Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm Xây dựng quy trình định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi parvum) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Qua đó cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá chất lượng Lộc nhung thông qua việc định lượng testosteron bằng HPLC.
Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 XY DNG QUY TRèNH NH LNG TESTOSTERON TRONG LỘC NHUNG (Cornu cervi parvum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Đức Học*; Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương* Lê Minh Hồng**; Trịnh Thanh Hùng***; Võ Quang Hợp* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng testosteron Lộc nhung (Cornu cervi parvum) HPLC Đối tượng phương pháp: mẫu Lộc nhung Công ty Dược liệu Sơn Lâm cung cấp, thu mua Hương Sơn, Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng theo hướng dẫn ICH, Bộ Y tế Việt Nam Kết quả: xác định điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV đo 254 nm, dung môi pha động ACN:H2O chạy theo chương trình gradient, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 30 C Phương pháp thẩm định, bảo đảm yêu cầu phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD) Kết luận: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng testosteron Lộc nhung phương pháp HPLC, áp dụng quy trình để định lượng số mẫu Lộc nhung thị trường * Từ khóa: Lộc nhung (Cornu cervi parvum); Testosteron; HPLC Determination of Testosterone from Deer Velvet (Cornu cervi parvum) using HPLC Summary Objectives: Establishment and validation of testosterone from deer velvet (Cornu cervi parvum) using HPLC Materials and methods: Deer velvet was supported by Sonlam company that was th harvested from Hatinh province, passed requirement of Vietnamese Pharmacopoeia, Ed The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline Results: The quantification method of testosterone from deer velvet was established and validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ Conclusions: The quantification method of testosterone from deer velvet was validated fully in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health * Key words: Cornu cervi parvum; Testosterone; HPLC * Học viện Quân y ** Đại học Y Dược Cần Thơ *** Bộ Khoa học Công nghệ Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 24/08/2016 Ngày báo đăng: 07/09/2016 86 T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Lộc nhung (Cornu cervi parvum) vị thuốc quý, lấy từ sừng non hươu nai đực Lộc nhung có tác dụng tăng cường sinh lực, giảm mệt mỏi, giúp vết thương mau lành, lợi tiểu, tăng nhu động ruột dày, giúp chuyển hóa tốt protid gluxit [2] Đặc biệt, Lộc nhung có tác dụng tốt cho nam giới, giúp sinh tinh, bổ huyết, chữa liệt dương, hoạt tinh, mạnh gân cốt, dùng cho trường hợp hư tổn thể [2, 3] Trong Lộc nhung chứa nhiều thành phần tốt cho sức khoẻ như: khoáng chất yếu tố vi lượng, axit amin nội tiết tố (testosteron, estron, cortison…) [2, 3] Trong đó, testosteron có tác dụng tăng cường khả sinh tinh, chữa liệt dương [2, 3] Tuy nhiên, hoạt chất Lộc nhung chưa quan tâm nghiên cứu nhiều phương pháp định lượng Dược điển Việt Nam IV có chuyên luận riêng, tiêu chất lượng dừng lại mức định tính [1] Vì vậy, thực nghiên cứu nhằm: Cung cấp sở khoa học để đánh giá chất lượng Lộc nhung thông qua việc định lượng testosteron HPLC NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Lộc nhung thu mua Hương Sơn, Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (do Công ty Dược liệu Sơn Lâm, Hà Nội cung cấp); số mẫu Lộc nhung khác thu mua khu vực Hà Nội - Chất chuẩn testosteron (99,5%, Lot 3580002, SERVA Electrophoresis, Đức) - Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt tiêu chuẩn phân tích Phương pháp nghiên cứu Định lượng testosteron Lộc nhung phương pháp HPLC Thẩm định phương pháp thực theo dẫn ICH Bộ Y tế Việt Nam gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn định lượng giới hạn phát [1, 4] - Mẫu chuẩn: chuẩn làm việc có nồng độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml - Mẫu thử: khảo sát phương pháp xử lý mẫu khác nhau: + Phương pháp (không qua cột chiết pha rắn): cân xác 10,0 g bột Lộc nhung nghiền nhỏ rây qua rây 355/180 (bột nửa mịn) vào bình nón có nút mài, chiết siêu âm EtOH 90% 600C (40 ml x lần) Ly tâm (5.000 vòng/phút × phút) lấy dịch chiết Gộp dịch chiết lần vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ thể tích Hút xác 20 ml dịch chiết cho vào bình quay chân khơng đến cắn Hòa tan cắn 1,0 ml MeOH Lấy 100 µl dịch trên, tủa protein 10 µl axít percloric 50% Sau đó, trung hòa axít 10 µl NaOH 0,3 M Ly tâm dịch tốc độ 12.000 vòng/phút x 10 phút, thu dịch dùng để phân tích HPLC + Phương pháp (sử dụng cột chiết pha rắn SPE-C18): tiến hành tương tự phương pháp đến bước cô quay chân khơng Hòa tan cắn ml MeOH 25%, chuyển vào cột chiết pha rắn 87 T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 SPE hoạt hóa trước (5 ml MeOH 25% × lần, ml nước cất) Rửa loại tạp chất ml nước cất x lần Rửa giải ml MeOH Tất bước loại tạp rửa giải thực với tốc độ 30 - 45 giọt/phút Đem dịch rửa giải cô áp suất giảm 600C tới cắn, hòa tan cắn 200 µl MeOH Ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút thu dịch dùng để phân tích HPLC - Mẫu trắng: mẫu MeOH thực đầy đủ theo bước phương pháp - Điều kiện sắc ký: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV đo 254 nm, dung mơi pha động ACN:H2O chạy theo chương trình gradient đẳng dòng, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 300C Thể tích bơm mẫu 10 µl KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Lựa chọn điều kiện sắc ký Khảo sát với hai điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV đo bước sóng 254 nm, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 300C Trong dung mơi pha động sử dụng ACN (A):H2O (B) với điều kiện khác Điều kiện (1) chạy đẳng dòng với tỷ lệ 47:53; điều kiện (2) chạy theo chương trình gradient → 20 phút, 30% A → 60% A; 20 → 30 phút, 60% A 0.040 (a) 10.770 AU 0.030 0.020 0.010 0.000 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 19.00 20.00 18.214 Minutes 0.040 AU 0.030 (b) 0.020 0.010 0.000 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 Minutes (c) 18.323 AU 0.04 0.02 0.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 Minutes Hình 1: Sắc ký đồ testosteron chuẩn điều kiện (a), điều kiện (b) mẫu Lộc nhung điều kiện (c) Từ hình ảnh sắc ký đồ testosteron điều kiện cho thấy: điều kiện 1, thời gian lưu testosteron khoảng 10,77 phút, píc giỗng, khơng cân đối Ở điều kiện 2, thời gian lưu testosteron khoảng 18,3 phút với píc cân đối khả phân tỏch tt 88 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 kim tra iu kin sắc ký có phù hợp với phân tích mẫu thử, tiến hành chạy sắc ký với mẫu thử Lộc nhung (có sử dụng cột chiết SPE) theo điều kiện Kết phân tích cho thấy: píc testosteron mẫu thử cân đối, sắc nét, thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu píc testosteron chuẩn tách khỏi píc tạp Từ kết trên, chúng tơi lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC cho phân tích định lượng testosteron Lộc nhung sau: - Cột sắc ký: Sunfire RP-C18 (250 x 4,6 mm; µm, 100A0) - Detetor UV đo bước sóng 254 nm - Pha động: ACN:nước cất chạy theo chương trình gradient - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Nhiệt độ cột: 300C Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp: sử dụng không sử dụng cột chiết pha rắn nêu phương pháp nghiên cứu Phân tích sắc ký theo điều kiện lựa chọn trình bày mục Sắc ký đồ mẫu thử xử lý theo phương pháp trình bày hình 0.050 0.040 AU 0.030 (a) 18.478 0.020 0.010 0.000 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes 0.050 0.040 0.020 (b) 18.489 AU 0.030 0.010 0.000 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 Minutes Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thử xử lý theo phương pháp (a) phương pháp (b) Kết sắc ký đồ cho thấy: khơng sử dụng cột chiết pha rắn, mẫu nhiều tạp chất, píc testosteron tách khơng hồn tồn khỏi píc tạp Trong đó, mẫu sử dụng cột chiết pha rắn, tạp chất giảm nhiều, píc testosteron tách rõ ràng khỏi píc tạp, làm bẩn cột phân tích, góp phần kéo dài tuổi thọ cột Từ kết này, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu có sử dụng cột chiết pha rắn SPE-C18 89 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 Thm nh phng phỏp phõn tích * Tính tương thích hệ thống, chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích lần liên tiếp mẫu chuẩn có nồng độ 5,77 µg/ml theo điều kiện sắc ký lựa chọn Kết cho thấy: thời gian lưu diện tích píc thu 18,32 ± 0,03 phút ( ± SD, RSD = 0,16%) 326.883 ± 5.289 µAU x s ( ± SD, RSD = 1,62%) Cả thời gian lưu diện tích píc có giá trị RSD < 2% Đồng thời, số đĩa lý thuyết 7.429 hệ số bất đối xứng 1,06 Kết phân tích sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu testosteron chuẩn mẫu Lộc nhung ghi hình 3, cho thấy phương pháp phân tích tương thích với hệ thống sắc ký 0.020 0.018 0.016 0.014 0.012 A U 0.010 0.008 0.006 (a) 0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 Minutes 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 0.020 0.018 18.260 0.016 0.014 AU 0.012 0.010 0.008 0.006 (b) 0.004 0.002 0.000 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes 0.020 0.018 18.323 0.016 0.014 AU 0.012 0.010 (c) 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes Hình 3: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), testosteron chuẩn (b) mẫu thử Lộc nhung (c) Kết phân tích mẫu trắng, mẫu testosteron chuẩn mẫu thử Lộc nhung điều kiện cho thấy: thời điểm xuất píc testosteron sắc ký đồ dung dịch chuẩn, không thấy xuất píc dung dịch mẫu trắng Đồng thời, thời điểm xuất đáp ứng píc tương ứng dung dịch mẫu thử dịch chiết Lộc nhung Píc cân đối, sắc nét tách hồn tồn khỏi píc tạp, hệ số bất đối xứng gần Như vậy, phương pháp đảm bảo tính chọn lọc đặc hiệu 90 * Khoảng tuyến tính: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn testosteron có nồng độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml MeOH 70% Phân tích sắc ký theo điều kiện lựa chọn Đánh giá mối tương quan diện tích píc nồng độ testosteron Kết cho thấy (bảng 1, hình 4): đường hồi quy thu đường thẳng với hệ số tương quan R2 xấp xỉ (0,9999) Hệ số ∆i tất nồng độ đường chuẩn < 15% Như vậy, có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích píc nồng độ testosteron khoảng nồng độ khảo sát T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 Bng 1: Kết xây dựng đường chuẩn testosteron Thứ tự Nồng độ testosteron (µg/ml) Diện tích píc (µAU x s) Hệ số ∆i (%) 0,72 39.700 5,71 1,44 80.821 2,94 2,88 158.658 2,43 5,77 326.494 1,20 11,54 683.920 2,75 23,08 1.316.783 1,40 57,71 3.350.496 0,13 Diện tích píc (µV x s) Y = aX + b Y = 58.060 X - 4.491,9; R = 0,9999 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 y = 58.060 x - 4.491,9 R² = 0,9999 10 20 30 40 50 60 70 Nồng độ (µg/ml) Hình 4: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ testosteron * Độ lặp lại độ đúng: Chiết mẫu thử Lộc nhung có khối lượng phân tích sắc ký theo điều kiện lựa chọn Diện tích píc thu 54.815,60 ± 1.032,18 ( ± SD, n = 6) với giá trị RSD = 1,88% < 2% Điều chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại cao Bảng 2: Kết xác định lặp lại phương pháp Mẫu Khối lượng mẫu (g) Diện tích pớc (àV ì s) 10,0250 53.587 10,0014 54.675 10,0217 55.465 91 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 10,0034 54.673 10,0462 55.678 10,0053 56.586 54.815,60 SD 1.032,18 RSD (%) 1,88 Độ thực phương pháp thêm chuẩn mức 0,1440 µg, 0,2885 µg 0,5770 µg/mẫu Thêm lượng chuẩn vào mẫu thử Lộc nhung biết hàm lượng testosteron chiết mẫu theo quy trình lựa chọn Từ diện tích píc thu được, ngoại suy lượng testosteron thêm vào ban đầu Bảng Tỷ lệ thu hồi testosteron mẫu thử Lượng thêm vào (µg) 0,1440 µg 0,2885 µg 0,5770 µg Lượng tìm thấy (µg) Tỷ lệ thu hồi (%) 0,1267 87,93 0,1240 86,11 0,1309 90,90 0,2684 93,10 0,2635 91,33 0,2703 93,69 0,5581 96,74 0,5493 95,20 0,5529 95,82 ± SD 88,31 ± 2,41% 92,71 ± 1,23% 95,92 ± 0,77% Với mức thêm chuẩn, độ thu hồi đạt từ 88,31 - 95,92% Như vậy, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu độ để phân tích testosteron Lộc nhung * Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ): Trong nghiên cứu này, xác định LOD LOQ phương pháp định lượng dựa vào độ lệch chuẩn mẫu trắng độ dốc đường tuyến tính có giá trị k x SD/σ Trong đó, k = 3,3 với LOD = 10 LOQ; SD độ lệch chuẩn mẫu trắng σ độ dốc đường tuyến tính 92 Phân tích mẫu trắng liên tiếp để xác định độ nhiễu đường mẫu trắng thời điểm xuất píc tương ứng mẫu testosteron chuẩn theo điều kiện sắc ký lựa chọn Xác định SD mẫu trắng Chúng tơi tính tốn giới hạn phát giới hạn định lượng testosteron Lộc nhung theo phương pháp 4,68 x 10-3 µg/ml 14,19 x 10-3 µg/ml T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 p dụng để xác định hàm lượng testosteron số mẫu Lộc nhung thị trường Chúng sử dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng testosteron Lộc nhung thu mua thị trường Kết cho thấy hàm lượng testosteron dao động từ 0,0990 - 0,1084 µg/g mẫu thử KẾT LUẬN Đã xây dựng quy trình định lượng testosterone Lộc nhung phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV đo 254 nm, dung môi pha động ACN:H2O chạy theo chương trình gradient (0 → 20 phút, 30% ACN → 60% ACN; 20 → 30 phút, 60% ACN), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 30 C Phương pháp thẩm định, bảo đảm yêu cầu phương pháp phân tích định lượng theo hướng dẫn ICH quy định Bộ Y tế Việt Nam Phương pháp đảm bảo tính tương thích hệ thống, chọn lọc - đặc hiệu, có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích píc nồng độ testosteron khoảng 0,72 - 57,71 µg/ml, độ cao (88,31 95,92%) lặp lại (RSD < 2%); giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 4,68 x 10 -3 µg/ml 14,19 x 10-3 µg/ml Phương pháp sử dụng để phân tích số mẫu Lộc nhung thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất Hà Nội Hà Nội 2009 Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Hà Nội 2004, tr.937-940 Phạm Thanh Kỳ Dược liệu học, tập II Nhà xuất Y học Hà Nội 2007, tr.285-288 ICH Validation of analytical procedures: text and methodology Q2R1 2005 93 ... để xác định hàm lượng testosteron số mẫu Lộc nhung thị trường Chúng sử dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng testosteron Lộc nhung thu mua thị trường Kết cho thấy hàm lượng testosteron. .. vậy, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu độ để phân tích testosteron Lộc nhung * Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ): Trong nghiên cứu này, xác định LOD LOQ phương pháp định lượng. .. nghiên cứu Định lượng testosteron Lộc nhung phương pháp HPLC Thẩm định phương pháp thực theo dẫn ICH Bộ Y tế Việt Nam gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn định lượng giới