Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 NGHIÊN CỨU PHÂN LÂP VI KHUẨN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYM UREASE TỪ MƠI TRƢỜNG NI CẤY HELICOBACTER PYLORI Đỗ Hồng Long*; Đỗ Minh Trung* Lê Thu Hồng**; Lê Văn Đông* TÓM TẮT Ức chế enzym urease kháng thể đặc hiệu theo đường uống hướng nghiên cứu điều trị nhiễm Helicobacter pylori, nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh Nghiên cứu tiến hành nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease Kết quả: phân lập 17 chủng H pylori từ 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết, đạt tỷ lệ thành cơng 94,5% Ba chủng H pylori có hoạt độ urease cao chọn tăng sinh môi trường Brucella broth Tách chiết urease từ dịch nuôi cấy kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% bão hòa Sản phẩm thu có hoạt tính urease tương đối tinh khiết Kết điện di SDS-PAGE điều kiện biến tính cho băng đậm, tương ứng với tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử khoảng 60,3 kDa urease * Từ khóa: Urease; Helicobacter pylori; Tách chiết enzym HELICOBACTER PYLORI ISOLATION AND UREASE EXTRACTION FROM CULTURE BROTH SUPERNATANT SUMMARY Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in treatment of Helicobacter pylori infection, coping with antibiotic resistance of this bacterium This research aims to isolate H pylori from gastric-peptic ulcer biopsies and extract urease from bacterial culture broth to be used as material for the development of antibody to urease 17 H pylori strains were obtained from 18 biopsy samples (94.5%) Among them, three strains which showed highest urease activity were then sub-cultured in Brucella broth Urease was extracted from culture supernatant by precipitation with ammonium sulfate 50% saturation The obtained product maintained urease activity and relatively pure SDS-PAGE analysis in denature condition showed that, the urease contained product express as a single band, corresponding with subunit B of urease with molecular masses of approximately 60.3 kDa * Key words: Urease; Helicobacter pylori; Enzyme extraction * Học viện Quân y ** Bệnh viện 103 Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 28/11/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 8/12/2013 Ngày báo đăng: 18/12/2013 11 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm loét DD-TT bệnh lý thường gặp Việt Nam giới Tỷ lệ mắc bệnh cao, 60 - 70% Việt Nam, nước khác dao động từ 50 - 90% Có nhiều nguyên nhân gây viêm loét DDTT, đó, nguyên nhân thường nhắc đến nhiễm VK Helicobacter pylori, chiếm 75 - 95% [3, 5, 10] Việc điều trị viêm loét DD-TT nhiễm H pylori phức tạp, phải sử dụng phác đồ phối hợp thuốc kháng sinh với thuốc giảm toan, giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian quy cách Tuy nhiên, khả thất bại điều trị lớn, tình trạng VK kháng kháng sinh [1, 6] Xuất phát từ thực tế lâm sàng, nhu cầu tìm thuốc có tác dụng ức chế ngăn ngừa nhiễm H pylori mà khơng lo ngại tình trạng kháng thuốc, có phương pháp miễn dịch trị liệu thụ động sử dụng kháng thể kháng trực tiếp H pylori kháng enzym urease H pylori, thành phần quan trọng trình sinh bệnh H pylori, giúp chúng né tránh, tồn phát triển môi trường axít dịch dày, việc làm triển vọng [8] Từ đó, nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK tách chiết urease từ H pylori làm nguyên liệu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết ổ loét DDTT qua nội soi 18 bệnh nhân bị loét DD-TT đến khám phòng khám nội soi tiêu hóa, Bệnh viện 103 từ tháng 12 - 2011 tháng - 2012 Các hóa chất sinh phẩm: BHI (Brainheart infusion broth) (BioRad, Mỹ), Brucella broth (Neogen Corporation, Mỹ), huyết bào thai bê (FBS - Fetal bovine serum) (Gibco, Mỹ), Pylori agar (BioMérieux, Pháp) túi ủ GENbag microear (BioMérieux, Pháp) Phƣơng pháp nghiên cứu * Phân lập định danh H pylori từ bệnh phẩm: Bệnh phẩm sinh thiết qua nội soi bảo quản ống nghiệm chứa BHI broth vô trùng vận chuyển phòng thí nghiệm Bộ mơn Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103 Tại đây, nghiền nát bệnh phẩm dụng cụ vô trùng nuôi cấy phân lập chọn lọc đĩa petri chứa môi trường Pylori agar đặt túi vi hiếu khí GENbag microear (5% O2, 10% CO2, 85% N2 độ ẩm cao) 37oC VK phân lập sau ngày nuôi cấy định danh nhuộm Gram, phản ứng sinh hóa oxidase, catalase urease [3, 5] * Nuôi cấy tăng sinh H pylori tách chiết urease từ dịch nuôi cấy: Nuôi cấy chủng H pylori có hoạt tính urease mạnh tăng sinh mơi trường Brucella broth tủ ấm 37oC có lắc liên tục 72 Urease tách chiết từ dịch nuôi cấy kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% độ bão hòa Sản phẩm kết tủa thẩm tích loại muối, xác định hoạt tính urease, xác định độ tinh kích thước Xác định hoạt tính urease dịch ni cấy sản phẩm sau bước tách chiết nhờ test urease theo nguyên lý urease thủy phân ure thành ammonia, tạo môi trường kiềm chuyển thị màu đỏ phenol môi trường phản ứng thành màu hồng cánh sen có độ hấp phụ quang mạnh bước sóng 340 nm Xác định nồng độ protein enzym thu kỹ thuật Bradford Xác định độ tinh kích thước 13 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 sản phẩm phương pháp điện di SDSPAGE 10% điều kiện biến tính KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Phân lập VK Sau ngày nuôi cấy, 17/18 mẫu phân lập (94,5%) (trừ mẫu số 10) có VK mọc với hình ảnh khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám trong, đường kính 0,5 - mm Kết nhuộm Gram phản ứng sinh hóa cho thấy 17 chủng phân lập cho kết nhuộm Gram (-) hình thể đa số hình cong, mức độ xoắn nhẹ, khơng điển hình Kết phản ứng sinh hóa để định danh H pylori gồm urease, oxydase catalase cho kết dương tính Bảng 1: Kết ni cấy phân lập định danh VK PHẢN ỨNG SINH HÓA MÃ SỐ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 01 02 03 + + + NHUỘM GRAM Urease Oxydase Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 08 + + + + + 09 + + + + + 10 - 11 + + + + + 12 + + + + + 13 + + + + + 14 + + + + + 15 + + + + + 16 + + + + + 17 + + + + + 18 + + + + + H pylori VK khó phân lập mọc môi trường chuyên biệt với điều kiện thích hợp Pylori agar túi ủ GENbag microear (5% O2, 10% CO2, 85% N2 độ ẩm cao) 37oC xác định thích hợp cho chúng tăng sinh theo khuyến cáo nhiều tác giả [5] Đó lý giải thích tỷ lệ phân lập H pylori đạt 94,5%, cao tác giả khác nước (47 - 56,4%) [1] Tách chiết urease 0.7 OD (340 nm) Hình 1: Khuẩn lạc thu ni cấy mơi trường vi hiếu khí 04 05 06 07 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 11 12 13 14 15 16 17 18 Chñng vi khuÈn Helicobacter pylori Hình 2: Kết phản ứng urease chủng H.pylori thu 14 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Kết phân tích hoạt tính urease dịch 17 chủng VK nghiên cứu nhận thấy chủng H pylori (HP13, HP16 HP18) có hoạt tính cao hoạt tính cao sau cho tăng sinh lần (sau 24 giờ), lần (qua đêm) lần (sau 48 giờ) chủng H pylori [4, 8] Ba chủng HP13, HP16 HP18 lựa chọn để nuôi cấy tăng sinh phân lập urease tiểu đơn vị Tuy nhiên, kết thu gần giống không trùng khớp với hoàn toàn, chung phương pháp xác định Điều chứng tỏ urease từ chủng khác H pylori có số khác biệt phân tử lượng chuỗi tiểu đơn vị Trong nghiên cứu này, băng điện di ba chủng VK H pylori có vạch sáng nhất, tương đương tương ứng lý thuyết với kích thước tiểu đơn vị B phân tử urease Tại Việt Nam, có nghiên cứu tách chiết, tinh urease từ thực vật hoàn toàn chưa có tác giả nghiên cứu urease VK H pylori [2] KẾT LUẬN Hình 3: Điện di SDS-PAGE 10% M: protein chuẩn; HP13, PH16, HP18 sản phẩm kết tủa chủng tương ứng Bằng phương pháp kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy chủng HP13, HP16 HP18 với ammonium sulfate 50% thu lượng protein có hoạt tính urease 1,78 mg/ml, 1,95 mg/ml 1,71 mg/ml Kết điện di cho thấy sản phẩm thu sau kết tủa thẩm tích tương đối nhất, đó, băng đậm có kích thước khoảng 60,3 kDa Trên giới, có số nghiên cứu enzym urease H pylori đặc tính chúng phân tử lượng chuỗi Đã phân lập 17 chủng H pylori từ 18 mẫu sinh thiết ổ loét DD-TT Đã tách chiết enzym urease từ dịch nuôi cấy chủng sinh urease với hoạt tính cao nhất; sản phẩm thu giữ hoạt tính urease đặc trưng, tương đối tinh khiết, sử dụng làm nguyên liệu gây miễn dịch tạo kháng thể kháng urease TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai Tính đề kháng kháng sinh Helicobacter pylori bệnh viêm loét DD-TT Y học Thành phố Hồ Chí Minh 2006, 10 (1), tr.73-75 Lê Thị Phú & Nguyễn Thị Cẩm Vi Xác định phân tử lượng thông số động học urease từ đậu nành hạt vàng Việt Nam Tạp chí Phát triển KH & CN 2007, 10 (5), tr.41-50 15 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Phùng Đắc Cam, Nguyễn Thái Sơn Helicobacter pylori bệnh viêm, loét DD-TT Nhà xuất Y học Hà Nội 2003, tr.7-104 Icatlo FC, Kuroki M, Kobayashi C, Yokoyama H, Ikemori Y, Hashi T et al Affinity purification of Helicobacter pylori urease J Biol Chem 1998, 273 (29), pp.18130-18138 Kusters JG, van Vliet AHM & Kuipers EJ Pathogenesis of Helicobacter pylori infection Clin Microbiol Rev 2006, 19 (3), pp.449-490 Malfertheiner P, Megraud F, O'Morain CA, Atherton J, Axon AT, Bazzoli F et al Management of Helicobacter pylori infection the Maastricht IV/Florence Consensus Report Gut 2012, 61 (5), pp.646-664 Mobley HLT, Island MD & Hausinger RP Molecular biology of microbial ureases Microbiol Rev 1995, 59 (3), pp.451-480 Suzuki H, Nomura S, Masaoka T, Goshima H, Kamata N, Kodama Y, et al Effect of dietary anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin Y on Helicobacter pylori infection Aliment Pharmacol Ther 2004, 20 (1), pp.185-192 Turbett GR, Høj PB, Horne R & Mee BJ Purification and characterization of the urease enzymes of Helicobacter species from humans and animals Infect Immun 1992, 60 (12), pp.5259-5266 10 Versalovic J Helicobacter pylori: pathology and diagnostic strategies Am J Clin Pathol 2003, 119, pp.403-412 16 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 17 ... số nghiên cứu enzym urease H pylori đặc tính chúng phân tử lượng chuỗi Đã phân lập 17 chủng H pylori từ 18 mẫu sinh thiết ổ loét DD-TT Đã tách chiết enzym urease từ dịch nuôi cấy chủng sinh urease. .. 37oC VK phân lập sau ngày nuôi cấy định danh nhuộm Gram, phản ứng sinh hóa oxidase, catalase urease [3, 5] * Ni cấy tăng sinh H pylori tách chiết urease từ dịch ni cấy: Ni cấy chủng H pylori có... tiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK tách chiết urease từ H pylori làm nguyên liệu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu 18 mẫu bệnh phẩm