Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài này được thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng của cao chiết cồn và cao chiết nước từ lá đại bi trên thực nghiệm gây tăng acid uric cấp và mạn. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ACID URIC MÁU CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ ĐẠI BI (BLUMEA BALSAMIFERA L (DC), ASTERACEAE) TRÊN THỰC NGHIỆM Lê Thị Minh Dung*, Nguyễn Thị Thu Hương* TĨM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh cao chiết từ Đại bi (Blumea balsamifera) có hoạt tính ức chế xanthine oxidase (XO), ức chế phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn Đề tài thực với mục tiêu khảo sát tác dụng cao chiết cồn cao chiết nước từ Đại bi thực nghiệm gây tăng acid uric cấp mạn Đối tượng-Phương pháp nghiên cứu: Cao cồn chuẩn bị cách chiết ngấm kiệt bột nguyên liệu qua hai giai đoạn cồn 48% nước Cao nước chuẩn bị cách đun nguyên liệu lần với nước nóng 100°C Nghiên cứu in vitro: khảo sát hoạt tính ức chế XO Nghiên cứu in vivo: Các cao thử cho uống liều hay uống dự phòng ngày trước gây mơ hình gây tăng acid uric cấp chuột nhắt trắng kali oxonat (tiêm phúc mô 300 mg/kg) Ở mơ hình gây tăng acid uric mạn cách tiêm cách nhật liều kali oxonat giảm dần (từ 300 mg/kg xuống 150 mg/kg), cao thử cho uống liên tục 7-14 ngày Allopurinol sử dụng làm đối chiếu dương Kết quả: Kết nghiên cứu in vitro cho thấy cao cồn cao nước có hoạt tính ức chế XO với IC50 170,7µg/ml 170,5µg/ml Ở mơ hình gây tăng acid uric cấp, cao cồn (liều 1,27g/kg 2,55g/kg) cao nước (liều 2,5g/kg 1,25g/kg) uống liều hay uống dự phòng ngày có tác dụng làm giảm hàm lượng acid uric huyết tương Ở mô hình gây tăng acid uric mạn, cao chiết cồn nước làm giảm hàm lượng acid uric huyết tương ngày 14 hiệu so với kết mơ hình gây tăng acid uric cấp Kết luận: Cao chiết từ Đại bi có hoạt tính ức chế xanthine oxidase có tác dụng hạ acid uric máu thực nghiệm gây tăng acid uric cấp mạn Kết làm sở cho nghiên cứu ứng dụng Đại bi hỗ trợ điều trị bệnh gout Từ khóa: Đại bi, ức chế xanthine oxidase, tác dụng hạ acid uric máu ABSTRACT EXPERIMENTAL STUDY ON HYPOURICEMIC EFFECT OF BLUMEA BALSAMIFERA EXTRACTS Le Thi Minh Dung, Nguyễn Thị Thu Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012: 169 - 174 Objectives: The extracts of Blumea balsamifera have been reported that they have xanthine oxidase (XO) inhibitory activity, cytotoxic activity, inflammatory and antimicrobial effects The aim of the study is to examine the effect of ethanol and aqueous extracts of Blumea balsamifera leaves on potassium oxonate-induced hyperuricemic model in mice Methods: Blumea balsamifera leaves was extracted firstly by 48% ethanol and next by water to yield ethanol Trung Tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương ĐT:38298530 Email: huongsam@hotmail.com Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 169 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 extract Aqueous extract was prepared by boiling material twice in water for hour For in vitro study, XO inhibitory activity of test extracts were examined For in vivo study, the test extracts were orally pretreated in a single dose or in repeated doses for days before potassium oxonate (300 mg/kg)-induced acute hyperuricemic model In potassium oxonate-induced chronic hyperuricemic model, potassium oxonate was injected once per twoday in gradually decreased doses (total doses from 300 mg/kg to 150 mg/kg) and the test extracts were orally treated for to 14 days Allopurinol was used as positive control Results: In vitro study showed that test extracts exhibited strong XO inhibitory activity with IC50 values of 170.7 µg/ml for ethanol extract and 170.5 µg/ml for aqueous extract In potassium oxonate-induced acute hyperuricemic model, ethanol extract (1.27 g/kg and 2.55g/kg) and aqueous extract (1.25g/kg and 2.5g/kg) significantly decreased plasma uric acid level as compared to hyperuricemic control In potassium oxonateinduced chronic hyperuricemic model, hypouricemic effects of ethanol extract and aqueous extract after treatment for to 14 days were more effective than those in acute hyperuricemic model Conclusion: The extracts of Blumea balsamifera leaves exhibited XO inhibitory activity and hypouricemic effects on potassium oxonate-induced hyperuricemic models The findings will be useful for advanced clinical study on treatment of gout and related symptoms Keywords: Blumea balsamifera leaves, xanthine oxidase inhibitory activity, hypouricemic effect nhằm góp phần làm sở cho nghiên cứu ĐẶT VẤN ĐỀ ứng dụng Đại bi hỗ trợ điều trị bệnh gout Chứng tăng acid uric máu ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU hậu bệnh gout (thống phong) ngày trở nên phổ biến xã hội Đối tượng nghiên cứu Việc nghiên cứu điều trị gout Lá Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC), họ Cúc dược liệu thiên nhiên thay cho dạng (Asteraceae), nguồn gốc Lâm Đồng, mua nhà thuốc tổng hợp ngày quan tâm có thuốc Kim Anh, Hải Thượng Lãn Ông, Quận 5, ưu tác dụng phụ Ở Việt Nam theo kinh Tp.HCM Dược liệu xay nhỏ, bảo quản nơi nghiệm dân gian, Đại bi chữa trị nhiều khô mát bệnh: cảm cúm, ho, long đàm, sổ mũi, đau răng, Động vật nghiên cứu đau ngực, đau dày, đau lưng, đau bụng sau Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 5-6 sinh, đau bụng kinh, dùng chữa vết tuần tuổi, trọng lượng trung bình thương, viêm mủ da, điều trị bệnh trĩ, chữa đau (6) 20 ± g, cung cấp Viện Vắc xin Sinh cơ, đau khớp… Lá Đại bi có tính kháng phẩm Y tế – TP Nha Trang để ổn định khuẩn, kháng nấm, giải nhiệt, hạ sốt làm tuần trước thử nghiệm Chuột giảm đau…Những nghiên cứu thực nghiệm in nuôi đầy đủ thực phẩm viên nước vitro chứng minh Đại bi có hoạt tính chống oxy uống đầy đủ Thể tích cho uống cao thử hóa, hoạt tính ức chế xanthine oxidase, hoạt tính nghiệm hay tiêm phúc mơ 10 ml/kg thể trọng kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt tính độc tế bào chuột tế bào ung thư máu, tế bào ung thư biểu mơ gan có tác dụng kháng viêm, kháng Thuốc thử nghiệm khuẩn in vivo (3, 4) Kế thừa phát triển từ kết Cao cồn chuẩn bị cách chiết nghiên cứu thực nghiệm này, đề tài ngấm kiệt bột nguyên liệu qua hai giai đoạn thực với mục tiêu khảo sát tác dụng cồn 48% nước theo tỷ lệ 1:10 (dược liệu:dung cao chiết cồn cao chiết nước từ Đại bi môi), dịch chiết cô giảm áp thu cao thực nghiệm gây tăng acid uric cấp mạn cồn với hiệu suất chiết 28% Cao nước chuẩn bị cách đun nguyên liệu lần với 170 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 nước nóng, lần 100°C theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết cô cách thủy thu cao nước với hiệu suất chiết 17,8% Các cao chiết hòa tan nước cất cho chuột nhắt trắng uống với thể tích 10 ml/kg thể trọng chuột Thuốc đối chiếu Allopurinol (Công ty Domesco, Việt Nam, số lô 010111, hạn sử dụng: 17/01/14) Xanthine (Sigma, USA); Kali oxonat (Sigma-Aldrich, USA); Kit định lượng acid uric (URIC ACID liquicolor, Human ltd.Co., Đức) Nghiên cứu Y học Tính tốn kết Các số liệu kết thử nghiệm biểu thị trị số trung bình lần đo khác Các nồng độ mẫu phản ứng tính theo cơng thức sau: Cpư = Cgốc × 600 ÷ 3000 Trong Cpư :Nồng độ mẫu phản ứng (μg/ml) Cgốc :Nồng độ mẫu pha loãng ban đầu (μg/ml) Phương pháp nghiên cứu 600: Thể tích mẫu cho vào cuvet (μl) Phương pháp nghiên cứu in vitro 3000: Tổng thể tích phản ứng (μl) Phương pháp xác định hoạt tính ức chế xanthine oxidase (3, 1) Sự thay đổi nồng độ acid uric tính theo cơng thức sau: Curic = OD290 nm ữ 12,2 ì 1000 Tin hành Chuẩn bị dịch enzym: Nghiền đồng thể gan đệm phosphat-EDTA pH 7,4 Ly tâm dịch đồng thể với tốc độ 15000 vòng/phút 15 phút x lần 4oC, hút lấy dịch làm dịch enzym cho phản ứng xúc tác Trong ∆Curic: Giá trị thay đổi nồng độ acid uric (μM) ∆OD290nm: Giá trị thay đổi mật độ quang 290 nm Quy trình thử hoạt tính ức chế xanthine oxidase theo bảng: 12,2: Hằng số hấp thu phân tử acid uric 290 nm (lit/[mmol×cm]) Bảng 1: Quy trình thực phản ứng xúc tác in vitro Khả ức chế enzym XO tính theo cơng thức sau: Hóa chất Mẫu thử Dịch enzym Kali oxonat Đệm Thể tích (µl) 600 100 400 900 ủ 15 phút Xanthine 1000 Tổng thể tích phản ứng: 3000 µl Mẫu trắng tiến hành tương tự thay enzym mẫu thử đệm Mẫu chứng có dịch enzym khơng có mẫu thử mà thay đệm Để có sở đánh giá hoạt tính ức chế mẫu thử khảo sát enzyme xanthine oxidase, sử dụng allopurinol với nồng độ 0,625; 1,25; 2,5; μg/ml làm chất đối chứng dương Đo mật độ quang bước sóng 290 nm liên tục phút 30 phút tính từ lúc cho xanthine vào cuvet Chuyên Đề Y Học Cổ Truyn I% = 100% ì (Curic/chng - Curic/th) ữ Curic/chng Trong I%: Khả ức chế enzyme XO mẫu thử ∆Curic/chứng: Giá trị thay đổi nồng độ acid uric cuvet chứng sau 30 phút (μM) ∆Curic/thử: Giá trị thay đổi nồng độ acid uric cuvet mẫu sau 30 phút (μM) Giá trị IC50 μg/ml (nồng độ có khả ức chế 50%) mẫu tính dựa đồ thị hồi quy tương quan nồng độ (Cpư) khả ức chế (I%) Phương pháp nghiên cứu in vivo Mơ hình gây tăng acid uric cấp (2, 5) Phác đồ điều trị dự phòng 171 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Chuột nhắt trắng chọn cách ngẫu nhiên để chia thành lô (mỗi lô 10 con) bao gồm: Lơ đối chiếu: Gây mơ hình tương tự lô chứng bệnh lý Chuột cho uống allopurinol 10mg/kg vào ngày ngày 14 Lơ bình thường (chứng sinh lý): uống nước cất ngày Ngày tiêm phúc mô NaCl 0, 9%, uống nước cất Lấy máu đuôi chuột thời điểm ngày 1,7, 14 để định lượng acid uric huyết tương Lô chứng bệnh lý: uống nước cất ngày Ngày tiêm phúc mô kali oxonat 300 mg/kg, sau uống nước cất Đánh giá kết Lô thử: uống cao ngày Ngày tiêm phúc mô kali oxonat 300 mg/kg, sau uống cao Lô đối chiếu: uống nước cất ngày Ngày tiêm phúc mô kali oxonat 300 mg/kg, sau uống allopurinol 10mg/kg Vào ngày thứ 5, sau tiêm kali oxonat, tiến hành lấy máu đuôi chuột để định lượng hàm lượng acid uric huyết tương theo hướng dẫn Kit ACID URIC LIQUICOLOR (Human Diagnostic Ltd Co., Germany) máy phân tích sinh hóa bán tự động Screen Master 3000 Phác đồ thử nghiệm điều trị cấp Chuột nhắt trắng chọn cách ngẫu nhiên để chia thành lô (mỗi lô 10 con) tương tự 4.2.1.1 cho chuột uống nước cất, cao thuốc liều sau tiêm phúc mô kali oxonat tiến hành lấy máu đuôi chuột sau tiêm để định lượng acid uric huyết tương Mơ hình gây tăng acid uric mạn (2, 5) Chuột chia thành lô (mỗi lô 10 con), bao gồm: Lơ bình thường (chứng sinh lý): uống nước cất 7-14 ngày Lô chứng bệnh lý: tiêm phúc mô kali oxonat cách ngày, liều 300 mg/kg (ngày 1), giảm dần xuống 250 mg/kg (ngày 3), 200 mg/kg (ngày 5) trì liều 150 mg/kg (ngày 7, 9, 11, 13) Chuột cho uống nước cất hàng ngày 7-14 ngày Lô thử: Gây mơ hình tương tự lơ chứng bệnh lý Chuột cho uống cao thử hàng ngày 7-14 ngày 172 Các số liệu biểu thị trị số trung bình: M ± SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn giá trị trung bình) xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA Student-Newman-Keuls test (phần mềm Jandel Scientific SigmaStat) Kết thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% P < 0,05 so với lô chứng KẾT QUẢ-BÀN LUẬN Kết nghiên cứu in vitro Bảng 2: Kết khảo sát khả ức chế enzym xanthine oxidase in vitro Hoạt tính ức chế XO (I%) Nồng độ mẫu (µg/ml) 12,5 25 50 Cao nước 0,00 3,87 16,82 14,95 Cao cồn 6,47 11,21 18,53 100 200 33,60 31,47 54,91 56,90 Hoạt tính enzyme xanthine oxidase (XO) định nghĩa khả chuyển hóa chất xanthine sinh acid uric đơn vị thời gian (phút) Bằng phương pháp đo tốc độ sinh acid uric cho lượng chất xanthine vào dịch chiết enzym từ gan điều kiện thích hợp xác định hoạt tính XO Chất có khả ức chế hoạt tính XO làm giảm tốc độ sinh acid uric Thuốc đối chiếu allopurinol có khả ức chế XO nồng độ thấp cho kết IC50 = 0, 1225 μg/ml Hoạt tính ức chế XO in vitro cao cồn cao nước yếu so với allopurinol với IC50 170,7 μg/ml 170,5 μg/ml Kết tác dụng hạ acid uric máu cao chiết mơ hình gây tăng acid uric cấp chuột nhắt trắng Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Bảng 3: Hàm lượng acid uric máu lô thử nghiệm mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat chuột nhắt trắng Lơ (N=10) Chứng bình thường Chứng bệnh lý Cao cồn Cao nước Allopurinol Điều trị cấp Liều TN Hàm lượng Điều trị dự phòng Hàm lượng acid acid uric (g/kg) uric (g/dl) (g/dl) - 1,29 ± 0,03 2,19 ± 0,11# 2,552 1,85 ± 0,07* 1,276 1,89 ± 0,05* 2,5 1,69 ± 0,09* 1,25 1,90 ± 0,10* 10 1,02 ± 0,05** mg/kg 1,38 ± 0,05 2,43 ± 0,09# 1,85 ± 0,07* 1,89 ± 0,05* 1,85 ± 0,07* 1,75 ± 0,08* 0,95 ± 0,07** #P 0,001: So với lơ bình thường; *P 0,01: So với lơ chứng bệnh lý; **P