Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết là nuôi cấy, biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ thành tạo cốt bào trong môi trường có dexamethasone và ascorbic. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BIỆT HỐ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TUỶ XƢƠNG THỎ THÀNH DẠNG TẠO CỐT BÀO TRONG MƠI TRƢỜNG DEXAMETHASONE VÀ ASCORBIC Lê Thị Hồng Nhung*; Ngơ Duy Thìn*; Nguyễn Khang Sơn* TĨM TẮT 15 mẫu tế bào đơn nhân tủy xương thỏ nuôi cấy tăng sinh 14 ngày Sau định danh kỹ thuật hoá mô miễn dịch với marker CD44, CD90, CD34, CD14 xác định tế bào gốc trung mô (TBGTM), đưa vào mơi trường cảm ứng tạo xương có dexamethasone µM ascorbic 50 µg/ml thời gian tuần Kết quả: tất mẫu tế bào nhuộm hóa mơ có tượng tạo canxi chất (dương tính nhuộm alirazin red) Quan sát mẫu kính hiển vi điện tử quét thấy xuất tinh thể khống Mẫu tế bào nhuộm hóa mơ miễn dịch dương tính với marker osteocalcin Kết luận: đ biệt hố thành cơng TBGTM tủy xương thỏ thành tế bào dạng tạo cốt bào mơi trường có dexamethasone ascorbic * Từ khóa: Tế bào trung mơ; Tạo cốt bào; Biệt hóa; Dexamethasone; Ascorbic Diffrentiation of Bone Marrow Mensenchymal Stem Cell into Osteoblast in Dexamethasone and Ascorbic Culture Summary 15 samples rabbit bone marrow mononuclear after culture for 14 days Those were isolated by flow cytometry and immunocytochemistry staining with marker CD44, CD90, CD14, CD34 These analyses indicated that culture cells were MSCs To induce osteoblast differentiation of the MSCs, the cultures were maintained in osteogenic media supplement with µM dexamethasone, 50 µg/mL ascorbic acid for up to three weeks Results: All samples after differentiation demonstrated that therre were actual calcium deposits in matrix by alizarin red staining Under SEM appearance white crystals of MSC differentiation into osteogenic line The cells were immunocytochemistry stained positive for osteocalcin Conclusions: The bone marrow MSC tendency differentiation into osteoblast in dexamethasone and ascorbic acid * Keywords: Mesenchymal stem cell;; Osteoblast; Differentiation; Dexamethasone; Ascorbic ĐẶT VẤN ĐỀ Tạo cốt bào tế bào mơ xương có vai trò tạo xương giai đoạn phát triển thể mô xương bị tổn thương Trong thể, tế bào gốc trước trở thành tạo cốt bào (osteoblast), chúng phải trải qua giai đoạn biệt hóa để tạo thành tiền tạo cốt bào (pre-osteoblast) Ngày với cơng nghệ, giai đoạn thực điều kiện in vitro nhằm tạo dòng tế bào có khả ứng dụng lâm sàng để * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Hồng Nhung (nhunglehmu@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 26/08/2017 Ngày báo đăng: 30/08/2017 173 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 điều trị bệnh lý xương khớp, đặc biệt bệnh điều trị phương pháp thông thường [1] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Hình dạng tế bào sau biệt hóa Kỹ thuật mơi trường biệt hóa TBGTM tủy xương thành tạo cốt bào đ nhiều tác giả nghiên cứu Trong phạm vi này, xin giới thiệu kết biệt hóa TBGTM tủy xương thỏ mơi trường có dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic, chất kích thích cảm ứng tạo xương Mục tiêu nghiên cứu: Ni cấy, biệt hóa thành cơng TBGTM tủy xương thỏ thành tạo cốt bào mơi trường có dexamethasone ascorbic ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 15 mẫu tế bào trung mô tủy xương thỏ Phƣơng pháp nghiên cứu Các tế bào đơn nhân phân lập từ tủy xương thỏ sau nuôi cấy tăng sinh 14 ngày, định danh kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để khẳng định chắn chúng TBGTM Đưa vào mơi trường biệt hóa cảm ứng tạo xương để biệt hóa thành tạo cốt bào, gồm: 89% DMEM, 10% FBS, 1% kháng sinh, µM dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic, 100 mM β - glycerolphosphatase Thời gian biệt hóa tuần, thay mơi trường ngày/lần Định danh sau biệt hóa kỹ thuật alizarin để đánh giá khả lắng đọng canxi chất tế bào Đánh giá hình thành tinh thể khoáng kỹ thuật hiển vi điện tử quét Xác định marker osteocalcin tế bào sau biệt hóa phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch Mỗi phương pháp lấy ngẫu nhiên mẫu 15 mẫu đ biệt hóa 174 Hình 1: TBGTM sau biệt hóa theo hướng tạo cốt bào 14 ngày (x500) Quan sát tất mẫu chúng tơi nhận thấy có biến đổi rõ rệt hình dạng tế bào theo thời gian Càng sau, tế bào có xu hướng phình to đoạn giống hình hạt đậu Đây hình ảnh đặc trưng tế bào tạo xương Kết định danh tế bào sau biệt hóa * Định danh kỹ thuật nhuộm alizarin red: Hình 2: Tế bào sau biệt hóa 21 ngày nhuộm alizarin red (x200) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Trên tất mẫu tế bào nhuộm với alizarin red cho kết đặc hiệu: tế bào chất bắt màu đỏ cam, phức hợp thuốc nhuộm với ion canxi diện tế bào hay chất ngoại bào, chứng tỏ tế bào biệt hóa đ chuyển sang dạng tế bào tạo xương với lắng tụ canxi tế bào chất ngoại bào * Định danh kỹ thuật hóa mơ miễn dịch: Hình 3: Các tế bào sau biệt hóa 15 ngày nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker osteocalcin (x200) Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker osteocalcin cho thấy tất mẫu dương tính với osteocalcin Osteocalcin protein tổng hợp nhiều tế bào tạo xương xem marker tế bào tạo xương * Định danh quan sát hình thành tinh thể khống kính hiển vi điện từ qt: Hình 4: Tế bào gốc sau biệt hóa 30 ngày hiển vi điện tử quét (Các tinh thể muối khoáng lắng đọng bề mặt xung quanh tế bào) 175 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Sau tuần biệt hóa, tất mẫu tế bào ni cấy quan sát kính hiển vi điện tử quét, thấy xuất tinh thể khoáng rõ rệt Lắng đọng tinh thể khống mơ quanh tế bào biệt hố có xu hướng tăng dần số lượng Các tinh thể khống có dạng hình kim, hình bơng tuyết, tập hợp thành đám, lớn dần theo thời gian Nghiên cứu chúng tơi thấy, hình ảnh lắng đọng tinh thể khống khơng xuất mẫu chứng tế bào trung mô nuôi cấy mơi trường thơng thường, khơng có yếu tố gây biệt hoá tạo cốt bào Osteocalcin marker xương, đặc biệt xuất muộn tăng cao sau biệt hóa 28 ngày [3] Chúng tơi cho minh chứng rõ nét cho thấy tế bào trung mô môi trường nuôi cấy, đặc biệt đ biệt hố thành tạo cốt bào Chính tạo cốt bào đ sinh mô tiền cốt Mô tiền cốt với đặc tính đặc biệt, đ tạo lắng đọng muối khoáng (chủ yếu canxi phospho), để tạo chất xương sau hình, hình thái giống nguyên bào sợi Kết nghiên cứu phù hợp với Nadri S (2007) TBGTM sau tách chiết từ tủy xương biệt hóa thành tế bào tạo xương sau tuần với biểu hình thành nốt khống hóa bắt màu đỏ nhuộm alazarin red phân tích marker biểu xương kỹ thuật RT-PCR cho thấy biểu dương tích osteocalcin, osteopontin [2] Tsai M.T (2012) sau ni cấy biệt hóa TBGTM thành tạo cốt bào định danh marker Runx2, ALP, osteocalcin Runx2 biểu tăng ngày thứ sau biệt hóa, ALP marker biểu sớm 176 Quiroz F.G (2008) nghiên cứu biệt hóa hMSC thành tạo cốt bào mơi trường chun biệt tạo xương, đánh giá tạo xương khoáng hóa chất marker biểu tạo cốt bào thời điểm 14 20 ngày so sánh với nhóm chứng Sau ngày biệt hóa, hình thái tế bào đ thay đổi, sau ngày biệt hóa, tế bào có hình đa diện, nhóm tế bào nhóm chứng khơng có thay đổi kiểu Sau 14 ngày biệt hóa, khống hóa chất chưa r , hình thái tế bào đ thay đổi, sau 20 ngày thấy có lắng đọng canxi hình thành chất điển hình Tế bào MSC khơng ni cấy mơi trường biệt hóa (nhóm chứng), hình thái tế bào khơng có thay đổi, khơng có khống hóa Mức độ biểu gen collagen týp I (col1), osteonectin (ON), bone sialoprotein (BSP) so với nhóm chứng thấy mức độ biểu gen col1 ON khơng có khác biệt thời điểm 14 20 ngày Biểu BSP có khác biệt thời điểm 14 20 ngày sau biệt hóa Tiềm biệt hóa xương MSC xác định khống hóa chất nền, điều kiện trì q trình biệt hóa xương Quan sát khống hóa sau 20 ngày biệt hóa từ MSC có kiểu hình tương tự tế bào tiền thân tạo xương [4] TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Nhiều nghiên cứu đ cơng bố vai trò tế bào gốc hồi phục g y xương khơng tự hàn gắn Vì vậy, việc nghiên cứu biệt hóa MSC thành tế bào gốc mô xương quan tâm nhiều Khả biệt hóa MSC thành dạng tạo cốt bào gợi mở ứng dụng liệu pháp tế bào gốc tái tạo mô xương Hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng giúp cung cấp chứng khoa học, vai trò định hướng dòng điều trị tái tạo xương Dexamethasone glucocorticoid steroid, có tác dụng kích thích biệt hóa thành xương MSC, phụ thuộc vào liều nó, liều cao kích thích tạo mỡ, liều thấp kích thích tạo xương Liều dùng nghiên cứu phù hợp cho biệt hóa tạo xương Các yếu tố khác ascorbic yếu tố có tác dụng tham gia hình thành xương biển đổi tiền collagen thành collagen, glycerolphosphatase có vai trò thúc đẩy hình thành chất khống hóa Chính vậy, sau thời gian tiếp xúc với mơi trường biệt hóa, tế bào MSC thay đổi hình thái giống tạo cốt bào Hợp dòng biệt hóa MSC tạo dòng xương điều hòa nhiều yếu tố MSC biệt hóa tạo tiền tạo cốt bào Tiền tạo cốt bào có hình elip, nhân nằm dọc theo tế bào giai đoạn đầu biệt hóa tế bào có tiềm tăng sinh Chúng biểu Runx2, DLx5, MSx2 vài marker tạo cốt bào ALP, collagen týp I osteopontin (OPN), biểu marker yếu tạo cốt bào trưởng thành ALP protein biểu sớm điều hòa khống hóa β-catenin, Runx2 Osx biệt hóa thành tiền tạo cốt bào đến tạo cốt bào trưởng thành Những tế bào phẳng có hình suốt Chúng biểu protein chất xương, BSP OPN Giai đoạn sau, Runx2 bị ức chế tạo cốt bào trưởng thành Osx có giai đoạn cuối tạo cốt bào trưởng thành cảm ứng biểu osteocalcin Khi tế bào hồn tất q trình biệt hóa có dạng hình khối sản phẩm khống hóa vào chất vơ Trong bào tương có Golgi lưới nội bào có hạt phát triển tạo cốt bào, kết tăng sản phẩm protein Biểu OPN giảm tạo cốt bào trưởng thành, biểu protein P2X5, alkaline phosphatase, collagen týp I osteocalcin ngày tăng [5] KẾT LUẬN Sau biệt hóa tuần mơi trường có chất cảm ứng tạo xương gồm dexamethasone ascorbic, TBGTM tủy xương thỏ đ có dấu hiệu đặc trưng tạo cốt bào LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu quy trình ni cấy tế bào gốc mơ xương khả ứng dụng ghép tự thân động vật thực nghiệm” Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn tới Bộ Y tế đ tài trợ cho nghiên cứu 177 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kim S.J, Jang J.D, Lee S.K Treatment of long tubular bone defect of rabbit using autologous cultured osteoblasts mixed with fibrin Cytotechnology 2007, 54, pp.115-120 Nadri S, Soleimani M, Hosseni R.H et al An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells Int J Dev Biol 2007, 51 (8), pp.723-729 Tsai M.T, Lin D.J, Huang S et al Osteogenic differentiation is synergistically influenced by osteoinductive treatment and 178 direct cell-cell contact between murine osteoblasts and mesenchymal stem cells Int Orthop 2012, 36 (1), pp.199-205 Quiroz F.G, Olga M, Estefan P et al Isolation of human bone marrow mesenchymal stem cells and evaluation of their osteogenic potential Revista Ingenierisa Biomesdica 2008, pp.48-55 Zhang Y, Khan D, Delling J et al Mechanisms underlying the osteo- and adipodifferentiation of human mesenchymal stem cells The Scientific World Journal 2012 doi:10.1100/2012/793823 ... xúc với mơi trường biệt hóa, tế bào MSC thay đổi hình thái giống tạo cốt bào Hợp dòng biệt hóa MSC tạo dòng xương điều hòa nhiều yếu tố MSC biệt hóa tạo tiền tạo cốt bào Tiền tạo cốt bào có hình... sau biệt hóa, ALP marker biểu sớm 176 Quiroz F.G (2008) nghiên cứu biệt hóa hMSC thành tạo cốt bào môi trường chuyên biệt tạo xương, đánh giá tạo xương khống hóa chất marker biểu tạo cốt bào. .. Vì vậy, việc nghiên cứu biệt hóa MSC thành tế bào gốc mô xương quan tâm nhiều Khả biệt hóa MSC thành dạng tạo cốt bào gợi mở ứng dụng liệu pháp tế bào gốc tái tạo mơ xương Hướng nghiên cứu có