99.94 0.01 % 99.74 99.86 Hình 2: Khảo sát dấu ấn TBGTM từ mô dây rốn flowcytometry (mẫu 2) Về biểu dấu ấn TBGTM, kết dương tính cao (> 95%) với marker CD44, CD73, CD90 âm tính với marker CD14, CD45, HLADR (< 5%) mẫu dây rốn khảo sát (bảng 1, hình 2) Đây kết khả quan hiệu phân lập TBGTM từ mô dây rốn theo tiêu chuẩn định danh TBGTM theo kiểu hình miễn dịch tế bào Theo kết cơng bố Hội Liệu pháp tế bào quốc tế, TBGTM từ mơ dây rốn giữ tính gốc tính tới lần cấy chuyển thứ 15 Tuy nhiên, nghiên cứu gần De Witte S.F CS (2017) khảo sát tính ổn định kiểu hình chức TBGTM qua giai đoạn cấy chuyền lần thứ 4, lần thứ lần thứ 12 cho thấy, khơng có thay đổi đáng kể kiểu hình miễn dịch TBGTM khả điều biến miễn dịch, định hướng tế bào T cảm ứng biệt hóa thành tế bào TCD4+ TCD8+ suy giảm [5] Vì vậy, để đảm bảo chất lượng TBGTM ổn định hình thái, chức cảm ứng điều biến miễn dịch, tế bào sử dụng cho ứng dụng thử nghiệm lâm sàng, nghiên cứu dự kiến giới hạn sử dụng tế bào lần cấy chuyển thứ Từ mẫu TBGTM kiểm tra tính ổn định lần cấy chuyển thứ tiếp Kết cho thấy, khơng có biến động số lượng NST tế bào (2n = 46) sau lần cấy chuyển liên tiếp tất mẫu tế bào phân lập nuôi cấy Bên cạnh đánh giá tính an tồn việc nuôi cấy TBGTM mô dây rốn qua kết kiểm tra nội độc tố mycoplasma Vì tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng điều trị có khả biến động trình ni cấy Kết mẫu TBGTM từ mơ dây rốn (n = 5) phân lập trình ni cấy: khơng có mẫu nhiễm nội độc t v mycoplasma 27 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 6-2018 Bảng 2: Kết kiểm tra nội độc tố chế phẩm LAL Mẫu TBGTM Kết Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Bảng 3: Kết kiểm tra mycoplasma Mẫu TBGTM Tỷ số B/A Kết Mẫu 0,75692 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 0,2 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 0.77747 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 0.15242 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 0.15929 Không nhiễm mycoplasma Kiểm tra nội độc tố chế phẩm LAL từ mẫu TBGTM dây rốn cho kết âm tính, khơng có tạo gel từ mẫu kiểm (bảng 2) Kiểm tra mycoplasma cho kết tất mẫu âm tính (bảng 3) Đây hai thơng số quan trọng xác định tính an tồn sản phẩm tế bào sử dụng cho BN điều trị lâm sàng theo tiêu chuẩn FDA (Mỹ) Kết cho thấy quy trình phân lập ni cấy TBGTM từ mơ dây rốn chúng tơi hồn tồn phù hợp Tế bào gốc phân lập nuôi cấy đạt tiêu chuẩn để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng liệu pháp tế bào thử nghiệm điều trị lâm sàng Kết mở hướng tiềm ứng dụng TBGTM từ mô dây rốn điều trị lâm sàng KẾT LUẬN Đã phân lập nuôi cấy TBGTM từ mơ dây rốn, tế bào có khả bám dính, có hình dạng giống ngun bào sợi, biểu dương tính (> 95%) với dấu ấn TBGTM CD44, CD73, CD90, ổn định NST, tế bào đảm bảo tính an tồn khơng nhiễm nội độc tố, mycoplasma, đạt yêu cầu để sử dụng cho nghiên cứu ứng dụng điều trị lâm sàng Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ đề tài mã số KC.10.15/16-20 Nhóm tác giả trân trọng cảm ơn người tình nguyện 28 tham gia nghiên cứu, Học viện Quân y, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh Viện Tế bào gốc ủng hộ, tạo điều kiện tích cực hợp tác q trình nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Caplan A.I, S.P Bruder Mesenchymal stem cells: Building blocks for molecular medicine in the 21st century Trends in Molecular Medicine 2001, (6), pp.259-264 Romanov Y.A, V.A Svintsitskaya, V.N Smirnov Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: Candidate MSC-like cells from umbilical cord Stem Cells 2003, 21 (1), pp.105-110 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2018 Dalous J, J Larghero, O Baud Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: Technical aspects, preclinical studies and clinical perspectives Pediatric Research 2012, 71 (4-2), p.482 Gnecchi M, L.G Melo Bone marrowderived mesenchymal stem cells: Isolation, expansion, characterization, viral transduction and production of conditioned medium, in Stem Cells in Regenerative Medicine Springer 2009, pp.281-294 De Witte S.F et al Aging of bone marrow-and umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells during expansion Cytotherapy 2017, 19 (7), pp.798-807 Squillaro T, G Peluso, U Galderisi Clinical trials with mesenchymal stem cells: An update Cell Transplantation 2016, 25 (5), pp.829-848 Marofi F et al Mesenchymal stromal/stem cells: A new era in the cell-based targeted gene therapy of cancer Frontiers in Immunology 2017, p.8 Can A, F.T Celikkan, O Cinar Umbilical cord mesenchymal stromal cell transplantations: A systemic analysis of clinical trials Cytotherapy 2017, 19 (12), pp.1351-1382 29 ... Tiến hành cấy chuyển tế bào với tỷ lệ 1:2 1:3, cấy chuyển TBGTM tới lần cấy chuyển thứ * Nuôi cấy mô dây rốn phân lập tế bào gốc: * Đánh giá chất lượng quần thể tế bào phân lập: Mẫu mô phân lập... stem cells ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc trung mô (TBGTM) nguồn tế bào gốc sử dụng phổ biến liệu pháp tế bào liệu pháp gen [1] Tương tự kiểu tế bào gốc khác, TBGTM nhóm tế bào gốc đa tiềm năng, có khả... lại với Nuôi cấy nhiệt độ 37ºC, Tế bào nuôi cấy phân lập theo quy trình Phòng Thí nghiệm Tế bào gốc, Đơn vị Tế bào gốc Vạn Hạnh Chuyển mẫu kiểm tra, đánh giá chất lượng độc lập Viện Tế bào gốc,