Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài nhằm đóng góp vào công cuộc tìm kiếm nguồn nguyên liệu làm thuốc mới, cho đến nay, ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã bước đầu tổng hợp thành công các dẫn chất cis-N-alkyl phthalazinon có tác dụng ức chế chọn lọc phosphodiesterase IV và tác dụng kháng viêm mạnh hơn các dẫn chất trans và hỗn hợp racemic....
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT QUANG HỌC CỦA DẪN CHẤT Cis-N-BENZYL VÀ Cis-N-HEPTYL TETRAHYDRO PHTHALAZINON BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC SỬ DỤNG PHA TĨNH BẤT ĐỐI Chương Ngọc Nãi*, Trần Quốc Duy**, Đặng Văn Tịnh**, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Mục tiêu: Nhằm đóng góp vào cơng tìm kiếm nguồn nguyên liệu làm thuốc mới, nay, Việt Nam, nhóm nghiên cứu chúng tơi bước đầu tổng hợp thành công dẫn chất cis-N-alkyl phthalazinon có tác dụng ức chế chọn lọc phosphodiesterase IV tác dụng kháng viêm mạnh dẫn chất trans hỗn hợp racemic Đối với dẫn chất cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon (N1) cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon (N2) tổng hợp, chưa có quy trình cụ thể để xác định độ tinh khiết quang học.Vì vậy, phương pháp tách đồng phân đối quang riêng lẻ mang tính cấp thiết Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất quang hoạt N1 N2 đãđược tổng hợp phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao dùng pha tĩnh bất đối dẫn xuất tris (3,5dimethylphenyl carbamat) cellulose Kết quả: Đã xác định điều kiện sắc ký thích hợp để xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất quang hoạt N1 N2, sử dụng pha tĩnh bất đối dẫn xuất tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) cellulose (cột Lux cellulose-1: 250 x 4,6 mm; μm) với pha động n-hexan chứa triethylamin 0,2% isopropanol chứa triethylamin 0,2% (90:10), nhiệt độ cột 30oC, tốc độ dòng 1,5 ml/phút hợp chất N1 ml/phút hợp chất N2, bước sóng phát 317 nm Kết thẩm định cho thấy quy trình có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao vàđộ xác RSD < 2%.Độ tinh khiết quang học đối quang (ee) dẫn chất (−)N1, (+)N1, (−)N2 (+)N2 90,90%; 91,36%; 93,40% 93,42% Kết luận: Đề tài xây dựng thành cơng quy trình HPLC xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon Quy trìnhcó thể áp dụng để xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất cis-N-alkyl-tetrahydro phthalazinon tổng hợp Từ khóa: cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon, cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon, độ tinh khiết quang học, pha tĩnh bất đối tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) cellulose ABSTRACT CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF ENANTIOMERS OF SYNTHESIZED NEW CHIRAL Cis-N-HEPTYL AND Cis-N-BENZYL TETRAHYDRO PHTHALAZINONE DERIVATIVES WITH CHIRAL STATIONARY PHASE Chuong Ngoc Nai, Tran Quoc Duy, Dang Van Tinh, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 128 - 133 Objective: In order to search for new sources of bulk drugs, so far, in Vietnam, our study group was successfully synthesized new chiral cis-N-alkyl phthalazinone derivatives with selective phosphodiesterase IV inhibitory activity and stronger anti-inflammatory activity than that of trans derivatives and racemic mixture For synthesized new chiral cis-N-heptyl tetrahydrophthalazinone (N1) andcis-N-benzyl tetrahydrophthalazinone (N2) derivatives, there is not a specific proceduretodetermine their enantiomeric purity, so far Therefore, * Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Chương Ngọc Nãi ĐT: 0913799068 128 ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Email: diemnhim@yahoo.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học separation of these chiral compounds is necessary Subjects and Methods: A high performance liquid chromatographic method using derivatized cellulose tris (3,5-dimethylphenyl carbamate) chiral stationary phase was developed for separation of the enantiomers of synthesized new chiral N1 and N2 derivatives Results: The appropriate chromatographic conditions were found out for complete separation of the enantiomers, using a cellulose tris-3,5-dimethylphenyl carbamate chiral stationary phase (Lux cellulose-1 column: 250 x 4.6 mm; μm), thermostated at 30oC, mixture of n-hexan containing 0.2% triethylamine and isopropanol containing 0.2% triethylamine (90:10, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.5 ml/min for N1 compound, of ml/min for N2 compound, and detection wavelength of 317 nm The method was validated and shown wide linearity range with high correlation coefficient and the precision with RSD < 2% The enantiomeric purity of the synthesized enantiomers is 90.90%, 91.36%, 93.40% and 93.42% (ee) for (−)N1, (+)N1, (−)N2 and (+)N2, respectively Conclusion: A liquid chromatographic method was successfully developed for separation of the enantiomers of synthesized new chiral cis-N-heptyl and cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinone derivatives The validated method could be applied for determination of the enantiomeric excess (ee) of synthesized cis-N-alkyl tetrahydro phthalazinone derivatives Key words: cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinone, cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinone, enantiomeric purity, cellulose tris-3,5-dimethylphenyl carbamate chiral stationary phase hiệu cao dùng pha tĩnh bất đối dẫn xuất ĐẶT VẤN ĐỀ tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) cellulose Tác dụng sinh học chất đối quang thể ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU dạng đồng phân quang học riêng lẻ, nên việc xác định độ tinh khiết Đối tượng nghiên cứu quang học sản phẩm vô quan trọng (− −)N1:Cis(−)-2-(N-heptyl)-4-(3’,4’để xác định xem sản phẩm có đạt tiêu chuẩn dimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2Hđộ tinh khiết quang học ngun liệu phthalazin-1-on làm thuốc hay khơng Nhiều cơng trình nghiên (+)N1:Cis(+)-2-(N-heptyl)-4-(3’,4’cứu giới cho thấy dẫn chất cis-Ndimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2Halkyl phthalazinon có tác dụng ức chế chọn lọc phthalazin-1-on phosphodiesterase IV mạnh đồng phân (− −)N2:Cis(−)-2-(N-benzyl)-4-(3’,4’trans đồng thời đồng phân cis(+) có tác dụng ( , ) dimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2Hmạnh cis(−) dạng racemic Hiện phthalazin-1-on nay, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh tổng hợp thành cơng dẫn chất quang hoạt cis-N-heptyl cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon đường tổng hợp tạo muối dia Đối với dẫn chất tổng hợp này, chưa có quy trình cụ thể để xác định độ tinh khiết quang học Vì vậy, việc xây dựng phương pháp tách đồng phân đối quang riêng lẻ cần thiết Trong nghiên cứu này, tiến hành phân tách đồng phân cis-N-alkyl-tetrahydro phthalazinon phương pháp sắc ký lỏng Chuyên Đề Dược Học (+)N2:Cis(+)-2-(N-benzyl)-4-(3’,4’dimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2Hphthalazin-1-on Trang thiết bị, hóa chất dung mơi Trang thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC-20A.Cột sắc ký Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm; μm) Cân phân tích Mettler AB265-S Các thiết bị phân tích hiệu chuẩn 129 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Hóa chất, dung mơi Isopropanol, n-hexan đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (J.T.Baker).Triethylamin đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) - Cột sắc ký: Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm, μm) - Nhiệt độ cột: 30oC - Đầu dò PDA cài đặt bước sóng 317 nm Phương pháp nghiên cứu - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Khảo sát điều kiện phân tích Các dẫn chất cis-N-heptyl cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon base hữu phân cực, nên pha động sử dụng phải phân cực Vì vậy, sắc ký pha thuận áp dụng Hiện có nhiều loại pha tĩnh bất đối sử dụng để tách đồng phân quang học Cột Lux Cellulose-1 nhồi pha tĩnh dẫn xuất tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) liên kết với cellulose nhóm C=O, lựa chọn để tách dẫn chất cis-N-alkyl-phthalazinon với lý sau: khung cellulose dạng chuỗi dài, tạo thành đường khoảng trống để thực trình hấp phụ phản hấp phụ, nhóm carbamat tương tác với đối quang liên kết hydro nhóm N−H C=O, liên kết π-π hình thành khung phenyl pha tĩnh vòng benzyl chất phân tích Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng cột việc phân tách đồng phân quang học, pha động thường sử dụng n-hexan: isopropanol (90:10) dựa vào điều kiện sắc ký thích hợp dùng để xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất cis-N-alkyl hexahydro