Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng phương pháp điện di mao quản CE. Nghiên cứu được thực hiện trên 5 mẫu Bán chi liên thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ Chí Minh.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG DƯỢC LIỆU BÁN CHI LIÊN (SCUTELLARIA BARBATA D.DON) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE) Ngô Thị Thanh Diệp*, Nguyễn Thị Huyền Thương* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng apigenin dược liệu Bán chi liên phương pháp điện di mao quản CE Đối tượng phương pháp: Đối tượng nghiên cứu apigenin có dược liệu Bán chi liên Nghiên cứu thực mẫu Bán chi liên thu mua Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc Thành phố Hồ Chí Minh Tiến hành khảo sát thơng số cho quy trình định lượng Từ đó, xây dựng thẩm định quy trình định lượng apigenin áp dụng quy trình để xác định hàm lượng apigenin mẫu thu thập Kết quả: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng apigenin phương pháp điện di mao quản với thông số: Bước sóng phát hiện268 nm, Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện 15 kV, thời gian tiêm mẫu s, nhiệt độ cột mao quản 25 0C, thời gian điện di 15 phút Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống với RSD mẫu chuẩn mẫu thử sau lần tiêm mẫu 3,11% 2,96%, khoảng tuyến tính apigenin nồng độ 20 – 150 μg/ml (R2 = 0,9995), độ lặp lại phương pháp với RSD = 3,71%, độ với tỷ lệ phục hồi cao Sử dụng quy trình xây dựng xác định hàm lượng apigenin mẫu dược liệu thu mua Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc Thành phố Hồ Chí Minh thu kết 1,82 mg/g, 0,60 mg/g, 2,74 mg/g, 3,07 mg/g, 2,85 mg/g Kết luận Hàm lượng apigenin mẫu Bán chi liên cao khoảng từ 1,80 – 3,10 mg/g, đặc biệt thấp mẫu Nghệ An (chỉ khoảng 0,60 mg/g) Từ khóa: Bán chi liên, apigenin, điện di mao quản ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF APIGENIN IN THE HERBAL BAN CHI LIEN (SCUTELLARIA BARBATA D DON) BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS Ngo Thi Thanh Diep, Nguyen Thi Huyen Thuong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 144 - 149 Objective: Quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis method Materials and methods: Object in the study is apigenin in the herbal Ban chi lien The study was made on Ban chi lien samples purchased in Hanoi city, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak province and Ho Chi Minh city Since then, development and evaluation of quantitative procedure apigenin is conducted by capillary electrophoresis methods Using established and evaluated method for determination quantitative of apigenin in collected Ban chi lien samples Results: Developed and evaluated the quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis methods with parameters: wavelength detection 268 nm, buffer solution alkaline borate pH = 8.8, buffer concentration 40 mM, voltage 15 kV, sample injection time s, capillary column temperature 25 0C, developed time 15 minutes Quantitative procedure has specificity,compatibility of CE system with RSD of the standard * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS.Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 01226671588 144 Email: thanhdiep73@yahoo.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học sample and samples are respectively 3.110% and 2.957%, linearity of apigenin is 20 –150 μg/ml (R2 = 0.9995), repeatability of the parameters of the method with RSD = 3.71%, the recovery rate was good Applying the developed procedure to determine apigenin in samples purchased at Hanoi City, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak province and Ho Chi Minh City, obtained results are respectively 1.82 mg/g, 0.60 mg/g, 2.74 mg/g, 3.07 mg/g, 2.85 mg/g Conclusion: Apigenin concentrations in the samples Ban chi lien are quite high in range from 1.80 to 3.10 mg/g, but the one in Nghe An province is specially low (only about 0.60 mg/g) Keywords: Scutellaria barbata D Don, apigenin, capillary electrophoresis ĐẶT VẤN ĐỀ: Bán chi liên Scutellaria barbata D Don loại thân thảo thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) Cây thuốc có mặt nhiều thuốc dân gian với tác dụng nhiệt giải độc, lợi tiểu tiêu sưng, giảm đau chống khối u tân sinh Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy có mặt flavon apigenin – flavon có tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống ơxy hố cao dược liệu Bán chi liên với hàm lượng đáng kể Ở nước ta, Bán chi liên nhân dân sử dụng nhiều nguồn dược liệu chủ yếu nhập từ Trung Quốc, chưa có tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng cho dược liệu.Vì vậy, mục tiêu đề tài xây dựng quy trình định lượng apigenin dược liệu Bán chi liên để góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm sốt chất lượng dược liệu Phương pháp điện di mao quản lựa chọn có tính chọn lọc cao cho phép xác định xác hàm lượng apigenin dược liệu ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng mẫu dược liệu Bán chi liên thu mua địa phương: Hà nội (BCL1), Nghệ An (BCL 2), Đắc lắc (BCL 3),Bình định (BCL 4), Tp.HCM (BCL 5) Mất khối lượng làm khô (h) mẫu dược liệu xác định 12,45%; 12,14%; 12,02%; 12,25%; 12,77% Hóa chất, dung môi Chất đối chiếu: Apigenin độ tinh khiết 95% BM Dược liệu, khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM cung cấp Chuyên Đề Dược Học Ethanol, ethyl acetat(TQ), methanol, natri hydroxyd, kali clorid, acid boric (Merck) Thiết bị Máy điện di mao quản, đầu dò UV Aligent CE 7100 (Đức), bể siêu âm Elma (Đức), cân phân tích Satorius TE 412, cân xác định độ ẩm Satorius MA 45 Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành khảo sát điều kiện để tiến hành điện di mao quảnnhư pH nồng độ dung dịch đệm, điện tiến hành điện di, thời gian tiêm mẫu, nhiệt độ cột mao quản, thời gian điện di để tìm điều kiện thích hợp Xây dựng quy trình định lượng apigenin dược liệu: Chất đối chiếu: Cân xác 10 mg apigenin chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan điền đến vạch MeOH, thu dung dịch chuẩn C0 có nồng độ 200 µg/ml Từ dung dịch chuẩn C0pha thành dung dịch chuẩn có nồng độ 100 µg/ml Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác g dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm xác 100 ml dung mơi ethanol 50% cân xác bình nón đến 0,01 g Đun hồi lưu nhiệt độ 80 – 90 0C trong60 phút Để nguội cân, điều chỉnh khối lượng erlen đến khối lượng ban đầu dung môi Lắc lọc nhanh qua giấy lọc khô Bỏ 10 ml dịch lọc đầu, thu dung dịch T Lấy xác 50 ml dung dịch T, đến cắn Hòa cắn vào 20 ml nước, siêu âm 10 phút, cho 145 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học vào bình lắng gạn lắc với 60 ml EtOAc (chia làm lần, lần 20 ml) Gộp dịch EtOAc, bốc đến cắn khơ Hòa tan cắn vào MeOH, cho vào bình định mức 10 ml, điền đầy đến vạch MeOH, siêu âm phút Lọc qua màng lọc 0,45 µm cho vào lọ đựng mẫu, siêu âm phút trước cho vào máy chiều dài hiệu lực 56 cm, đường kính 50 µm (Aligent) Phát apigenin bước sóng 268 nm Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8 Nồng độ đệm 40 mM Điện 15 kV Thời gian tiêm mẫu s Điều kiện điện di: Nhiệt độ cột mao quản 25 0C Máy điện di mao quản đầu dò UV Aligent CE 7100 Thời gian điện di 15 phút Mao quản silicagel nung chảy 64,5 cm có Hàm lượng apigenin (mg/g) dược liệu khơ tính theo cơng thức: X= Cc × CorrA t ×10 ×100 ×100 CorrA c × 50 ×10 × (100 − h) = × Cc × CorrA t CorrA c × m × (100 − h) Trong đó: CorrAc CorAt diện tích đỉnh chuẩn hóa mẫu chuẩn mẫu thử; Cc nồng độ mẫu chuẩn (μg/ml) m khối lượng dược liệu (g), h khối lượng làm khơ dược liệu (%) Quy trình định lượng sau xây dựng thẩm định theo ICH tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại độ Áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để xác định hàm lượng apigenin mẫu Bán chi liên thu thập đươc KẾT QUẢ Bước sóng phát hiện: Phổ UV thời gian di chuyển pic apigenin mẫu đối chiếu có bước sóng hấp thụ cực đại 268 nm Do đó, lựa chọn 268 nm bước sóng phát (hình 1,2) DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 05-29-22\010-0101.D) mAU Apigenin 9.858 chuan 2.5 1.5 0.5 0 10 12 14 Hình 1: Điện di đồ mẫu đối chiếu apigenin 146 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học *DAD1, 9.785 (3.0 mAU, - ) Ref=0.005 & 14.998 of 010-0101.D mAU 4.5 3.5 2.5 220 240 260 280 300 320 340 360 nm 380 Hình 2: Phổ UV thời gian di chuyển pic apigenin mẫu đối chiếu điều kiện thích hợp là: pH dung dịch đệm: Lần lượt thay đổi điều kiện 8,8; Nồng độ dung dịch đệm: 40 mmol; Điện điện di (các điều kiện khác cố định) 15 kV; Thời gian tiêm mẫu s; Nhiệt độ cột mao pH dung dịch đệm, nồng độ dung dịch đệm, quản 25 0C; Thời gian điện di 15 phút điện thế, thời gian tiêm mẫu để xác định điều kiện thích hợp cho quy trình Kết cho thấy DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 06-26-49\010-0101.D) mAU Apigenin 9.788 3.5 2.5 1.5 0.5 0 10 12 14 Hình 3: Điện di đồ mẫu thử thu mua Tp.HCM với điều kiện thiết lập có tăng diện tích pic.Mặt khác điện di đồ mẫu Quy trình định lượng với điều kiện điện trắng khơng có pic khác trùng với pic di xác định thẩm định apigenin điện di đồ mẫu chuẩn.Từ cho thơng số sau: thấy quy trình có tính đặc hiệu Tính tương thích hệ thống: Sau bơm lần mẫu đối chiếu, mẫu thử qua hệ thống, RSD thời gian di chuyển thu 0,70% 0,79%, RSD diện tích pic 3,11% 2,96% Tính đặc hiệu: Ở điện di đồ mẫu thử mẫu chuẩn có pic apigenin với thời gian di chuyển Điện di đồ mẫu thử thêm chuẩn thời gian di chuyển apigenin Chuyên Đề Dược Học Khoảng tuyến tính: Từ dung dịch chuẩn C0pha dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 20 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml MeOH Tiến hành điện di dung dịch chuẩn điều kiện khảo sát, thu diện tích pic apigenin tương ứng với nồng độ Xử lý liệu Excel 2007 cho thấy có tương quan tuyến tính nồng độ 147 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 diện tích đỉnh chuẩn hóa dung dịch chuẩn theo phương trình y = 0,0119x+0,0023 Sử dụng trắc nghiệm t cho thấy hệ số 0,0023 khơng có ý nghĩa thống kê, phương trình hồi quy rút gọn y = 0,0119x; R2 = 0,9995 khoảng nồng độ apigenin từ 20 – 150 µg/ml khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng apigenin mẫu thử.Kết độ phục hồi thu mức chuẩn thêm vào khoảng 93,39 – 96,06% cho thấy quy trình có độ phù hợp Sử dụng quy trình thẩm định để xác định hàm lượng apigenin mẫu Bán chi liên thu mua được, kết thu thể bảng cho thấy hàm lượng apigenin mẫu BCL1, BCL3, BCL4, BCL5 cao (khoảng 1,80 – 3,10 mg/g) Mẫu BCL2 (thu mua Nghệ An) có hàm lượng apigenin thấp so với mẫu BCL lại, khoảng 0,60 mg/g Bảng 2: Kết xác định hàm lượng apigenin mẫu BCL Mẫu Hình 4:Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ diện tích đỉnh chuẩn hóa dung dịch mẫu chuẩn Độ lặp lại: Tiến hành xác định hàm lượng apigenin mẫu thử riêng biệt mẫu dược liệu Bán chi liên thu mua TP.HCM (BCL5) có khối lượng làm khô h=12,77% Mẫu chuẩn tiến hành song song có nồng độ thực tế Cc = 95 µg/ml với CorrAc = 1,1525 Kết thu thể bảng cho thấy quy trình có độ lặp lại tốt với RSD < 5% BCL2 BCL3 BCL4 BCL5 Bảng 1: Kết khảo sát độ lặp lại Stt Khối lượng Diện tích Hàm Kết xử lý dược liệu đỉnh lượng thống kê (g) chuẩn hóa Apigenin CorrA (mg/g) 1,0005 1,3744 2,5962 n=6 1,0003 1,4579 2,7545 = 2,7696 1,0004 1,4814 2,7986 1,0005 1,4826 2,8006 SD = 0,1028 1,0004 1,5419 2,9129 RSD = 1,0002 1,4579 2,7548 3,71% Độ đúng: Được khảo sát mẫu BCL5 dùng khảo sát độ lặp lại Thêm vào mẫu lượng chất đối chiếu apigenin tương ứng với 148 BCL1 Khối lượng Diện tích Hàm lượng apigenin dược liệu đỉnh (g) chuẩn hóa, thu (mg/g) CorrA 1,0005 0,8679 1,8444 0,9997 0,8918 1,9018 1,0004 0,8058 1,7126 1,0004 0,2560 0,5422 1,0005 0,3223 0,6826 1,0000 0,2686 0,5691 1,0005 1,3427 2,8394 1,0002 1,2538 2,6522 0.9998 1,2893 2,7284 1,0003 1,4938 3,1679 0,9996 1,3967 2,9640 1,0000 1,4505 3,0770 1.0002 1,3769 2,9377 1,0004 1,2893 2,7502 1,0005 1,3379 2,8536 Hàm lượng trung bình (mg/g) 1,8179 ± 0,0949 0,5979 ± 0,0745 2,7400 ± 0,0941 3,0696 ± 0,1021 2,8472 ± 0,0938 KẾT LUẬN Sau thời gian tiến hành đề tài thu số kết sau: Xây dựng quy trình định lượng apigenin dược liệu Bán chi liên phương pháp điện di mao quản CE Thẩm định quy trình xây dựng Áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để xác định hàm lượng apigenin số mẫu Bán chi liên thu mua Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học TÀI LIỆU THAM KHẢO: ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, Q2 (R1), pp 13 Marchart E, Krenn L, Kopp B (2003), Quantification of the flavonoids in Passiflora incarnata by capillary electrophoresis, J Planta Med, Vol 69 (5), pp 452-456 Võ Thị Bạch Huệ, Vĩnh Định (2008), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 77 - 103 Chuyên Đề Dược Học Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 149 ... dược liệu Bán chi liên phương pháp điện di mao quản CE Thẩm định quy trình xây dựng Áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để xác định hàm lượng apigenin số mẫu Bán chi liên thu mua Chuyên Đề Dược. .. chất lượng cho dược liệu. Vì vậy, mục tiêu đề tài xây dựng quy trình định lượng apigenin dược liệu Bán chi liên để góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm soát chất lượng dược liệu Phương pháp điện di mao quản. .. nhiệt độ cột mao quản, thời gian điện di để tìm điều kiện thích hợp Xây dựng quy trình định lượng apigenin dược liệu: Chất đối chi u: Cân xác 10 mg apigenin chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml,