Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích nghiên cứu của bài viết nhằm thử nghiệm nhuộm aniline blue (AB) đánh giá mức độ cô đặc nhiễm sắc thể (NST) tinh trùng. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐÁNH GIÁ BẤT THƢỜNG CƠ ĐẶC NHIỄM SẮC THỂ TINH TRÙNG BẰNG NHUỘM ANILINE BLUE Nguyễn Thanh Hoa*; Phan Nữ Thục Hiền* TÓM TẮT Mục tiêu: thử nghiệm nhuộm aniline blue (AB) đánh giá mức độ cô đặc nhiễm sắc thể (NST) tinh trùng Đối tượng phương pháp: 40 mẫu tinh dịch chất lượng bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010) Tiến hành nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST Xem xét mối liên quan mức độ cô đặc NST tinh trùng hình thái tinh trùng Kết quả: nhuộm AB cho hình ảnh tinh trùng bất thường đặc NST có đầu bắt màu thuốc nhuộm, tinh trùng bình thường đặc NST khơng bắt màu thuốc nhuộm Khơng có mối liên quan bất thường hình thái bất thường đặc NST tinh trùng Kết luận: sử dụng nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST tinh trùng xét nghiệm độc lập không liên quan đến hình thái tinh trùng * Từ khóa: Cơ đặc nhiễm sắc thể tinh trùng; Nhuộm aniline blue; Hình thái tinh trùng Assessment of Mature Sperm by Aniline Blue Stain Summary Objectives: Aniline blue stain test evaluated sperm chromatin condensation or sperm nucleus maturity Subjects and methods: 40 semen samples with normal quality semen according to WHO 2010 standard Using AB stain to evaluate chromatin condensation sperm Assess the relationship between abnormal chromatin condensation and abnormal sperm morphology Results: Abnormal chromatin condensation sperms (immature chromatin sperms) had blue-stained nucleus, normal chromatin condensation (mature sperm) had unstained nucleus There is no correlation between sperm morphology and sperm maturity Conclusion: AB stain can be used to assess sperm chromatin condensation as an independent test that does not involve sperm morphology * Keywords: Sperm chromatin condensation; Aniline blue stain; Morphology sperm ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh nam chiếm nửa nguyên nhân gây vơ sinh nói chung Tinh dịch đồ xét nghiệm định để chẩn đoán nguyên nhân vô sinh nam không đánh giá hết khả sinh sản nam giới Trong trình sinh tinh, đóng gói hay đặc NST tinh trùng nhằm bảo vệ vật chất di truyền, đảm bảo chức sinh sản tinh trùng Quá trình gồm có thay đổi histone ADN biến thể histone, sau protein chuyển tiếp cuối protamine [1] Nhiều nghiên cứu bất thường ADN tinh trùng gặp nhiều nam giới vô sinh liên quan đến sảy thai tự phát thất bại hỗ trợ sinh sản * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Hoa (thanhhoa.mophoi@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 26/08/2017 Ngày báo đăng: 30/08/2017 87 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Các phương pháp đánh giá bất thường ADN SCSA (Sperm chromatin structure assay), TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labling), phương pháp phân tích chổi (Comet assay) hay dấu ấn sinh học trang thiết bị phức tạp, chi phí cao, khó áp dụng rộng r i điều kiện Việt Nam Trong đó, nhuộm AB phương pháp đánh giá mức độ hồn thiện khâu đóng gói ADN tinh trùng, dễ thực hiện, giá thành rẻ Nguyên lý phương pháp dựa việc AB phản ứng với lysine nên phân biệt khác biệt thành phần protein nhân tinh trùng Nhân tinh trùng chưa trưởng thành hay bất thường cô đặc NST giàu histon chứa hàm lượng lysine phong phú nên bắt màu thuốc nhuộm xanh da trời Ngược lại, nhân tinh trùng trưởng thành giàu protaime có hàm lượng lysine thấp không bắt màu AB Trên giới, nghiên cứu nhiều tranh cãi tương quan tỷ lệ tinh trùng bất thường ngưng tụ NST thông số khác tinh dịch đồ [2, 3] Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu ứng dụng phương pháp Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Thử nghiệm nhuộm AB bước đầu đánh giá mối liên quan bất thường cô đặc NST tinh trùng nhuộm AB hình thái tinh trùng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 40 mẫu tinh dịch có chất lượng bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010) 88 Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang * Kỹ thuật: - Lấy mẫu: mẫu tinh dịch bệnh nhân (BN) tự lấy phương pháp thủ dâm, đựng cốc chuyên dụng không độc với tinh trùng Sau lấy, để tủ ấm 37°C đợi tinh dịch ly giải hoàn toàn - Đánh giá chất lượng tinh dịch trước nhuộm Lựa chọn mẫu chất lượng bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010) - Đánh giá bất thường hình thái theo đặc điểm: nhuộm lam hình thái theo quy trình thường quy Đánh giá hình thái 200 tinh trùng vật kính dầu độ phóng đại x 1.000 lần Tính tỷ lệ % loại bất thường, gồm bất thường đầu, bất thường cổ, bất thường đuôi bất thường chung - Đánh giá bất thường cô đặc NST tinh trùng AB: nhỏ 10 μl mẫu tinh dịch lên lam kính, dùng lam khác kéo làm lam đàn; để khơ nhiệt độ phòng; cố định nhỏ PFA 4% 30 phút; rửa PBS 0,1 M x lần Nhỏ 10 μl AB 5% dung dịch axít acetic 4% (pH 3.5) phủ kín lam đàn Để vòng phút; rửa PBS 0,1 M x lần; để khơ nhiệt độ phòng - Đánh giá bất thường cô đặc NST tinh trùng kính hiển vi quang học, đếm 200 tinh trùng sử dụng vật kính dầu độ phóng đại x 1.000 lần: + Tinh trùng chưa trưởng thành có phần đầu bắt màu xanh đậm AB TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 + Tinh trùng bán trưởng thành có phần đầu bắt màu thuốc nhuộm chiếm < 50% diện tích đầu + Tinh trùng trưởng thành đầu không bắt màu Bảng 1: Đặc điểm chung vi thể tinh dịch đồ nghiên cứu Đặc điểm * Chỉ tiêu nghiên cứu: Mật độ (triệu/ml) - Tỷ lệ tinh trùng bất thường đầu Di động Giá trị Giá trị lớn nhỏ nhất Trung bình ( X ± SD) 210 20 72,18 ± 36,42 - Tỷ lệ tinh trùng bất thường cổ PR (%) 84 38 58,68 ± 10,70 - Tỷ lệ tinh trùng bất thường đuôi PR + NP (%) 85 42 66,90 ± 10,39 18 10,30 ± 4,21 - Tỷ lệ tinh trùng bất thường chung - Tỷ lệ tinh trùng bất thường đặc NST = Hình thái bình thường (%) Nhóm nghiên cứu có chất lượng vi thể tinh dịch đồ giới hạn bình thường Bảng 2: Đặc điểm hình thái bất thường * Thời gian địa điểm nghiên cứu: từ tháng 10 - 2016 đến - 2017 Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản Công nghệ Mô ghép, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội * Phân tích xử lý số liệu: - Xử lý số liệu phần mềm SPSS 16.0 - Kiểm tra mối tương quan hàm Scatter Xét mối tương quan: |R| < 0,3: khơng có mối tương quan; 0,3 < |R| < 0,5: mối tương quan lỏng lẻo; 0,5 < |R| < 0,7: mối tương quan trung bình; |R| > 0,7: mối tương quan chặt chẽ Đặc điểm bất thƣờng (%) Giá trị Giá trị ớn nhỏ nhất Bất thường đầu 91 77 83,88 ± 4,13 Bất thường cổ 49 12 30,28 ± 8,61 Bất thường đuôi 21 6,75 ± 3,97 Bất thường chung 96 82 89,25 ± 4,05 Trong dạng bất thường, bất thường đầu gặp tỷ lệ nhiều nhất, tiếp đến bất thường cổ, bất thường gặp Bảng 3: Đặc điểm bất thường cô đặc NST sau nhuộm AB * Đạo đức nghiên cứu: - Nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe BN Đặc điểm cô đặc NST (%) - Mẫu sau nghiên cứu hủy bỏ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm mẫu nghiên cứu nhuộm AB Nghiên cứu sử dụng 40 mẫu tinh dịch bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010) Trung nh ( X ± SD) Giá trị ớn Giá trị Trung nh nhỏ ( X ± SD) Tinh trùng bất thường 29 16,25 ± 5,83 Chưa trưởng thành 20 8,20 ± 4,84 Bán trưởng thành 15 8,05 ± 2,98 Tinh trùng bình thường 96 71 83,75 ± 5,83 Dưới số hình ảnh nhuộm mức độ trưởng thành tinh trùng AB 89 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 1: Mức độ trưởng thành tinh trùng (nhuộm AB; x400) (1 Tinh trùng trưởng thành; Tinh trùng bán trưởng thành; Tinh trùng chưa trưởng thành) Mối liên quan bất thƣờng hình thái bất thƣờng đặc NST Biểu đồ 1: Mối tương quan bất thường hình thái đầu tinh trùng bất thường cô đặc NST Có mối tương quan thuận lỏng lẻo tinh trùng bất thường đầu với bất thường cô đặc NST (R = 0,330) Biểu đồ 2: Mối tương quan tinh trùng bất thường cổ bất thường cô đặc NST Khơng có mối tương quan tinh trùng bất thường cổ với bất thường cô đặc NST (R = 0,257 < 0,3) 90 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Biểu đồ 3: Mối liên quan tinh trùng bất thường đuôi bất thường đặc NST Khơng có mối tương quan tinh trùng bất thường đuôi bất thường cô đặc NST (R = 0,03 < 0,3) Biểu đồ 4: Mối tương quan tinh trùng bất thường chung bất thường đặc NST Có mối tương quan thuận lỏng lẻo bất thường hình thái tinh trùng mức độ vi thể bất thường cô đặc NST (R = 0,430) BÀN LUẬN Phƣơng pháp đánh giá ất thƣờng cô đặc NST tinh trùng ằng nhuộm AB Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp nhuộm AB để kiểm tra bất thường cô đặc NST tinh trùng Phương pháp có ưu điểm dễ thực hiện, giá thành rẻ, nhanh chóng kỹ thuật tương đối đơn giản so với kỹ thuật đánh giá độ trưởng thành tinh trùng khác sử dụng chất đánh dấu sinh học tinh trùng trưởng thành (creatine kinase, heat shock protein HspA2 chaperone hyaluronic axít) 91 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tuy nhiên, tiêu nhuộm màu AB có nhược điểm khó quan sát tinh trùng bình thường ngưng tụ NST khơng bắt màu thuốc nhuộm Một số nghiên cứu đ thử nghiệm phối hợp AB với loại thuốc nhuộm khác rose bengal, janus green, eosin Y đưa kết luận kết hợp nhuộm AB với nhuộm eosin Y quan sát tinh trùng r ràng [4] Vì vậy, để cải tiến kỹ thuật, chúng tơi đề xuất phối hợp nhuộm AB với eosin để tiêu quan sát dễ dàng Mối tƣơng quan ất thƣờng ngƣng tụ NST h nh thái tinh trùng Theo khuyến cáo nhiều nghiên cứu, nên lấy mốc có tỷ lệ tinh trùng bắt màu thuốc nhuộm AB < 20%, coi mẫu tinh dịch có độ trưởng thành tinh trùng giới hạn bình thường [5] Tuy nhiên, để đảm bảo khơng bỏ sót mối tương quan có thơng số hình thái độ trưởng thành tinh trùng, chúng tơi khơng chia nhóm mà xét mức độ tương quan số hình thái bất thường cô đặc NST Theo kết nghiên cứu, khơng có mối tương quan bất thường độ trưởng thành tinh trùng với tỷ lệ bất thường hình thái cổ tinh trùng Sự biến đổi cổ đuôi tinh trùng song song độc lập với trình biến đổi đầu tinh trùng nên không quan sát thấy mối liên quan bất thường cổ đuôi tinh trùng với bất thường đặc NST Chúng tơi quan sát thấy có mối tương quan thuận tỷ lệ tinh trùng bất thường hình thái đầu bất thường hình thái nói chung với tỷ lệ tinh trùng bất thường cô đặc NST, nghĩa tỷ lệ bất thường hình 92 thái tăng, tỷ lệ bất thường cô đặc NST tăng Nhiều tác giả mối tương quan tỷ lệ tinh trùng chưa trưởng thành hay bất thường cô đặc NST tỷ lệ tinh trùng dị dạng nói chung dị dạng đầu nói riêng [6, 7, 8] Nguyên nhân thiếu hụt protamine liên quan tới tồn vẹn ADN Có mối liên quan chặt chẽ trình biến đổi tạo túi cực đầu q trình sinh tinh với q trình đặc NST Đồng thời, sai sót q trình ngưng tụ NST tinh trùng dẫn đến suy yếu liên kết gắn acrosome với nhân cô đặc gây khiếm khuyết acrosome Vì lý mà nhiều dị dạng đầu tinh trùng có liên quan đến bất thường ngưng tụ nhân tinh trùng Nhưng bất thường đầu tinh trùng gồm nhiều dạng bất thường khác không nhân, nhiều tinh trùng có hình thái vi thể bình thường, lại có bất thường đặc NST, mối tương quan chúng tơi tìm lỏng lẻo, hệ số tương quan với hình thái bất thường nói chung 0,430 với hình thái đầu nói riêng 0,330 Như vậy, nhận thấy ý nghĩa kết phương pháp nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST tinh trùng tương đối độc lập với hình thái tinh trùng Nhiều nghiên cứu khiếm khuyết đóng gói nhân tinh trùng có liên quan đến trường hợp sảy thai nguyên phát không rõ nguyên nhân, tỷ lệ thành công hỗ trợ sinh sản [9] Do đó, xem xét nghiệm đánh giá bất thường cô đặc NST xét nghiệm độc lập, bổ sung chẩn đoán nguyên nhân vô sinh nam, thất bại lĩnh vực sinh sản nói chung TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 KẾT LUẬN Nhuộm AB phương pháp đơn giản giúp đánh giá mức độ cô đặc NST tinh trùng Do mối tương quan bất thường cô đặc NST với dạng bất thường hình thái lỏng lẻo, hay khơng có tương quan nên sử dụng phương pháp xét nghiệm độc lập đánh giá chất lượng tinh dịch TÀI LIỆU THAM KHẢO Lewis J.D, Abbott D.W Ausio J A haploid affair: core histone transitions during spermatogenesis Biochem Cell Biol 2003, 81 (3), pp.131-140 Hammadeh M.E, Zeginiadov T, Rosenbaum P et al Predictive value of sperm chromatin condensation (aniline blue staining) in the assessment of male fertility Archives of Andrology 2001, 46 (2), pp.99-104 Hekmatdoost A, Lakpour N, Sadeghi M.R Sperm chromatin integrity: etiologies and mechanisms of abnormality, assays, clinical importance, preventing and repairing damage Avicenna J Med Biotechnol 2009, (3), pp.147-160 Park Y.S, Kim M.K, Lee S.H et al Addition of eosin to the aniline blue assay to enhance detection of immature sperm histones Fertil Steril 2011, 90 (5), pp.1999-2002 Esterhuizen A.D, Franken D.R, Lourens J.G et al Sperm chromatin parkaging as an indicator of in-vitro fertilization rates Hum Reprod 2000, 15 (3), pp.657-661 Zini A, Phillip S, Courchesne A et al Sperm head morphology is related to high deoxyribonucleic acid stainability assessed by sperm chromatin structure assay Fertil Steril 2009, 91 (6), pp.2495-2500 Boitrelle F, Ferfouri F, Petit J.M et al Large human sperm vacuoles observed in motile spermatozoa under high magnification: nuclear thumbprints linked to failure of chromatin condensation Hum Reprod 2011, 26 (7), pp.1650-1658 Sellami A et al Assessment of chromatin maturity in human spermatozoa: useful aniline blue assay for routine diagnosis of male infertility Adv Urol 2013, pp.578-631 Talebi A.R, Vahidi S, Aflatoonian A et al Cytochemical evaluation of sperm chromatin and DNA integrity in couples with unexplained recurrent spontaneous abortions Andrologia 2012, 44 (1), pp.462-470 93 ... lẻo tinh trùng bất thường đầu với bất thường cô đặc NST (R = 0,330) Biểu đồ 2: Mối tương quan tinh trùng bất thường cổ bất thường đặc NST Khơng có mối tương quan tinh trùng bất thường cổ với bất. .. 1.000 lần Tính tỷ lệ % loại bất thường, gồm bất thường đầu, bất thường cổ, bất thường đuôi bất thường chung - Đánh giá bất thường cô đặc NST tinh trùng AB: nhỏ 10 μl mẫu tinh dịch lên lam kính, dùng... tương quan tinh trùng bất thường đuôi bất thường cô đặc NST (R = 0,03 < 0,3) Biểu đồ 4: Mối tương quan tinh trùng bất thường chung bất thường cô đặc NST Có mối tương quan thuận lỏng lẻo bất thường