phthalazinon công bố(1), số điều kiện sắc ký khảo sát dẫn chất cis-N-heptyl cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinonnhư tỉ lệ dung mơi pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện, nồng độ mẫu đo, thêm base hữu vào pha động Điều kiện sắc ký thích hợp với mẫu phân tích cis-N-alkyl tetrahydro phthalazinon phải đáp ứng yêu cầu sau: hai pic đồng phân phải tách hoàn toàn với độ phân giải Rs> 1,5; hệ số kéo đuôi (As) nằm khoảng 0,8 đến 1,5; thời gian phân tích ngắn - Thể tích tiêm mẫu: μl Điều kiện sắc ký ban đầu(1): - Pha động: n-hexan chứa triethylamin 0,2%: isopropanol chứa triethylamin 0,2% (90:10) 130 Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn ICH ban hành tháng 11 năm 2005 (3), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ xác, khoảng tuyến tính, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Xác định độ tinh khiết quang học Phương pháp sau thẩm định ứng dụng để xác định lượng đối quang tinh khiết sản phẩm tổng hợp theo phần trăm diện tích pic đo sắc ký đồ (độ tinh khiết quang học theo sắc ký) biểu diễn theo độ tinh khiết quang học đối quang (ee) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện phân tích Với điều kiện sắc ký trên, kết phân tích đạt yêu cầu độ phân giải Rs hệ số kéo As Tuy nhiên, thời gian phân tích tương đối dài nên tiến hành khảo sát tốc độ dòng.Với dẫn chất N1, tăng tốc độ dòng từ 0,8 ml/phút đến 1,5 ml/phút độ phân giải giảm khơng đáng kể, thời gian lưu tR giảm gần gấp đôi Hơn nữa, hệ số kéo đuôi không đổi độ phân giải 2,0 đáp ứng yêu cầu phân tích nên tốc độ dòng 1,5 ml/phút lựa chọn Khi tăng tốc độ dòng lên ml/phút độ phân giải giảm hẳn Với dẫn chất N2, tăng tốc độ dòng từ 0,8 ml/phút lên ml/phút làm giảm đáng kể thời gian lưu (2,61 lần), hệ số kéo đuôi không đổi độ phân giải đáp ứng yêu cầu phân tích, tăng tốc độ dòng cao thìáp suất hệ thống q cao khơng phù hợp phân tích Vậy tốc độ dòng lựa chọn cho phân tích hợp chất N1 1,5 ml/phút hợp chất N2 ml/phút, kết trình bày bảng Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Như vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để phân tách đồng phân quang học dẫn chất cisN-alkyl tetrahydro phthalazinon là: - Pha động: n-hexan chứa triethylamin 0,2%: isopropanol chứa triethylamin 0,2% (90:10) - Cột sắc ký: Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm, μm), nhiệt độ cột 30oC - Bước sóng phát 317 nm Nghiên cứu Y học đồng phân quang học chất phân tích đạt tính phù hợp hệ thống Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu thử hỗn hợp racemic chất phân tích N1 N2 theo điều kiện sắc ký chọn (−)N1 100 g/ml (+)N1 100 g/ml (−)N2 100 g/ml - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút với hợp chất N1 ml/phút với hợp chất N2 - Thể tích tiêm mẫu: μl - Dung dịch đo: nồng độ 100 μg/ml nhexan: isopropanol (90:10) Bảng 1: Khảo sát tốc độ dòng Tốc độ dòng 1,5 ml/phút ml/phút Thơng số sắc ký tR (phút) AS RS tR (phút) AS Pic (pic phụ) 5,211 1,3 3,823 1,2 2,0 (−)N1 Pic (pic 6,342 1,2 4,768 1,2 chính) Pic (pic 5,636 1,2 3,943 1,2 chính) (+)N1 2,0 Pic (pic phụ) 6,550 1,2 4,564 1,2 Pic (pic phụ) 9,879 1,2 7,359 1,3 4,9 (−)N2 Pic (pic 13,867 1,3 10,377 1,2 chính) Pic (pic 10,003 1,2 7,450 1,2 chính) (+)N2 4,9 Pic (pic phụ) 14,071 1,3 10,424 1,2 RS 1,8 1,7 4,5 4,5 Thẩm định phương pháp (+)N2 100 g/ml Khảo sát tính phù hợp hệ thống Mỗi đối quang chuẩn bị mẫu thử nồng độ 100 μg/ml Tiêm lặp lại mẫu lần Bảng 2: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống (n=6) Thông số Chất (−)N1 (+)N1 (−)N2 (+)N2 RSD% tR RSD% S RS AS 0,11 0,19 0,01 0,45 0,06 0,11 0,06 0,07 2,0 2,0 4,5 4,5 1,3 1,2 1,2 1,2 Hệ số kéo đuôi nằm khoảng 0,8-1,5 Độ phân giải đối quang lớn 1,5 RSD thông số sắc ký cho lần tiêm lặp lại (thời gian lưu tR diện tích pic S) tất mẫu nhỏ 2% Vậy quy trình phân tách Chuyên Đề Dược Học Hình 1: Sắc ký đồ hợp chất N1 N2 Kết cho thấy mẫu trắng không xuất pic thời gian lưu pic phụ; mẫu thử nồng độ 100 μg/ml khơng xuất pic tạp trùng với pic phụ, phổ UV thời gian lưu pic giống bước sóng hấp thụ cực đại pic 317 nm, pic có độ tinh khiết 99%; hỗn hợp racemic chất phân tích N1 N2 xuất pic gần có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu đối quang, diện tích pic chiều cao pic tương ứng với 131 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 đối quang tăng lên thêm lượng (−)N1 (+)N1 vào hỗn hợp racemic N1 Đối với racemic N2 cho kết tương tự Do đó, khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu Sắc ký đồ hợp chất N1 N2 minh họa hình Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Pha lỗng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu nhỏ phát để xác định LOD pha lỗng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu đáp ứng độ xác để xác định LOQ Đo tín hiệu thu từ mẫu trắng (N) mẫu thử (S) Thiết lập tỉ số S/N Nồng độ mẫu thử điểm có S/N = 3/1 LOD S/N = 10/1 LOQ Kết thu sau: LOD N1 N2 0,05μg/ml 0,025 μg/ml; LOQ N1 N2 μg/ml Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính xác định khoảng nồng độ từ 80-120% nồng độ đo nhằm xác định lượng đối quang tinh khiết từ giới hạn định lượng (LOQ) đến 10% nồng độ đo nhằm xác định lượng tạp đồng phân Mỗi khoảng tuyến tính pha dung dịch có nồng độ khác Mỗi dung dịch tiến hành sắc ký lần, kết trình bày bảng Bảng 3: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Chất (−)N1 (+)N1 (−)N2 (+)N2 R 0,9997 0,9995 0,9996 0,9999 80-120 % nồng độ đo Phương trình hồi quy yâ= 33031x - 1307537 yâ=21230x-259843 yâ =14163x – 114550 yâ = 21147x – 858340 R 0,9998 0,9996 0,9997 0,9998 LOQ – 10% nồng độ đo Phương trình hồi quy yâ = 18683x yâ = 17443x yâ = 13223x yâ = 12733x Độ xác Độ lặp lại: chất chuẩn bị mẫu thử nồng độ LOQ nồng độ đo tương ứng với chất, tiến hành sắc ký mẫu lần ngày Độ xác trung gian: chuẩn bị mẫu thử giống độ lặp lại tiến hành vòng ngày khác Kết trình bày bảng Xác định độ tinh khiết quang học Bảng 4: Kết khảo sát độ xác theo diện tích pic (n=6) Với chất phân tích tiến hành xác định lô sản phẩm tổng hợp Mỗi lô đo mẫu thử Pha mẫu nồng độ đo 100 μg/ml Mỗi mẫu sắc ký lần với điều kiện sắc ký chọn Chất (−)N1 (+)N1 (−)N2 (+)N2 Nồng độ đo LOQ Độ xác Độ xác Độ lặp lại Độ lặp lại trung gian trung gian (RSD%) (RSD%) (RSD%) (RSD%) 0,63 0,64 1,91 1,84 0,71 0,89 1,22 1,52 1,29 1,26 1,32 1,63 1,08 0,86 1,13 1,44 Nhận xét: Kết thống kê cho thấy quy trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao vàđộ xác RSD < 2% Do đó, áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất cis-N-alkyl tetrahydro phthalazinon 132 Bảng 5: Độ tinh khiết quang học chất phân tích Chất (−)N1 (+)N1 (−)N2 (+)N2 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký 95,45% 95,68% 96,70% 96,71% Độ tinh khiết quang học đối quang (ee) 90,90% 91,36% 93,40% 93,42% KẾT LUẬN Dựa vào kết thực nghiệm thu được, áp dụng quy trình thiết lập để xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất quang hoạt cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon cisN-benzyl tetrahydro phthalazinon Quy trình có độ xác cao, giúp đánh giá chất lượng sản phẩm đồng phân tổng hợp, Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 góp phần xác định nguồn nguyên liệu tinh khiết đạt tiêu chuẩn TÀI LIỆU THAM KHẢO Chương Ngọc Nãi, Trần Thị Nguyên Đăng, Đặng Văn Tịnh, Nguyễn Đức Tuấn (2011), Xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất cis-N-benzyl cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối, Tạp chí dược học, 4: 32-37 Dang Van Tinh, Jin CK, Miyamoto M, Ikee Y, Masuda T, Sano S, Shiro M, Nagao Y (2006), Practical synthesis of new chiral cis-phthalazinones with potential for high phosphodiesterase inhibitory activity, Heterocycles, 68:2133-2144 Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, 1-5 Van der May M, et al (2002), Novel selective PDE4 inhibitor In vivo antiinflammatory activity of a new series of Nsubstituted cis-tetra- and cis-hexahydrophthalazinones, Journal of Medical Chemistry, 45:2520-2525 Ngày nhận báo: 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 23.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 133 ... Tuấn (2011), Xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất cis-N-benzyl cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối, Tạp chí dược học, 4: 32-37 Dang Van Tinh, Jin CK,... cao v độ xác RSD < 2% Do đó, áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết quang học dẫn chất cis-N-alkyl tetrahydro phthalazinon 132 Bảng 5: Độ tinh khiết quang học chất phân tích Chất. .. (LOQ) Xác định độ tinh khiết quang học Phương pháp sau thẩm định ứng dụng để xác định lượng đối quang tinh khiết sản phẩm tổng hợp theo phần trăm diện tích pic đo sắc ký đồ (độ tinh khiết quang học