Khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu

6 70 2
Khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu

Đang tải... (xem toàn văn)

Thông tin tài liệu

Nghiên cứu Khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt trên mô hình chuột nhắt trắng mô phỏng bệnh gan ở người nghiện rượu với mục tiêu nhằm xây dựng mô hình mô phỏng bệnh gan và tình trạng sắt thừa ở người nghiện rượu trên chuột nhắt trắng.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG CHUYỂN HĨA SẮT TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT NHẮT TRẮNG MƠ PHỎNG BỆNH GAN Ở NGƯỜI NGHIỆN RƯỢU Tất Chí Hùng*, Đỗ Thị Hồng Tươi* TĨM TẮT Mục tiêu: Xây dựng mơ hình mơ bệnh gan tình trạng sắt thừa người nghiện rượu chuột nhắt trắng Phương pháp: Chuột cho uống dung dịch ethanol 20% (g/ml), sau theo dõi lượng rượu tiêu thụ, trọng lượng thể tình trạng dinh dưỡng ngày Sau tuần, thu nhận mẫu máu xác định hoạt tính men gan, số sắt huyết thanh, tách lấy gan xác định nồng độ protein, sắt phân tích mơ học Kết quả: chuột cho uống dung dịch ethanol 20% biểu tình trạng viêm gan chưa có xơ hóa thể qua số AST, ALT tăng hình ảnh vi thể Ngồi ra, chuột gây bệnh có tượng thừa sắt gan thể qua nồng độ sắt gan tăng sắt tích tụ tế bào phân tích vi thể phương pháp nhuộm Perls Kết luận: mơ hình gây tình trạng viêm gan rượu sắt thừa tích tụ gan Từ sử dụng mơ hình để nghiên cứu tác dụng phòng điều trị bệnh gan rượu chất dược liệu theo chế loại bỏ sắt thừa gan Từ khóa: bệnh gan rượu, chuyển hóa sắt, rượu ABSTRACT INVESTIGATION ON IRON METABOLISM IN MICE MODEL MIMICKING ALCOHOLIC LIVER DISEASE Tat Chi Hung, Đo Thi Hong Tuoi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 418 - 423 Objectives: The aim of this work is to establish a mice model mimicking alcoholic liver disease (ALD) and to study iron homeostasis Methods: Mice were used to induce liver injury by feeding ethanol in water at a final concentration of 20% (g/ml) Alcohol consumption, body weight and diet were daily determined After 8-week treatment, blood samples were used for biochemical assays, liver tissues were excised for total protein and iron assays as well as histological analysis Results: Mice fed ethanol in water at 20% (g/ml) exhibited hepatitis without fibrosis, as measured by rise in AST, ALT activity and histological photomicrographs Moreover, a hepatic iron overload was observed in ethanolfed mice by increase in liver iron concentration and iron-laden hepatocytes at histological examination using Perls staining Conclusions: Results showed that in mice, ethanol induced hepatitis and hepatic iron overload paralleling alcohol-induced liver injury in human ALD Thus, ethanol-fed mice model could be applied to study prevention and treatment effect of novel molecules or plants extracts on alcoholic liver disease by removing excessive iron Key words: alcoholic liver disease, iron metabolism, alcohol * Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp.HCM Tác giả liên lạc: TS Đỗ Thị Hồng Tươi 418 ĐT: 0908683080 Email: hongtuoid99@gmail.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Một số nghiên cứu báo cáo tình trạng thừa sắt gan bệnh nhân bệnh gan rượu sắt thừa làm tăng độc tính rượu gan(6,7) Những nghiên cứu in vitro cho thấy số chất dược liệu chứa polyphenol có tác dụng bảo vệ gan nhờ chế loại bỏ sắt thừa gan(1,2,4) Những kết cần khẳng định cấp độ in vivo động vật mơ hình chuột nhắt mơ bệnh gan rượu Việt Nam hạn chế Vì vậy, chúng tơi thực xây dựng mơ hình chuột nhắt trắng mô bệnh gan người nghiện rượu khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt mơ hình với hy vọng tìm mơ hình thích hợp để nghiên cứu tác dụng phòng điều trị bệnh gan rượu chất dược liệu theo chế loại bỏ sắt thừa gan ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Chuột nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 68 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22 ± g, cung cấp Viện Vaccin Sinh phẩm Nha Trang Chuột nuôi riêng lẻ ô ngăn cách khung lưới lồng có kích thước 35 x 25 x 15 cm (6 ô/lồng) Chuột cung cấp thức ăn nước uống theo điều kiện mơ hình thí nghiệm Hóa chất trang thiết bị Ethanol (Guangdong), dung dịch đỏ trung tính (neutral red) 0,1%, ferrocyanid 20%, HCl 20%, đệm PBS 1X, NaCl 0,9%, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích Nghiên cứu Y học Cung cấp cám viên khơng giới hạn Mơ hình áp dụng nhiều nghiên cứu để mô tình trạng nghiện rượu người (3) Xác định lượng ethanol tiêu thụ ngày methanol (g) = [Vdung dịch ban đầu (ml) – Vdung dịch sau 24 (ml)] × 0,2 Khảo sát tình trạng dinh dưỡng chuột thử nghiệm ngày mthức ăn (g) = mthức ăn ban đầu (g) – mthức ăn sau 24 (g) Theo dõi trọng lượng thể chuột Sự thay đổi trọng lượng thể chuột ghi nhận cách cân chuột lần/tuần Xác định hoạt tính men gan (AST, ALT) Sau tuần, chuột giết, lấy máu tim xét nghiệm hoạt tính ALT, AST Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Chợ Rẫy, TP.HCM máy Hitachi 917 với kit 80327 80325 (Biolabo) phương pháp đo động học enzym Phân tích mô học xác định mức độ tổn thương gan Sau tuần, chuột giết, tách lấy gan, rửa NaCl 0,9% lạnh Thấm khô, cân ghi nhận trọng lượng Quan sát đại thể màu sắc, tình trạng bề mặt, tổn thương Một phần gan cố định formol 10% để làm xét nghiệm vi thể phương pháp nhuộm HE (hematoxylin eosin), trichrom khoa Sinh hóa – Bệnh viện Nhi Đồng 1, TP.HCM Quan sát cấu trúc, hình thái tế bào gan kính hiển vi, đánh giá mức độ tổn thương gan Mơ hình cho chuột uống dung dịch ethanol 20% (g/ml) Xác định protein toàn phần gan Chuột chia thành lô, lô con: lô chứng cho uống nước cất lô thử cho uống dung dịch ethanol nồng độ tăng dần: 10% (g/ml) cho ngày đầu, 15% cho ngày tiếp theo, 20% từ tuần thứ Dung dịch ethanol nước cất nguồn cung cấp nước đựng xilanh thiết kế đặc biệt cho chuột uống tự nhiên (pH 7,4) theo tỉ lệ 1g/1ml Ly tâm (12000g) Chuyên Đề Dược Học Gan nghiền đệm PBS 1X lạnh 15 phút 4°C, lấy dịch cho vào eppendorf để định lượng protein toàn phần phương pháp Biuret máy Hitachi 917, kit A42.600.16 (BioLabo) Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Chợ Rẫy 419 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Định lượng sắt huyết sắt toàn phần gan Huyết dịch gan sau ly tâm Lượng thức ăn tiêu thụ Chuột uống dung dịch ethanol 20% tiêu thụ cám viên tăng dần khoảng g so dùng định lượng sắt máy Hitachi 917 với với chuột chứng (4 g/ngày so với g/ngày) kit 92108 (Biolabo) phương pháp Sự thay đổi trọng lượng thể Feren S Định lượng transferrin huyết Trọng lượng chuột lơ chứng tăng nhanh liên tục (Hình 1) Sự tăng trọng lượng chuột Định lượng transferrin huyết thực lơ thử chia theo giai đoạn: Giai đoạn 1: máy BS 300 (Mindray) với kit trọng lượng giảm tuần Giai đoạn 2: 1102134 (Spinreact) phương pháp đo độ trọng lượng trì ổn định khoảng tuần đục miễn dịch Giai đoạn 3: từ tuần 4-8 trọng lượng tăng với tỷ Xác định độ bão hòa transferrin lệ thấp so với lô chứng Giá trị sắt transferrin huyết dùng để tính độ bão hòa transferrin (TS) theo cơng thức TS = (Sắthuyết thanh/Transferrinhuyết thanh) x Phương pháp nhuộm Perls Cố định gan formol 10%, xử lý máy tự động khoa Sinh hóa – bệnh viện Nhi Đồng Ngâm lam mẫu nước cất 10 phút, ủ 20 phút với kali ferrocyanid 20% HCl 20% Rửa lam mẫu lần với nước cất (5 phút/lần), nhuộm 15 phút với dung dịch đỏ trung tính 0,1% Rửa nước, loại nước cồn tuyệt đối, để khơ Phân tích kết quả-xử lý số liệu thống kê Kết trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình đánh giá ý nghĩa thống kê test MannWhitney (phần mềm Minitab 14.0) Sự khác biệt có ý nghĩa p < 0,05 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Lượng rượu tiêu thụ Trong 2-3 tuần đầu lượng rượu tiêu thụ tăng dần đến mức tối đa, sau ổn định suốt thời gian thử nghiệm 420 Mức độ tổn thương gan Tỉ lệ trọng lượng gan trọng lượng thể Tỉ lệ trọng lượng gan trọng lượng thể chuột lô thử lô chứng khác biệt không đáng kể (Bảng 1: p = 0,200) Lượng protein toàn phần gan So với chuột chứng, lượng protein toàn phần gan chuột thử giảm 60% (Bảng 1, p = 0,005) Bảng Tỉ lệ trọng lượng gan/trọng lượng thể lượng protein toàn phần gan Kí hiệu ** biểu cho p < 0,01 so sánh lô thử với lô chứng Tỉ lệ TL gan/TL Protein toàn phần thể gan Lô chứng Lô thử Lô chứng Lô thử Chuột uống dung 100,0 ± 91,0 ± 100,0 ± 37,4 ± dịch ethanol 20% 7,5 13,9 13,2 8,5** Thay đổi hoạt tính men gan ALT, AST Hoạt tính ALT, AST chuột thử tăng so với chuột chứng (Hình 2, ALT: +78,8%, p = 0,0131; AST: +74,3%, p = 0,036) Thay đổi mặt mơ học Chuột thử chứng có gan màu đỏ tươi, bề mặt nhẵn, không phù nề, khơng sung huyết quan sát đại thể Mơ hình gây tình trạng viêm gan 100% chuột lô thử tương tự viêm gan rượu người thể qua kết phân tích vi thể (Hình 3) Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học Hình Trọng lượng thể chuột Hình Hoạt tính men gan ALT, AST.* ** biểu cho p < 0,05 p < 0,01 so sánh lô thử với lơ chứng A B C D E F Hình Hình ảnh vi thể gan chuột (X400) Lơ chứng: nhuộm HE (A, B); nhuộm trichrom (C); lô thử: tế bào viêm xâm nhập khoảng cửa (E), tế bào kupffer phình to (D), khơng xơ hóa (F) Tình trạng chuyển hóa sắt Chuyên Đề Dược Học Chuột gây bệnh có sắt toàn phần gan 421 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 tăng đáng kể so với chuột chứng (Hình 4A) Kết củng cố thêm hình ảnh vi phẫu nhuộm Perl tế bào gan (Hình 4B,C): 70% chuột lơ thử có tế bào gan nhuộm màu xanh thể tình trạng tích lũy sắt thừa A B C \ Hình Nồng độ sắt toàn phần gan chuột (A) hình ảnh vi thể (X1000) tế bào gan sau nhuộm Perls: lô chứng (B); lô thử (C) Màu xanh dương đậm, dạng hạt hemosiderin nguyên nhân làm tình trạng viêm Các số sắt huyết gồm sắt, gan Thật vậy, sắt làm tăng sinh gốc tự transferrin huyết thanh; độ bão hòa transferrin gây ethanol làm tăng độc tính ethanol, chuột gây bệnh gan rượu khác biệt gây peroxyd hóa lipid màng tế bào dẫn đến phá không đáng kể so với chuột chứng (dữ liệu hủy tế bào gan(4) khơng trình bày) BÀN LUẬN Từ thực nghiệm cho thấy, chuột lơ thử mơ hình có tình trạng tiêu thụ ethanol tăng dần, trọng lượng thể tăng nhẹ so với lô chứng Mơ hình gây tình trạng viêm gan rượu, chưa thấy xuất xơ hóa, thể qua hình ảnh đặc trưng so sánh lâm sàng người bệnh gan rượu(5) Kết củng cố tăng AST, ALT xét nghiệm hoạt tính men gan Về tình trạng chuyển hóa sắt, chuột gây bệnh gan rượu có lượng sắt toàn phần gan tăng đáng kể so với lô chứng Kết củng cố cho thực tế lâm sàng người nghiện rượu có 50-60% trường hợp thừa sắt gan hoàn toàn phù hợp nghiên cứu in vitro cho thấy ethanol làm tăng sắt nội bào làm tăng biểu gen mã hóa cho protein dự trữ sắt L-ferritin, vận chuyển sắt transferrin…(4) Thừa sắt tích tụ gan 422 Các số sắt huyết gồm sắt, transferrin huyết thanh; độ bão hòa transferrin chuột gây bệnh gan rượu mơ hình khơng có khác biệt có ý nghĩa so với lơ chứng Điều cho thấy tình trạng thừa sắt giai đoạn đầu, sắt tăng gan, chưa ảnh hưởng đến sắt hệ thống KẾT LUẬN Mơ hình cho chuột uống dung dịch ethanol 20% (g/ml) gây tình trạng viêm gan thừa sắt tích tụ gan bệnh gan người nghiện rượu Có thể sử dụng mơ hình để nghiên cứu tác dụng loại bỏ sắt thừa gan chất/dược liệu theo hướng phòng điều trị bệnh gan TÀI LIỆU THAM KHẢO Acker Saskia ABE van (1998) Influence of Iron Chelation on the Antioxidant Activity of Flavonoids Biochemical Pharmacology 56:935-943 Brittenham GM (2003) Iron chelators and iron toxicity Alcohol 30:151-158 Coleman Ruth A et al (2008) A Pratical Method of Chronic Ethanol Administration in Mice, in Alcohol: Methods and Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Protocols, Laura E Nagy, Human press, 11-60 Đỗ Thị Hồng Tươi cộng (2010) Mối quan hệ hoạt tính ức chế tăng trưởng rượu q trình chuyển hóa sắt dòng tế bào ung thư gan HepaRG Hội nghị khoa học công nghệ toàn quốc trường ĐHYD Cần thơ, 705-708 Kanel Gary C et al (2005) Atlas of Liver Pathology, Elsevier Saunders, 63-76 Moirand R et al (1991) Increase in glycosylated and nonglycosylated serum ferritin in chronic alcoholism and their volution during alcohol withdrawal Alcohol Clin Exp Res 15:963-972 Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học Suzuki Y (2002) Up-regulation of transferrin receptor expression in hepatocytes by habitual alcohol drinking is implicated in hepatic iron overload in alcoholic liver disease Alcohol Clin Exp Res 26:26S-31S Ngày nhận báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 21.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 423 ... gan người nghiện rượu khảo sát tình trạng chuyển hóa sắt mơ hình với hy vọng tìm mơ hình thích hợp để nghiên cứu tác dụng phòng điều trị bệnh gan rượu chất dược liệu theo chế loại bỏ sắt thừa gan. .. bỏ sắt thừa gan( 1,2,4) Những kết cần khẳng định cấp độ in vivo động vật mơ hình chuột nhắt mô bệnh gan rượu Việt Nam hạn chế Vì vậy, chúng tơi thực xây dựng mơ hình chuột nhắt trắng mơ bệnh gan. .. Mơ hình gây tình trạng viêm gan rượu, chưa thấy xuất xơ hóa, thể qua hình ảnh đặc trưng so sánh lâm sàng người bệnh gan rượu( 5) Kết củng cố tăng AST, ALT xét nghiệm hoạt tính men gan Về tình trạng

Ngày đăng: 23/01/2020, 16:55

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan