Đang tải... (xem toàn văn)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp mới với chi phí thấp hơn, giúp phát hiện 2 type Human papillomavirus nguy cơ thấp thường gặp nhất là Human papillomavirus 6 và Human papillomavirus 11 với độ nhạy 5 copy/phản ứng 25 µL bằng kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến có gắn thêm ZEN quencher gần đầu 5-huỳnh quang HEX, song song với phát hiện gen nội chuẩn β-actin bằng Texas-Red Taqman probe.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE CẢI TIẾN ĐỂ PHÁT HIỆN HPV NGUY CƠ THẤP TYPE VÀ 11 VỚI ĐỘ ĐẶC HIỆU VÀ ĐỘ NHẠY CAO Trần Thị Ngọc Ánh1,2#, Ngô Thị Hồng1,2,3#, Chu Văn Sơn1, Trần Dụ Chi4,5, Bùi Thị Việt Hà1,2, Nguyễn Thị Vân Anh1* *Tác giả liên hệ; #:Đồng tác giả thứ Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; 2Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, Thành phố Bắc Ninh Bệnh viện Da liễu Trung ương; 5Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Human papillomavirus (HPV) tác nhân gây bệnh phổ biến lây nhiễm qua đường tình dục, gồm nhiều sub-type phân thành nhóm nguy cao gây ung thư nhóm nguy thấp gây bệnh lý da niêm mạc với tỷ lệ nhiễm khả tái phát cao Trên thị trường có sinh phẩm nhập ngoại để phát số type Human papillomavirus nguy thấp, nhiên giá thành cao nên khó triển khai thành kít sàng lọc cộng đồng Trong nghiên cứu này, chúng tơi xây dựng phương pháp với chi phí thấp hơn, giúp phát type Human papillomavirus nguy thấp thường gặp Human papillomavirus Human papillomavirus 11 với độ nhạy copy/phản ứng 25 µL kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến có gắn thêm ZEN quencher gần đầu 5-huỳnh quang HEX, song song với phát gen nội chuẩn β-actin Texas-Red Taqman probe Kết so sánh 30 mẫu dịch âm đạo với sinh phẩm thương mại có uy tín cho kết tương đồng tỷ lệ mẫu dương tính chu kỳ ngưỡng phát Human papillomavirus 6/11 Từ khoá: HPV, nguy thấp, real time PCR Taqman, dịch âm đạo I ĐẶT VẤN ĐỀ Human papiloma virus (HPV) tác nhân gây bệnh quan trọng lây nhiễm qua đường tình dục nam nữ tồn giới cho bệnh truyền nhiễm qua đường tình dục phổ biến Hoa Kỳ [1] Các type Human papillomavirus 16 18 12 type khác 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 nghiên cứu chứng minh có nguy cao gây bệnh ung thư cổ tử cung [2,3,4] Ngồi type có nguy cao, số type nguy thấp Địa liên hệ: Nguyễn Thị Vân Anh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên công nhận nguyên nhân gây tổn thương lành tính da (mụn cơm, mụn cóc thơng thường, mụn cơm phẳng) Hai type HPV nguy thấp 11 nguyên nhân 90% bệnh lý da [5] Nhiễm trùng papillomatosis chủ yếu gặp trẻ nhỏ sinh từ bà mẹ có tiền sử nhiễm HPV giai đoạn chu sinh [6 - 8] Những tổn thương chuyển đổi thành ác tính [9] Nhiễm trùng HPV thường khơng biểu lâm sàng nên khơng thể có thống kê xác số lượng người nhiễm tồn giới Ước tính giới, hàng năm, HPV gây mụn cóc sinh dục cho 0,1 - 0,2% dân số, chủ yếu Email: vananhbiolab@gmail.com tuổi vị thành niên, thiếu niên [10] Các Ngày nhận: 30/7/2018 type dễ lây truyền qua tiếp xúc (da, Ngày chấp thuận: 04/9/2018 niêm mạc, dịch tiết có virus) Do đó, việc chẩn TCNCYH 115 (6) - 2018 61 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đoán sàng lọc cộng đồng HPV 11 VNĐ/ phản ứng) nên khó khăn triển khai góp phần quan trọng để phòng tránh lây thành xét nghiệm sàng lọc cộng đồng Ở nhiễm, đặc biệt cho trẻ sơ sinh Hiện nay, nước, chúng tơi chưa tìm thấy thơng tin phương pháp hiệu để chẩn đoán nghiên cứu phát triển phương pháp hay HPV dựa vào vật liệu di truyền (kỹ thuật sinh phẩm phát type HPV nguy PCR/real time PCR) Trên giới, có cơng thấp mà có thông tin sinh bố vài tác giả phát triển kỹ thuật phẩm phát type HPV nguy cao multiplex real time PCR để phát đồng Do vậy, nghiên cứu này, đặt thời số type nguy cao nguy thấp mục tiêu bước đầu phát triển phương pháp sàng lọc HPV mẫu dịch âm đạo multiplex real time PCR sử dụng Taqman Điển hình cơng bố tác giả Lindh probe cải tiến gắn thêm ZEN quencher để cộng (2007) phát 12 type HPV phát type HPV nguy thấp thường nguy cao type nguy thấp HPV 6/11 gặp HPV HPV 11 có độ đặc hiệu đồng thời chu trình nhiệt [11] 100% độ nhạy đạt tới ≤ copy phản ứng Tuy nhiên, hạn chế nghiên cứu sử 25 µL Kết nghiên cứu tiền đề cho dụng Taqman probe thơng thường có huỳnh việc phát triển phương pháp phát đồng quang TAMRA đầu 3’ nên tín hiệu thời type HPV nguy cao nguy cao chưa tối ưu master mix để phát thấp tương lai, hướng tới việc chế tạo 14 type ống phản ứng sinh phẩm có chất lượng tương đương mà phải thực 14 ống phản ứng riêng giá thành cạnh tranh so với sinh phẩm rẽ cho mẫu Một hạn chế khác chưa có thương mại có uy tín thị trường Nhờ đó, thơng tin tối ưu độ nhạy độ đặc hiệu góp phần tầm sốt tỷ lệ nhiễm HPV đánh phản ứng Nghiên cứu tác giả Seaman giá hiệu vacxin cộng (2010) có cải tiến việc phát triển kỹ thuật multiplex real time PCR phát đồng thời HPV 16, 18 type HPV nguy thấp 6, 11 [12] Tuy nhiên, độ nhạy ngưỡng phát đạt 103 copy/phản ứng 25 µL, phần sử dụng Taqman II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Mẫu tham chiếu dùng để xây dựng phương pháp: probe thơng thường có BHQ1 quencher đầu + Mẫu HPV: mẫu DNA tinh 3’ Tác giả Yu cộng (năm 2012) sử xác định dương tính với HPV dụng probe huỳnh quang AllGlo để phát genotypes khác Trong có 14 type đồng thời type HPV 6, 11, 16, 18 với độ HPV nguy cao phổ biến (HPV 16, 18, 31, nhạy 10 copy/phản ứng 25 µL [13] Trên thị 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) trường có kít phát HPV type 11 bệnh viện Phụ Sản Trung ương cung cấp nguy thấp HPV 6/11 Real-TM (Sacace xác định đồng thời kit thương mại Biotechnologies, Ý) có độ nhạy đạt tới 2,5 Real time CobasđHPV test ca hóng Roche copy/phn ng 25 àL nhng thành phần Diagnostics - Thuỵ Sỹ GenoFlow human cơng thức chưa cơng bố Ngồi ra, giá papillomavirus array test (GF test) hãng thành sinh phẩm nhập ngoại cao (178.000 Diagcor - Hồng Kơng có type nguy 62 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thấp (HPV 6, 11) bệnh viện Da liễu Trung Mẫu thử nghiệm: Mẫu bệnh phẩm (n = 95) ương cung cấp xác định đồng thời lấy từ dịch âm đạo bệnh nhân GF test (Diagcor – Hồng Kông) HPV 6/11 bảo quản dung dịch nước muối Real-TM hãng Saccase – Ý Các mẫu sinh lý khử trùng Mẫu sử dụng lựa chọn có giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) để tách chiết DNA tổng số DNA sử ≤ 32 để đảm bảo nồng độ DNA ≥ 10 copies/µ dụng bảo quản -80oC trước l, tương đương với nồng độ chuẩn dương hay tiến hành real time PCR Mẫu thu sử dụng kit thương mai DNA thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện, mẫu tham chiếu sử dụng làm Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh khn để nhân trình tự đặc hiệu từ năm 2017 đến 2018 Tiêu chuẩn lựa chọn PCR sử dụng cặp mồi GP5+/6+ (theo khuyến bệnh nhân phụ nữ độ tuổi từ 18 - 65 cáo CDC) giải trình tự DNA để khẳng tuổi, đến khám tự nguyện tham gia nghiên định type cứu; tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân + Mẫu nhiễm vi sinh vật gây bệnh khác: mẫu DNA dương tính với tác nhân gây bệnh bao gồm: Hepatitis B virus (HBV), Hepatitis C virus (HCV), Human Simplex virus cytomegalovirus type (CMV), - (HSV), Mycobacterium tuberculosis (MTB), Epstein - Barr virus (EBV), Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium Bệnh viện Bạch Mai, Học Viện Quân Y Bệnh viện Da liễu Trung ương cung cấp Mẫu HBV, HCV HSV type - xác định kít thương mại (Real time PCR Cobas®HBV test, Real time PCR Cobas®HCV test, Cobas®HSV and test hãng Roche Diagnostics - Thuỵ Sỹ; mẫu CMV xác định Real time PCR ANAPURE® CMV cắt cổ tử cung hồn tồn, thời kỳ kinh nguyệt, viêm nhiễm nặng đặt thuốc Nghiên cứu phê duyệt hội đồng khoa học, sở định số 1124/QĐ-ĐHKHTN Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thực theo đạo đức nghiên cứu Y học Bệnh nhân cung cấp đầy đủ thông tin nghiên cứu, bảo mật thông tin cá nhân ký vào phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu Phương pháp 2.1 Thiết kế primer probe cho phản ứng real time PCR phát đồng thời type HPV HPV 11 Hai cặp mồi probe sử dụng nghiên cứu thiết kế sử dụng IDT’s ANAPURE MTB qPCR, mẫu EBV xác PrimerQuest kết hợp với phần mềm SnapGen qPCR, mẫu MTB xác định ® định ANAPURE EBV qPCR, ANAPURE , version 4.1.3 dựa vào trình tự vùng gen E6-E7 mẫu M hominis M genitalium xác đặc định đồng thời Mycoplasma homi-geni HG793938.1), trình tự vùng gen E1 đặc hiệu qPCR hãng ANABIO R&D - Vietnam, cho HPV 11 (Acession No JQ773411.1) Diagcor STD array test - Hồng Kông) Các công bố ngân hàng gen NCBI Hai trình mẫu lựa có giá trị Ct thấp tự probe đặc hiệu cho HPV HPV 11 đạt yêu cầu Ct ≤ 32, để đảm bảo nồng độ DNA cải tiến gắn thêm ZEN quencher dye vi sinh vật nhiễm sử dụng oligonucleotide thứ gần đầu 5’-huỳnh quang cao, tối thiểu 103 copies/µl HEX để tăng khả hấp thụ hay dập tắt tín ® TCNCYH 115 (6) - 2018 ® hiệu cho HPV (Acession No 63 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC hiệu HEX probe chưa gắn vào khuôn, theo công bố Nguyen cộng [14] nhờ tín hiệu giảm độ nhạy phản Mồi probe tổng hợp hãng IDT ứng tăng lên Cặp mồi probe đặc (Hoa Kỳ) trình bày bảng hiệu cho human β-actin (ACTB) thiết kế Bảng Các cặp mồi probe đặc hiệu cho HPV HPV 11 Mồi/ Gen Trình tự (5’ - 3’) mẫu dò đích Kích thước Lượng (pmol/ (bp) pứ) 6-Fw CCGCTGTGTGAAGTAGAAAAGGTAAA 6-Rv CTACAGGGTCTGGAGGTTGC 6-HEX probe /5HEX/AAGGGTCGC/ZEN/TGCCTACACTGCT GG/3IABkFQ/ 11-Fw GCAAGTACAGTTATAGGGGAGG 11-Rv GTCAAAGTCTCCACGCTG 11-HEX probe /5HEX/CGGAATGG A/ZEN/TAAC GCGCCA GACCG/3IABkFQ/ ACTB-Fw GATGTCCACGTCACACTTCA ACTB-Rv ATGCCTGAGAGGGAAATGAGGGC ACTBTexas /5TexasRed/ATGCCTGAGAGGGAAATGAGG probe E6, E7 165 174 E1 β-actin 5 115 GC/3BHQ2/ 2.2 Tách chiết DNA HPV nhân HPV 11 Thành phần phản ứng PCR gồm 1X dòng tạo chuẩn dương chứa trình tự đặc hiệu HPV HPV 11 Hot - Taq Buffer; 0,2 mM dNTP; 1U Hot - Taq; DNA tổng số virus tách chiết từ Phản ứng PCR thực với chế độ mẫu bệnh phẩm dịch âm đạo sử dụng sinh nhiệt 950C - phút; 45 chu kỳ gồm bước: phẩm ANAPURE VIRAL DNA/RNA mini kit 950C - 30 giây, 600C - 30 giây, 720C - 30 giây; (ANABIO R & D, Việt Nam) theo hướng dẫn 720C - phút Các sản phẩm PCR kiểm nhà sản xuất, sau lưu trữ - tra điện di gel agarose 2%, nhuộm 20oC cho phản ứng PCR real time Ethidium bromide chụp ảnh hệ thống PCR DNA sau tinh từ mẫu tham chiếu Gel Doc XR (Biorad) 400 nM 6/11 Rv/Fw H2O cho thể tích 25 µl dương tính HPV HPV 11 sử dụng Sản phẩm PCR 165 bp đặc hiệu cho HPV làm khuôn cho phản ứng PCR nhân trình 174 bp đặc hiệu cho HPV 11 nhân tự gen đặc hiệu E6 - E7 E1 kích thước dòng trực tiếp vào vector pTOP sử dụng tương ứng 165 bp 174 bp HPV sinh phẩm TOPcloner ™ TA Kit (Enzynomics, 64 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hàn Quốc) Plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn 165 bp 174 bp được biến nạp vào E coli DH5 α, sau ni cấy mơi trường LB đặc bổ sung ampicillin 50 mg/L, tiến hành chọn lọc khuẩn lạc xanh-trắng sàng lọc colony - PCR sử dụng cặp mồi vector M13 - Fw/Rv (đi kèm sinh phẩm) mồi đặc hiệu 6, 11 - Fw/Rv Khuẩn lạc tái tổ hợp sử dụng để tách plasmid để làm chuẩn dương cho phản ứng real time PCR phát HPV HPV 11 đặt tên tương ứng pHPV6 - E6/7 pHPV11 - E1 2.4 Xác định độ đặc hiệu Độ đặc hiệu multiplex real time PCR nêu đánh giá thơng qua kết dương tính giả (nếu có) sử dụng µl DNA khn nồng độ tối thiểu 103 copies/µl 14 type HPV nguy cao phổ biến gồm HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, số vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm khác gồm HBV, HCV, HSV, CMV, MTB, EBV, Mycoplasma hominis, M genitalium bổ sung vào hỗn hợp 20 µl master mix có thành phần mơ tả mục 2.3 2.3 Xác định ngưỡng phát Phản ứng thực với chu trình nhiệt phản ứng tối ưu nồng độ chuẩn giống áp dụng cho type HPV 11, dương mô tả mục 2.3 Plasmid tái tổ hợp pHPV6-E6/7 pHPV11 2.5 Thử nghiệm phát HPV - E1 sau tinh xác định nồng độ bước sóng 260 nm máy quang phổ HPV 11 mẫu bệnh phẩm so sánh độ tương đồng với sinh phẩm thương mại Nanodrop Xác định ngưỡng phát Tổng cộng 95 mẫu sử dụng để thử kỹ thuật multiplex real time PCR cách nghiệm phát HPV HPV 11 master mix chế tạo chu trình nhiệt thiết lập pha lỗng nồng độ khn plasmid pHPV6 E6/7, pHPV11 - E1 hỗn hợp plasmid tỷ lệ 1: dải nồng độ 103, 102, 10, copies/µl nghiên cứu Trong đó, 30 mẫu gồm 10 mẫu dương tính 20 mẫu âm tính với µl DNA khn bổ sung vào 20 µl mas- HPV 11 sử dụng để so sánh tương ter mix multiplex real time PCR gồm: TO- đồng (tỷ lệ dương tính/âm tính) độ nhạy (Ct) sinh phẩm tạo thành nghiên Preal Taqman PCR master mix 1X 11- Rv/ Fw; 50 nM 6, 11 - HEX probe; 150 nM cứu sinh phẩm thương mại HPV 6/11 REAL-TM (Sacace Biotechnologies, Ý) ACTB Rv/Fw; 100 nM ACTB- probe H2O để Tồn thí nghiệm từ mục 2.1 đến 2.4 đạt tổng thể tích 25 µl Phản ứng thực thực Phòng Thí nghiệm trọng (Enzynomics); 250 nM 6, 11 - Rv/Fw; 250 nM với chu trình nhiệt 95 C - 10 phút; o điểm Công nghệ Enzym Protein, Trường 45 chu kỳ gồm 95 C - 10 giây; 60 C - 45 giây Đại học Khoa học Tự nhiên từ năm 2017 đến hệ thống Light Cycler 96 (Roche Diagnos- 2018 Thí nghiệm mục 2.5 thực tics) Ngưỡng phát nồng độ thấp Khoa Xét nghiệm - Chẩn đốn hình ảnh chứng dương pHPV6 - E6/7 pHPV11 - - Thăm dò chức Trung tâm Kiểm E1 ống phản ứng mà phát sốt Bệnh tật tỉnh Bắc Ninh Phòng Thí tín hiệu huỳnh quang với giá trị Ct < 40, nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym tính giá trị copies/µl DNA khn Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đầu vào x 5) năm 2018 TCNCYH 115 (6) - 2018 65 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III KẾT QUẢ Vector mang chuẩn dương HPV HPV 11 Quốc) khuẩn lạc tái tổ hợp khẳng định phương pháp colony - PCR sử dụng cặp mồi vector M13 - Fw/Rv (đi kèm sinh phẩm) mồi đặc hiệu 6, 11 - Fw/Rv Kết Trong nghiên cứu này, đoạn gen đặc hiệu trình bày hình ảnh điện di giếng cho vùng E6 - HPV có kích thước 165 (hình 1B) giếng (hình 1C) cho thấy kích bp đoạn gen đặc hiệu cho vùng E1 thước băng điện di 165 bp 174 bp HPV 11 có kích thước 174 bp khuếch với kích thước đoạn gen đặc hiệu vector đại phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tái tổ hợp HPV6 - E6/7 HPV11 - E1 Để Kết trình bày Hình 1A cho thấy: sản khẳng định chắn khuẩn lạc tái tổ hợp phẩm PCR với cặp mồi - Fw - Rv cho chứa gen đặc hiệu HPV HPV 11, băng sắc nét với kích thước chúng tơi sử dụng cặp mồi vector M13 Rv/Fw tương ứng 165 bp (giếng 3); tương tự, sản phẩm PCR với cặp mồi HPV 11 cho băng rõ nét có kích thước 174 bp (giếng 4) Hai băng sau tinh đem giải trình tự Kết giải trình tự trùng khớp với trình tư gen E6-7 HPV trình tự gen E1 HPV 11 (khơng trình bày đây) cho kích thước đoạn gen khuếch đại tổng kích thước đoạn gen mồi M13 nhân lên (202 bp) cộng với kích thước đoạn gen đích Như vậy, kích thước tính tốn mặt lý thuyết sử dụng mồi vector cho đoạn gen đích HPV HPV 11 367 bp 376 bp Đúng dự đoán, kết thể hình 1B (giếng - 4) hình 1C (giếng - 6) Sản phẩm PCR sau nhân dòng cho thấy chúng tơi nhân dòng thành công vào vector pTOP TA V2 sử dụng sinh plasmid tái tổ hợp pHPV6-E6/7 pHPV11 - phẩm TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Hàn E1 Hình Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen đặc hiệu HPV6-E6/7 HPV11E1 (A) kiểm tra sản phẩm sau nhân dòng (B, C) (A): Giếng 1: Thang chuẩn DNA 100 bp, giếng 2: Đối chứng âm, giếng 3: sản phẩm PCR HPV6 - E6/7, giếng 4: sản phẩm PCR HPV11 - E1; (B): Giếng 1: Đối chứng âm, giếng - 4: Sản phẩm PCR mồi vector M13, giếng 5: Thang chuẩn DNA 100 bp, giếng 6: sản phẩm PCR sử 66 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC dụng mồi đặc hiệu Fw/Rv - 6; (C): Giếng 1: Đối chứng âm, giếng - 6: Sản phẩm PCR sử dụng mồi vector M13, giếng 3: Thang chuẩn DNA 100 bp, giếng 2: sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu Fw/Rv - 11 Ngưỡng phát HPV HPV 11 multiplex real time PCR Kết đánh giá ngưỡng phát kỹ thuật multiplex real time PCR phát đồng thời HPV HPV 11 thể hình cho thấy tất nồng độ chứng dương dạng đơn lẻ (hình 2A - B) hay hỗn hợp (hình 2C) cho kết dương tính, giá trị Ct nồng độ pha lỗng từ cao đến thấp giảm trung bình 3,2 Ngưỡng phát HPV phản ứng lên tới copy/phản ứng (1 copy/µl DNA đầu vào x µl khuôn/phản ứng 25 µl) với giá trị R2: 0,993, Efficiency: 93%, slope: -3,34 Tương tự, ngưỡng phát HPV 11 copy/phản ứng (R2: 0,998, Efficiency: 85%, slope: -3,7) đồng thời HPV 6,11 lên tới copy/phản ứng (R2: 0,999, Efficiency: 80%, slope: -3,99) Dựa kết này, ngưỡng phát kỹ thuật multiplex real time PCR phát đồng thời tác nhân gây bệnh HPV6, 11 xác định copy/phản ứng 25 µl (tương đương nồng độ DNA khn copy/µl) Hình Đường chuẩn biểu diễn tín hiệu huỳnh quang phản ứng Real time PCR đường hồi quy tuyến tính giá trị chu kỳ ngưỡng dải nồng độ chuẩn dương khác nhau: (A1, B1, C1) TCNCYH 115 (6) - 2018 67 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Đường chuẩn Real time PCR biểu diễn tín hiệu khuếch đại chuẩn dương HPV (A1), HPV 11 (B1) hỗn hợp HPV 6, 11 (C1) nồng độ 103, 102, 10,1 copy/µl; (A2, B2, C2) Đường hồi quy tuyến tính giá trị chu kỳ ngưỡng Ct nồng độ chuẩn dương HPV (A2), HPV 11 (B2) hỗn hợp HPV 6, 11 (C2) Độ đặc hiệu multiplex real time PCR phát HPV HPV 11 Để xác định độ đặc hiệu real time PCR phát HPV HPV 11, chúng tơi sử dụng 20 mẫu DNA dương tính với type HPV nhóm nguy cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) số tác nhân khác (HBV, HCV, HSV, CMV, MTB, EBV, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium) mô tả phần mẫu tham chiếu, làm DNA khuôn cho multiplex real time PCR với cặp mồi probe thiết kế cho HPV type 11 Kết Bảng cho thấy sinh phẩm chế tạo nghiên cứu cho kết âm tính với tác nhân gây bệnh tham chiếu nồng độ > 103 copies/µl, chứng tỏ độ đặc hiệu kỹ thuật 100% Bảng Kết thử nghiệm độ đặc hiệu sinh phẩm với số tác nhân gây bệnh STT Tác nhân vi sinh vật gây bệnh Kết HPV nhóm nguy cao gồm type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 Âm tính HBV (Hepatitis B Virus) Âm tính HCV (Hepatitis C Virus) Âm tính HSV (Herpes Simplex Virus) type 1, Âm tính CMV (Cytomegalovirus) Âm tính MBT (Mycobacterium tuberculosis) Âm tính EBV (Epstein - Barr Virus) Âm tính Mycoplasma hominis Âm tính Mycoplasma genitalium Âm tính Khả phát có mặt virus HPV6, 11 master mix đánh giá mức độ tương đồng kỹ thuật phát triển với sinh phẩm thương mại Sử dụng DNA tách chiết từ mẫu dịch phết âm đạo 95 bệnh nhân đến khám Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh để đánh giá khả phát có mặt HPV HPV 11 master mix chế tạo nghiên cứu (thành phần mô tả mục nguyên liệu phương pháp, kết bảng 1, tạm đặt tên HPV6/11 - KLEPT), chúng tơi phát thấy có 10/95 (10,5%) mẫu dương tính với type HPV 6/11 (bảng 3) 68 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Kết phát HPV HPV 11 mẫu thử nghiệm master mix chế tạo nghiên cứu sinh phẩm thương mại HPV6/11 - KLEPT HPV 6/11 REAL-TM Tổng số Kit (Sacace) Dương tính Âm tính Dương tính 10 10 Âm tính 20 20 Tổng số 10 20 30 Trong số 95 mẫu này, 10 mẫu bệnh phẩm dương tính ngẫu nhiên 20 mẫu bệnh phẩm âm tính (tổng cộng n = 30) chọn để so sánh tương đồng master mix HPV 6/11 - KLEPT với sinh phẩm thương mại đạt chuẩn IVD châu Âu có tên HPV 6/11 REAL-TM Kit (Sacace Biotechnologies, Ý) Kết thể bảng cho thấy tín hiệu dương tính master mix HPV 6/11 - KLEPT chế tạo nghiên cứu (10 mẫu tín hiệu HEX cho HPV type 6/11) kit thương mại (FAM cho mẫu HPV type HEX cho mẫu HPV type 11) chênh lệch không giá trị Ct Kết so sánh bước đầu 30 mẫu cho thấy master mix HPV 6/11 - KLEPT có chất lượng tương đương với sinh phẩm thương mại HPV 6/11 REAL - TM Kit (Sacace, Ý) Bảng Giá trị chu kỳ ngưỡng phản ứng real time PCR phát 10 bệnh nhân dương tính HPV /11 master mix nghiên cứu so sánh với sinh phẩm thương mại STT HPV6/11KLEPT HPV 6/11 Real - TM HPV 6/11 Real-TM Ct HEX (HPV 6/11) Ct FAM (HPV 6) 32,28 31,17 32,89 29,68 23,60 24,02 31,18 28,49 31,68 32,11 30,16 24,42 25,26 31,50 31,84 31,00 30,72 32,28 32,96 31,96 31,83 32,93 30,56 30,01 30,63 29,98 29,54 27,86 28,54 31,96 30,77 28,14 29,32 10 26,51 25,01 30,11 29,23 TCNCYH 115 (6) - 2018 Ct HEX (HPV 11) HPV6/11KLEPT 31,43 29,54 28,33 Ct Texas Red (nội chuẩn) 69 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV BÀN LUẬN HPV nguy thấp khác để thử nghiệm, kết Trong nghiên cứu này, xây dựng thành công phương pháp phát type HPV nguy thấp phổ biến HPV HPV 11 kỹ thuật multiplex real time PCR với master mix tối ưu gồm nồng độ mồi xuôi-ngược (5 pmol/phản ứng), Taqman probe gắn huỳnh quang HEX (1 pmol/phản ứng), với việc phát có mặt gen nội chuẩn β- actin thơng qua tín hiệu huỳnh quang Texas Red Ở đây, chúng tơi chủ đích thiết kế kênh màu huỳnh quang HEX cho type HPV HPV 11 để tương lai ghép cặp với kênh màu huỳnh quang khác FAM phát type HPV nguy cao Cy5 phát HPV 16/18 cho việc phát triển phương pháp phát đồng thời type HPV nguy cao thấp hệ thống máy real time PCR kênh màu Ngồi ra, chúng tơi nhân dòng thành công plasmid mang đoạn bước đầu dùng kit mẫu xác định có chứa type HPV nguy cao virus, vi khuẩn gây bệnh phổ biến khác hay phát phương pháp real time PCR phòng xét nghiệm sinh học phân tử bệnh viện cho thấy độ đặc hiệu đạt 100% Với kỹ thuật phát triển, chúng tơi tạm tính giá thành master mix, mồi, probe khoảng 40.000 VNĐ/phản ứng sinh phẩm thương mại Sacace HPV 6/11 REAL - TM Kit có giá thành 178.000VNĐ/phản ứng Mặc dù từ việc phát triển kỹ thuật đến việc chế tạo thương mại kit trình dài tốn thời gian chi phí chắn tăng lên, phương pháp multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến phát triển nghiên cứu có tiềm ứng dụng việc chế tạo kit sàng lọc HPV HPV 11 cộng đồng có giá thành cạnh tranh với kit ngoại nhập Đây gen đặc hiệu cho HPV HPV 11 để tạo kết tiền đề để chúng tối tiếp tục phát triển chuẩn dương cho phản ứng đánh giá kỹ thuật phát đồng thời 14 type HPV ngưỡng phát phản ứng phát nguy cao 02 type nguy thấp kỹ HPV HPV 11 copy/phản ứng 25 µL thuật multiplex real time PCR, nhằm tầm soát (tương đương với nồng độ DNA đầu vào type HPV gây bệnh qua đường tình dục copy/µl) dựa đường chuẩn hồi quy tuyến đánh giá hiệu vắcxin tính có độ tin cậy cao (R = 0,999) Ngưỡng phát master mix chế tạo tốt nhiều so với master mix công bố tác V KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, phát giả Seaman cộng (103 copy/ phản ứng triển thành công kỹ thuật multiplex real time 25 µL) tác giả Yu cộng (10 copy/ PCR sử dụng Taqman probe cải tiến để phát phản ứng 25 µL), gần tương đương 02 type HPV nguy thấp thường gặp với ngưỡng phát sinh phẩm HPV HPV HPV 11 với độ đặc hiệu 6/11 REAL - TM (2,5 copy/phản ứng 25 µL) 100% độ nhạy đạt tới copy/phản ứng 25 Kết mẫu thực cho thấy tương µL, cao so với số cơng bố đồng % dương tính: âm tính (10: 20) giới Kết bước đầu so sánh master mix giá trị chu kỳ ngưỡng Ct Mặc dù chưa có chế tạo nghiên cứu với sinh phẩm điều kiện thu thập mẫu tham chiếu type thương mại đạt chuẩn IVD châu Âu cho thấy 70 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tương đồng tỷ lệ mẫu dương tính:âm tính persistence among children: Design, methods (10:20) giá trị chu kỳ ngưỡng and preliminary results of the HERITAGE study Papillomavirus Res, 2, 145 - 152 Lời cám ơn Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn công ty cổ phần ANABIO R&D hỗ trợ kinh phí để thực nghiên cứu này, cảm ơn PGS.TS.BS Lê Quang Vinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương, PGS.TS.BS Nguyễn Lĩnh Toàn Học viện Quân Y ThS BS Trương Thái Phương Bệnh viện Bạch Mai cung cấp mẫu tham chiếu cho nghiên cứu K.S., Dahlstrom K.R., Cheng J.N et al (2015) HPV16 Antibodies as Risk Factors for Oropharyngeal Cancer and Their Association with Tumor HPV and Smoking Status Oral Oncol, 51, 662 - 667 Liao S., Deng D., Zhang W et al (2012) Human papillomavirus 16/18 promotes cervical cancer cell of delivery Virol J, 9, 80 doi: 10.1186/1743422X-9-8 Guimerà N., Lloveras B., Lindeman J., et al (2013) The occasional role of low-risk human papillomaviruses 6, 11, 42, 44, and 70 results Burd E.M (2003) Human Papillomavirus and Cervical Cancer Clin Microbiol Rev., 16, - 17 Anderson papillomavirus from mothers to infants: Relationship between infection rate and mode in anogenital carcinoma defined by laser capture microdissection/PCR methodology TÀI LIỆU THAM KHẢO Park H., Lee S.W., Lee I.H et al (2012) Rate of vertical transmission of human E5 proliferation, migration and invasion in vitro and accelerates from a global study Am J Surg Pathol, 37, 1299 - 1310 10 Forman D., de Martel C., Lacey C.J., et al (2012) Global Burden of Human Papillomavirus and Related Diseases Vaccine, 30,12 - 23 11 Lindh M, Gorander S, Andersson E et al (2007) Real-time Taqman PCR targeting 14 human papilloma virus types J Clin Virol, 40, 321 - 324 12 Seaman W.T., Andrews E., Couch M et al (2010) Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by tumor growth in vivo Oncol Rep, 29, 95 - 102 real time PCR Virol J., 7, 10.1186/1743-422X-7-194 Flores-Díaz E., Sereday K.A., Ferreira S et al (2017) HPV-6 Molecular Variants Association with the Development of Genital Warts in Men: The HIM Study J Infect Dis., 13 Yu D., Chen Y., Wu S et al (2012) Simultaneous Detection and Differentiation of Human Papillomavirus Genotypes 6, 11, 16 and 18 by AllGlo Quadruplex Quantitative 215, 559 - 565 PCR PLoS ONE, 7, e48972 doi.org/10.1371/ journal.pone.0048972 Lee S.M., Park J.S., Norwitz E.R et al (2013) Risk of Vertical Transmission of Human Papillomavirus throughout Pregnancy: A Prospective Study PLoS ONE, 8, e66368 doi: 10.1371/journal.pone.0066368 Trottier H., Mayrand M.H., Coutlée F et al (2016) Human papillomavirus (HPV) perinatal transmission and risk of HPV TCNCYH 115 (6) - 2018 194 doi: 14 Nguyen V.D., Christopher V., Chu C.H et al (2016) Validation of a novel realtime PCR assay for detection of HLA-B*15:02 allele for prevention of carbamazepine– Induced Stevens-Johnson syndrome/Toxic Epidermal Necrolysis in individuals of Asian ancestry, Hum Immunol, 77, 1140 - 1146 71 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary DETECTION OF LOW-RISK HPV TYPE AND 11 BY MULTIPLEX REAL TIME PCR USING MODIFIED TAQMAN PROBES Human papillomaviruses (HPVs) are common sexually transmitted infections, having two major sub-types: oncogenic (or high-risk) causing cancers and non-oncogenic (or low-risk) causing different types of skin and mucosal diseases with high incidence and recurrence Currently, commercial imported test kits for low-risk types are available; however, their expensive costs limit its usage as a screening test, which is particularly true for settings dependent upon health insurance programs In this study, we successfully developed a new and lower cost multiplex real time PCR method and a kit for detecting the two most common types of low-risk HPV types including HPV and HPV 11 at sensitivity of copies/25 µL reaction, using Taqman probes modified with ZEN quencher dye near 5’-end of HEX channel for screening low-risk types 6/11 and Texas Red Taqman probe for detection of β-globin internal control gene The new assay was used in parallel with the commercial kit (HPV 6/11 Real-TM, Sacace, Italy) to detect HPV6/11 in a set of 30 DNA samples extracted from 30 vaginal swab specimens The result showed comparable threshold cycles and the percentage of positives Keywords: HPV, low-risk, real time PCR Taqman, vaginal swab 72 TCNCYH 115 (6) - 2018 ... HPV 11 (B2) hỗn hợp HPV 6, 11 (C2) Độ đặc hiệu multiplex real time PCR phát HPV HPV 11 Để xác định độ đặc hiệu real time PCR phát HPV HPV 11, sử dụng 20 mẫu DNA dương tính với type HPV nhóm nguy. .. giếng 2: sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu Fw/Rv - 11 Ngưỡng phát HPV HPV 11 multiplex real time PCR Kết đánh giá ngưỡng phát kỹ thuật multiplex real time PCR phát đồng thời HPV HPV 11 thể hình cho... sinh bố vài tác giả phát triển kỹ thuật phẩm phát type HPV nguy cao multiplex real time PCR để phát đồng Do vậy, nghiên cứu này, đặt thời số type nguy cao nguy thấp mục tiêu bước đầu phát triển