Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết có nội dung trình bày về: Ứng dụng kỹ thuật FISH (fluorescent in situ hybridization) trong chẩn đoán đột biến gen elastin gây hội chứng williams‐beuren. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH (FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION) TRONG CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN ELASTIN GÂY HỘI CHỨNG WILLIAMS‐BEUREN Nguyễn Thị Băng Sương* TĨM TẮT Mở đầu: Hội chứng Williams‐Beuren (WBS) là bệnh di truyền trội do đột biến mất đoạn gen Elastin nằm ở locus 7q11.23 trên trên nhiễm sắc thể số 7. Hội chứng gây ra nhiều tổn thương, đặc biệt là ở hệ tim mạch. Chẩn đốn xác định bệnh có ý nghĩa quan trọng trong tiên lượng các dị tật cũng như định hướng điều trị cho bệnh nhân. Ở Việt Nam, việc ứng dụng phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đốn xác định WBS còn rất hạn chế. Mục tiêu: Chẩn đốn đột biến gene elastin (ELN) gây hội chứng Williams bằng kỹ thuật FISH. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Những bệnh nhân được chẩn đốn Williams‐Beuren trên lâm sàng với vẻ mặt điển hình và các tổn thương tim mạch đặc hiệu cũng như đã có kết quả dương tính với phản ứng MLPA. Tiến hành kỹ thuật FISH để xây dựng quy trình. Kết quả: Tất cả các bệnh nhân đều dương tính với phản ứng FISH. Kết luận: Như vậy kỹ thuật FISH là phương pháp sinh học phân tử có thể ứng dụng trong chẩn đốn xác định WBS ở Việt Nam. Từ khóa: 7q11.23, FISH, MLPA, vi mất đoạn, Williams‐Beuren. ABSTRACT APPLICATION OF FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION FOR DIAGNOSIS OF MUTATIONS IN ELASTIN GENE WHICH CAUSE WILLIAMS‐BEUREN SYNDROME Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 24 ‐ 28 Introduction: Williams‐Beuren syndrome (WBS) is the dominant genetic disease caused by a mutation in Elastin gene which locates in 7q11.23 of region on chromosome 7. Most of mutations is deletion. Syndrome caused many injuries, especially in the cardiovascular system. In many countries, FISH has been used for genetic diagnosis of William‐Beuren syndrome. Objectives: Diagnosis of mutations in Elastin gene by fluorescent in situ hybridization technique. Patients and methods: Five patients were diagnosed William‐Beuren based on clinical and subclinical diagnostic results. In addition, DNA of all these patients were analysed by multiplex ligation‐dependent probe applification technique and we found that their Elastin gene were deleted. Design FISH procedure to diagnose William‐Beuren syndrome. Results: All five patients were positive with FISH reaction, their Elastin gene showed mutations. Conclusions: We have successfully applied the FISH technique for the diagnosis of William-Beuren syndrome Keywords: 7q11.23, FISH, MLPA, deletion, Williams‐Beuren. 1,85Mb trên nhiễm sắc thể số 7, liên quan đến ĐẶT VẤN ĐỀ 26‐28 gene, được cho là nguyên nhân gây nên Sự mất đoạn có kích thước từ 1,55 đến * Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương, ĐT: 0914007038, Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Email: suongnguyenmd@gmail.com. 25 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 hội chứng Williams‐Beuren (WBS, Williams‐ Beuren syndrome). Ước tính trên thế giới tỷ lệ mắc bệnh là 1/10000 ca sinh, trong đó sự mất đoạn 1,55Mb chiếm phần lớn. Gen Elastin, nằm giữa vùng mất đoạn, có vai trò rất quan trọng trong chức năng của cơ thể. Sự đột biến làm mất đi gene này gây ra các dị tật đặc trưng nhất của hội chứng Williams‐Beuren như hẹp trên van động mạch chủ, hẹp động mạch phổi ngoại vi hay bất thường của động mạch ni cơ(2,12,13). Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gene gây nên hội chứng WBS và phát triển các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử khác nhau, mỗi phương pháp có các ưu nhược điểm khác nhau(6,10,12). Ở Việt Nam, những nghiên cứu trên hội chứng WBS vẫn còn hạn chế. Hiện nay tại các trung tâm phẫu thuật tim mạch trong cả nước nói chung và tại thành phố Hồ Chí Minh nói riêng, bệnh nhân được chẩn đốn hội chứng Williams chỉ dựa vào các đặc điểm hình thể đặc trưng, nhất là khn mặt gợi ý, tính cách cởi mở và đặc biệt là tổn thương hẹp trên van động mạch chủ và/hoặc hẹp động mạch phổi chứ chưa có chẩn đốn phân tử chính xác. Mặc khác, những trẻ em mắc hội chứng Williams nhưng khơng có biểu hiện tim mạch thì hầu như bị bỏ sót chẩn đốn. Việc chẩn đốn chính xác hội chứng Williams bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện bệnh cũng như thiết lập cơ sở cho việc theo dõi lâu dài cũng như có những biện pháp tư vấn, hỗ trợ thích hợp. Tiêu chuẩn vàng giúp chẩn đốn bệnh là phân tích phát hiện đột biến gen, trong đó đột biến gen Elastin là ngun nhân chủ yếu gây bệnh(11). Nhóm nghiên cứu của chúng tơi đã ứng dụng thành cơng quy trình chẩn đốn đột biến mất đoạn gen Elastin bằng kỹ thuật MLPA. Tuy nhiên một số tác giả cho rằng kỹ thuật FISH có giá trị đặc hiệu cao trong xác định đột biến gen Elastin. FISH là một kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể sử dụng các probe gene elastin chuẩn bị sẵn. Nếu một bệnh nhân có hai copy ELN (mỗi 26 copy nằm trên một nhiễm sắc thể số 7) thì người này khơng mắc hội chứng Williams. Nếu một người chỉ có một copy ELN thì được chẩn đốn mắc hội chứng này. Gần như tất cả (98‐99%) bệnh nhân mắc hội chứng Williams có mất đoạn gene ELN cùng với 26 gene khác(4). Một khi tuổi thọ bệnh nhân mắc hội chứng Williams được tăng lên thì khả năng kết hơn và sinh con có thể xảy ra. Trong trường hợp này chẩn đoán xác định bằng phương pháp phân tủ sẽ tạo điều kiện cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) trong chẩn đốn đột biến gene elastin (ELN) gây hội chứng Williams” ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Nhóm chứng 10 nam và 10 nữ bình thường, tiền sử gia đình khơng có ai mắc bệnh di truyền. Nhóm nghiên cứu 5 bệnh nhân (2 nam và 3 nữ) được chẩn đoán mắc phải hội chứng Williams‐Beuren dựa vào các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng và đã được xác định có đột biến mất đoạn gen Elastin bằng kỹ thuật MLPA. Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu xét nghiệm Lấy 5 ml máu ngoại biên trong ống nắp xanh lá cây chứa heparin. Tiến hành ly tâm thu bạch cầu, trữ trong dung dịch fixative (3 methanol:1 acid acetic) Tiến hành kỹ thuật FISH Quy trình FISH được thực hiện theo hướng dẫn của kit Vysis (Abbott). Theo đó các mẫu dò và mẫu được biến tính ở 73oC trong 5 phút và lai qua đêm ở 37oC. Sau bước rửa, DAPI được sử dụng như màu nền. Mẫu sẽ được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Leika DM2000. Hiện nay, theo hãng sản xuất, các probe và màu Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học tương ứng được sử dụng là: WS ‐ LSI ELN (màu cam)/ LSI D7S486, D7S522 (màu xanh lá). Xử lý mẫu Nhược trương tế bào bằng dung dịch KCL 0,56%. Cố định tế bào bằng dung dịch Carnoy. Nhỏ cặn tế bào lên lam kính sạch đã đánh dấu sẵn vùng lai. Biến tính DNA đích bằng dung dịch biến tính Formamide 70%/2X SSC. Khử dung dịch biến tính bằng cồn 70%, 85%, 100%. Tiến hành phản ứng lai giữa DNA dò với DNA đích và rửa sau lai Nhỏ 3 μl DNA dò lên vùng vừa lai đã được đánh dấu. Đậy lá kính mỏng lên vùng vừa lai và dán viền xung quanh bằng dung kịch keo. Ủ tiêu bản ở 37°C qua đêm. Bỏ lá kính mỏng và lớp keo dán ra khỏi tiêu bản. Lần lượt rửa tiêu bản trong hai dung dịch rửa Formamide 50%/4X SSC và 2X SSC. Rửa sạch bằng dung dịch PBS pH7,4. Nhuộm, quan sát và phân tích tiêu bản Nhỏ 10 μl thuốc nhuộm DAPI lên vùng lai trên tiêu bản. Rửa bằng dung dịch PBS pH 7,4. Nhỏ dung dịch DABCO chống bay màu thuốc thuộm lên vùng lai, đậy lá kính mỏng lên và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Đánh giá, phân tích kết quả lai theo chỉ dẫn của hãng sản xuất. KẾT QUẢ Nhóm chứng thực hiện phản ứng FISH đồng thời với mẫu bệnh nhân nhằm để so sánh. Trong đó nhóm chứng sẽ cho kết quả có 2 vị trí phát tín hiệu huỳnh quang màu cam và 2 vị trí phát tín hiệu huỳnh quang màu xanh lá (Hình 1A). Kết quả phản ứng FISH của 5 bệnh nhân dưới dạng hình ảnh được trình bày ở hình 1B. Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Hình 1: Kết quả FISH. A: Người bình thường, có hai huỳnh quang màu xanh và hai huỳnh quang màu đỏ; B: Bệnh nhân bị đột biến mất đoạn gây hội chứng Williams‐Beuren, chỉ xuất hiện hai huỳnh quang màu xanh và một huỳnh quang màu đỏ. BÀN LUẬN Từ khi FISH ra đời, kỹ thuật này được ứng dụng cho chẩn đoán các bệnh liên quan đến rối loạn nhiễm sắc thể. So sánh với các phương pháp ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử khác như real‐time PCR, microsatellite, FISH vẫn là tiêu chuẩn vàng được các phòng xét nghiệm trên thế giới sử dụng làm cơ sở để kiểm chứng kết quả. Mặc dù FISH là một phương pháp tốn nhiều cơng lao động, đòi hỏi thời gian và sự tỉ mỉ, khơng thể tự động hóa được. Thêm vào đó, các hóa chất sử dụng cho FISH cũng rất độc hại. Tuy nhiên về mặt hiệu quả của xét nghiệm, 27 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 FISH có độ ổn định cao hơn so với MLPA. Đặc biệt là đối với các dạng đột biến mất đoạn dài trên nhiễm sắc thể như ở hội chứng WBS(6,10). Một kỹ thuật khác cũng được phát triển để chuẩn đoán WBS là real‐time PCR (hay QPCR, PCR định lượng). Đây cũng được coi là một chiến lượng hay vì ngun tắc khơng q phức tạp, thao tác cũng đơn giản có thể tự động hóa(7,14). Tuy nhiên, thực hiện kỹ thuật này cần thiết bị hiện đại, q trình chuẩn hóa và thiết kế gặp nhiều khó khăn về kỹ thuật đặc biệt là trình tự đặc trưng. Bên cạnh đó số lượng phản ứng cần thiết cho một xét nghiệm (thường phải sử dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều vùng mục tiêu trên vùng Williams‐Beuren) làm cho giá thành của phương pháp này có thể tăng cao. Phương pháp sử dụng microsatellite cho độ nhạy khá cao cũng như có thể phán đốn được kích thước của trình tự bị mất và giá thành rẻ(5). Tuy nhiên phương pháp này lại có thể cho kết quả âm tính giả do chỉ kiểm tra gián tiếp sự tồn tại của vùng gene mục tiêu. Vì vậy có thể bỏ sót một số trường hợp. Trong nghiên cứu, chúng tơi đã ứng dụng thành cơng kỹ thuật FISH trong chẩn đốn WBS. Kết quả của chúng tơi thu được cho thấy các bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng rất đặc trưng, cũng như đã dương tính với phản ứng MLPA đều cho kết quả có đột biến mất đoạn gen Elastin. Cả 5 bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu đều cho kết quả giống nhau với mất đoạn gen Elastin trên một allen, đây là dạng mất đoạn điển hình ở các bệnh nhân WBS. Bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường nên chỉ cần đột biến trên 1 allele đã biểu hiện kiểu hình đặc trưng của hội chứng WBS. Điều này phù hợp với các nghiên cứu của Bayes M và Dutra RL(0, 4). Kết quả FISH đối với bố và mẹ của hai bệnh nhân trong số 5 bệnh nhân được khảo sát cho kết quả âm tính (khơng được hiển thị), ở cả hai gia đình, người bố và mẹ đều là người bình thường khơng mang gen bệnh. Như vậy đột biến ở bệnh nhân là đột biến tự phát sinh chứ không phải do di truyền từ bố hoặc mẹ. Điều 28 này cũng hoàn toàn hợp lý với cơ chế gây ra WBS, do sự sai hỏng trong quá trình tái tổ hợp tương đồng ở quá trình giảm phân tạo giao tử(18,12). Tuy nhiên khi những người mắc phải hội chứng này lớn lên, lập gia đình thì khả năng gây bệnh cho người con là 50%(11). Do vậy cần phải chẩn đốn hội chứng WBS để có hướng điều trị hợp lý, tránh xảy ra trường hợp đột tử do nguy cơ tim mạch, cũng như giúp quản lý sự lan truyền gen bệnh trong cộng đồng. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Từ những bàn luận ở trên chúng tôi kết luận rằng FISH là một phương pháp cần được sử dụng làm nền tảng cho các phương pháp khác ở các phòng thí nghiệm, phù hợp với điều kiện của Việt Nam trong chẩn đoán các bệnh di truyền nói chung và bệnh Williams‐Beuren nói riêng. Vì những nghiên cứu WBS trên quần thể người Việt Nam là chưa rộng rãi nhưng lại rất cần thiết, chúng tơi đề nghị cần có những nghiên cứu lớn hơn, trong đó sử dụng phương pháp FISH đề khảo sát là rất phù hợp. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bayes M, Magano LF, Rivera N, Flores R, Perez Jurado LA (2003). Mutational mechanisms of Williams‐Beuren syndrome deletions. Am J Hum Genet, 73: 131‐51. Burn J. (1986) Williams syndrome. J Med Genet, 23: 389‐95. Deutsch SI, Rosse RB, Schwartz BL (2007). Williams syndrome: a genetic deletion disorder presenting clues to the biology of sociability and clinical challenges of hypersociability. CNS Spectr, 12: 903‐7. Dutra RL, Honjo RS, Kulikowski LD, Fonseca FM, Pieri PC, Jehee FS, Bertola DR, Kim CA (2012). Copy number variation in Williams‐Beuren syndrome: suitable diagnostic strategy for developing countries. BMC Res Notes, 5, 13. Dutra RL, Pieri Pde C, Teixeira AC, Honjo RS, Bertola DR, Kim CA (2011). Detection of deletions at 7q11.23 in Williams‐ Beuren syndrome by polymorphic markers. Clinics (Sao Paulo), 66: 959‐64. Eronen M, Peippo M, Hiippala A, Raatikka M, Arvio M, Johansson R, Kahkonen M (2002). Cardiovascular manifestations in 75 patients with Williams syndrome. J Med Genet, 39: 554‐8. Howald C, Merla G, Digilio MC, Amenta S, Lyle R, Deutsch S, Choudhury U, Bottani A, Antonarakis SE, Fryssira H, Dallapiccola B, Reymond A (2006). Two high throughput technologies to detect segmental aneuploidies identify new Williams‐Beuren syndrome patients with atypical deletions. J Med Genet, 43: 266‐73. Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 10 11 Kozlowski P, Jasinska AJ, Kwiatkowski DJ (2008). New applications and developments in the use of multiplex ligation‐dependent probe amplification. Electrophoresis, 29: 4627‐36. Lowery MC, Morris CA, Ewart A, Brothman LJ, Zhu XL, Leonard CO, Carey JC, Keating M, Brothman AR (1995). Strong correlation of elastin deletions, detected by FISH, with Williams syndrome: evaluation of 235 patients. Am J Hum Genet, 57: 49‐53. Merla G, Brunetti‐Pierri N, Micale L, Fusco C (2010). Copy number variants at Williams‐Beuren syndrome 7q11.23 region. Hum Genet, 128: 3‐26. Metcalfe K, Simeonov E, Beckett W, Donnai D, Tassabehji M (2005). Autosomal dominant inheritance of Williams‐Beuren syndrome in a father and son with haploinsufficiency for FKBP6. Clin Dysmorphol, 14: 61‐5. Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 12 13 14 Nghiên cứu Y học Pober BR (2010). Williams‐Beuren syndrome. N Engl J Med, 362: 239‐52. Pober BR, Johnson M, Urban Z (2008). Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams‐Beuren syndrome. J Clin Invest, 118: 1606‐15. Schubert C, Laccone F (2006). Williams‐Beuren syndrome: determination of deletion size using quantitative real‐time PCR. Int J Mol Med, 18: 799‐806. Ngày nhận bài Ngày phản biện nhận xét bài báo Ngày bài báo được đăng: 29/08/2013. 04/09/2013. 18/10/2013 29 ... dụng thành cơng quy trình chẩn đốn đột biến mất đoạn gen Elastin bằng kỹ thuật MLPA. Tuy nhiên một số tác giả cho rằng kỹ thuật FISH có giá trị đặc hiệu cao trong xác định đột biến gen Elastin. FISH là một kỹ ... và chẩn đoán trước sinh. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài Ứng dụng kỹ thuật FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) trong chẩn đoán đột biến gene elastin (ELN) gây hội ... nữ) được chẩn đoán mắc phải hội chứng Williams‐Beuren dựa vào các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng và đã được xác định có đột biến mất đoạn gen Elastin bằng kỹ thuật MLPA.