Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định trình tự và phân tích tính đa hình nucleotid đơn vùng gen ty thể HV1, HV2 trên dân tộc Chăm Việt Nam.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ VÙNG GEN TY THỂ HV1 VÀ HV2 TRÊN DÂN TỘC CHĂM VIỆT NAM Trần Thị Thúy Hằng, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu thực với mục tiêu xác định trình tự phân tích tính đa hình nucleotid đơn (Single nucleotid polymorphisms - SNP) vùng gen ty thể HV1, HV2 dân tộc Chăm Việt Nam Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để phân tích 100 mẫu DNA người dân tộc Chăm, kết so sánh với trình tự chuẩn rCRS, từ phân tích tính đa hình nucleotid đơn (SNP) vùng gen HV1 HV2 Kết cho thấy xác định trình tự hồn chỉnh vùng gen HV1, HV2 phát nhiều SNP mẫu nghiên cứu Xác định tỷ lệ số SNP hay gặp: SNP A73G A263G, 315insC gặp 100% mẫu nghiên cứu, 309insC 64%, T16189C 56%, A16183C 44%, C16223T 37%, G16129A 23%, T16304C 21%, C16261T 20%; C150T 20%; A210G 20% Đây số liệu đầu tiên, hồn chỉnh trình tự vùng gen ty thể HV1 HV2 dân tộc Chăm với số lượng mẫu tương đối lớn Từ khóa: DNA ty thể, gen HV1, gen HV2, dân tộc Chăm I ĐẶT VẤN ĐỀ Vùng gen ty thể HV1 HV2 Anderson cộng xác định năm 1981 nằm vùng điều khiển D-loop DNA ty thể gọi vùng siêu biến (HV1- Hypervariable region 1) có kích thước 359bp vị trí 16024 - 16383 vùng siêu biến (HV2 - Hypervariable region 2) có kích thước 315bp nằm vị trí 57 - 372 [1] Đây vùng có tần số đột biến cao hệ gen ty thể người [2] Cũng giống hệ gen nhân, hệ gen ty thể mang trình tự đa hình Đa hình khác biệt chuỗi DNA cá thể, nhóm, quần thể Nó bao gồm đa hình nucleotid đơn (SNP), chuỗi lặp, thêm đoạn, đoạn tái tổ hợp Đa hình gen có Địa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: khanhvan7364@gmail.com Ngày nhận: 02/03/2017 thể kết trình tiến hóa tạo nên yếu tố bên (như virus chiếu xạ) Người ta cho đa hình giúp ty thể nhạy cảm với thay đổi lượng, tạo nhiều nhiệt gốc tự do, giúp người thích ứng di cư tới nơi có khí hậu lạnh từ châu Phi sang châu Âu [3] Cho đến người ta thống kê 623 kiểu đa hình genom ty thể người, gen HV1 có 49 vị trí nucleotid thay đổi, gen HV2 có 105 vị trí nucleotid thay đổi cơng bố (http://www.mitomap.org) năm 2013 [4 - 7] Những nghiên cứu gần đây, cho thấy đa hình gen HV1 HV2 có liên quan đến nhiều bệnh, bệnh ty thể thường gặp như: hội chứng Leigh, bệnh thần kinh Leber, bệnh LHON, hội chứng Kearns - Sayre, hội chứng Pearson, hội chứng NARP bệnh liên quan đến trình chuyển hóa, lão hóa như: Đái Ngày chấp nhận: 26/6/2017 TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tháo đường, Alzheimer, Pakinson; bệnh liên quan đến ung thư [8 - 12] Đề tài thực với mục tiêu: Xác định trình tự phân tích tính đa hình nucleotid đơn vùng gen ty thể HV1, HV2 dân tộc Chăm Việt Nam II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng 100 mẫu máu ngoại vi (chống đông EDTA) người bình thường, khỏe mạnh thuộc dân tộc Chăm Việt Nam (sống tỉnh Bình Thuận) Phương pháp DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu toàn phần theo phương pháp sử dụng enzym protease K phenol:chloroform:isoamyl alcohol Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng gen HV1 HV2: HV1F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA AAG C -3’ HV1-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG -3’ HV2-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C -3’ HV2-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A -3’ Thành phần phản ứng PCR: 1X đệm PCR; 2,5 mM dNTP; 0,2 µl mồi xuôi ngược; 0,5 unit Taq polymerase; 50ng DNA H2O, tổng thể tích 20 µl Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC - phút; 30 chu kỳ [94oC- 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 30 giây]; 72oC - phút; bảo quản mẫu 15o C Giải trình tự gen theo qui trình BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Tiến hành máy 3100-Avant Genetic Analyzer hãng ABI-PRISM So sánh với trình tự GeneBank để xác định đa hình Kết giải trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự chuẩn J01415 GeneBank (National center for biotechnology information, NCBI) phân tích phần mềm CLC Main Workbench 6.01 để xác định đa hình hai vùng siêu biến HV1 HV2 Đạo đức nghiên cứu Đối tượng tham gia nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện có quyền rút khỏi nghiên cứu khơng đồng ý tiếp tục tham gia Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Khuếch đại vùng gen HV1 HV2 DNA sau tách chiết có chất lượng tốt sử dụng để khuếch đại gen HV1 HV2 cặp mồi đặc hiệu với điều kiện thành phần phản ứng chu trình nhiệt mơ tả phần phương pháp Hình Sản phẩm khuếch đại vùng gen HV1 (A) HV2 (B) 1-22: 22 mẫu nghiên cứu người dân tộc Chăm M: Thang chuẩn 100bp TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Sản phẩm khuyếch đại vùng gen HV1 HV2 có chất lượng tốt gồm băng đặc hiệu có kích thước 543 bp 422 bp Kết phân tích trình tự vùng gen HV1 HV2 2.1 Trình tự nucleotid vùng gen ty thể HV1 Hình Các vị trí đa hình nucleotid đơn (SNP) vùng gen HV1 đối chiếu với trình tự chuẩn Anderson cs công bố năm 1981 [1] Hình Hình ảnh giải trình tự số SNP vùng gen ty thể HV1 mẫu nghiên cứu mã số 12 (MS12) (SNP: C16278T; C16291A; T16297C) 10 TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2.2 Trình tự nucleotid vùng gen ty thể HV2 Hình Các vị trí đa hình nucleotid đơn (SNP) vùng gen HV2 đối chiếu với trình tự chuẩn Anderson cs cơng bố năm 1981 [1] Hình Hình ảnh giải trình tự số SNP vùng gen ty thể HV2 mẫu nghiên cứu mã số 15 (MS15) (SNP: 249DelA; A263G) TCNCYH 108 (3) - 2017 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2.3 Đa hình nuleotid đơn (SNP) vùng gen ty thể HV1 HV2 Kết giải trình tự gen HV1 HV2 100 mẫu nghiên cứu tiến hành so sánh với trình tự chuẩn, cho thấy có nhiều vị trí đa hình so với trình tự chuẩn Mẫu có vị trí đa hình 7, mẫu có nhiều vị trí đa hình 19 Chúng tơi nhận thấy rằng, vị trí đa hình tập trung nhiều gen HV1 Các vị trí đa hình hay gặp mẫu nghiên cứu 309insC 64%, T16189C 56%, A16183C 44%, C16223T 37%, G16129A 23%, T16304C 21%, C16261T 20%, C150T 20%, A210G 20%, đặc biệt ba vị trí đa hình A73G, A263G 315insC gặp 100% mẫu nghiên cứu Các đột biến thay phổ biến nhất, nucleotid thêm vào thường C nucleotide thường A Các kết thu vị trí đa hình hai vùng gen HV1 HV2 phản ánh tốc độ đột biến cao vùng gen Bảng Bảng vị trí đa hình thường gặp gen HV1 HV2 Gen HV1 Tỷ lệ Tỷ lệ % Gen HV2 Tỷ lệ Tỷ lệ % T16189C 56/100 56% A73G 100/100 100% A16183C 44/100 44% 315insC 100/100 100% C16223T 37/100 37% A263G 100/100 100% G16129A 23/100 23% 309insC 64/100 64% T16304C 21/100 21% A210G 20/100 20% C16261T 20/100 20% C150T 20/100 20% IV BÀN LUẬN Trình tự vùng gen ty thể HV1 HV2 phân tích có kích thước tương ứng 543bp 422bp theo trình tự chuẩn CRS/ rCRS gen ty thể Trong thực tế, tài liệu khác xác định độ dài vùng gen HV1 HV2 khác Vùng gen HV1 trình tự chuẩn CRS có kích thước 359bp (từ vị trí 16024 – 16383) vùng gen HV2 có kích thước 325bp (từ vị trí 057 – 372) [1] Theo TWGDAM (Technical Working Groups for DNA Analysis Methods) cho trình tự tối thiểu chấp nhận cho vùng gen HV1 từ vị trí 16024 – 16365 cho vùng gen HV2 từ vị trí 073 – 340 Trình tự chuẩn Cambridge sau chỉnh sửa (rCRS) cho thấy vùng điều khiển D-loop nằm từ vị trí 16104 đến 16569 từ đến 191 khơng rõ vị trí vùng gen ty thể 12 HV1 HV2 [4] Như vậy, nghiên cứu chúng tơi xác định trình tự hồn chỉnh vùng gen HV1 HV2 Trình tự mẫu nghiên cứu đối chiếu so sánh với trình tự chuẩn, kết cho thấy có nhiều đa hình nucleotid đơn (có từ đến 19 SNP mẫu nghiên cứu) Nghiên cứu năm 1999, 50 người Việt Nam phát 20 đa hình vị trí enzym cắt DNA ty thể, vị trí enzym HaeII - 13Viet, MspI - 19Viet, MspI - 20Viet đa hình [5] Khi giải trình tự vùng gen HV1 HV2 mẫu dân tộc Kinh, mẫu dân tộc Tày mẫu dân tộc H’Mơng, phát 26 vị trí đa hình HV1 vị trí đa hình HV2 [6] Sự đa hình hai vùng siêu biến HV1 HV2 hầu hết đa hình đơn TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nucleotid (SNP) Các vị trí đa hình đột biến đồng hoán (transition) - đột biến thay nucleotid có gốc purin (A - G) pyrimidin (C - T); đột biến dị hoán (transversion) - đột biến thay nucleotid có gốc purin thành pyrimidin ngược lại (A - T, C - G) Các đa hình hay gặp thay nucleotid, nucleotid chèn vào thường C nucleotid bị thường A, [7] Nghiên cứu chúng tơi nhận thấy đa hình thường gặp thay nucleotid C Dạng dị hợp tử vùng lặp Cystein (C-stretch) trình tự HV1 HV2 nghiên cứu nhiều tỷ lệ đa hình vùng có khác biệt có ý nghĩa thống kê chủng tộc người khác Vì vậy, đa dạng di truyền vùng C-stretch có ý nghĩa quan trọng giám định hình gen nghiên cứu di truyền quần thể Năm 2009, nghiên cứu đa dạng di truyền vùng C-stretch 919 người Trung Quốc, thuộc chủng tộc khác Kết cho thấy, haplogroup AAAACCCCTCCCCC AACCCCCCTCCCCC haplogroup đặc trưng cho quần thể người dân tộc Tibetan Salar Trung quốc tỷ lệ đa hình T16189C thuộc vùng lặp nucleotide Cystein gen HV1 25,14% [13] Tỷ lệ đa hình nuleotid đơn T16189C dân tộc Chăm nghiên cứu chúng tơi 56%, cần có thêm nghiên cứu dân tộc khác để tìm haplogroup đặc trưng cho dân tộc Nghiên cứu thống kê số vị trí đa hình nucleotid đơn hay gặp gen HV1 HV2 DNA ty thể: 309insC 64%, T16189C 56%, A16183C 44%, C16223T 37%, G16129A 23%, T16304C 21%, C16261T 20%, C150T 20%, A210G 20%, đặc biệt ba vị trí đa hình A73G, A263G 315ins (C CC) gặp 100% mẫu nghiên cứu Kết tương đồng với TCNCYH 108 (3) - 2017 kết nghiên cứu tác giả (năm 2008) nghiên cứu 78 người Việt Nam thống kê 10 vị trí đa hình hay gặp T16172C (22/78), A16183C (23/78), T16189C (31/78), C16223T (26/78), T16304 (26/78), C150T (20/78), 249DelA (25/78), A263G (75/78), 315C (24/78), A73G (78/78) vị trí A73G gặp 100% mẫu nghiên cứu, [7] Tính đa hình/đột biến DNA ty thể liên quan đến loại bệnh khác có bệnh chuyển hóa, lão hóa như: Đái tháo đường, Alzheimer, Pakinson; bệnh liên quan đến ung thư [9 - 12],…Vì vậy, phát đa hình/đột biến DNA ty thể có vai trò quan trọng việc tìm hiểu phát sinh bệnh người Các số liệu thu trình tự DNA ty thể với vị trí đa hình DNA ty thể phát tư liệu cần thiết cho nghiên cứu bệnh lý di truyền liên quan đến DNA ty thể người Việt Nam Như vậy, nghiên cứu xác định trình tự hồn chỉnh vùng gen HV1 HV2, xác định vị trí đa hình gen HV1, HV2 Đây số liệu hồn chỉnh trình tự gen HV1 HV2 dân tộc Chăm Việt Nam với số lượng mẫu tương đối lớn V KẾT LUẬN Nghiên cứu xác định trình tự hồn chỉnh vùng gen HV1 HV2 100 mẫu người dân tộc Chăm Việt Nam Tỷ lệ số SNP hay gặp là: 309insC 64%, T16189C 56%, A16183C 44%, C16223T 37%, G16129A 23%, T16304C 21%, C16261T 20%, C150T 20%, A210G 20%, đặc biệt ba vị trí đa hình A73G, A263G 315insC gặp 100% mẫu nghiên cứu Lời cảm ơn Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cứu số số sinh học, trình tự gen ty thể người Việt Nam trưởng thành đột biến gen gây bệnh thalassemia” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam” TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson A, Bankier AT, Barrel BG et al (1981) Sequence and organisation of the human mitochondrial genome Nature 290, 457 - 465 Greenberg, B.D., J.E Newbold, and A Sugino (1983) Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA Gene 21, 33 - 49 Solano, A., et al., (2001) Genetic diseases of the mitochondrial DNA in humans Salud Publica Mex 43, 151 - 61 Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PE et al (1999) Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA Nature Genetics 23, 147 Ivanova R, A.V.T, at el, (1999) Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population European Journal of Immunogenetics 26, 417 - 422 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tơn, (2005) Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-LOOP) genome ty thể cá thể người Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 3, 15 - 22 Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Thị Tú Linh, Vũ Hải Chi, (2008) Đa hình đơn bội DNA ty thể cá thể người Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6, 579 - 590 Davidzon, et al (2005) Mitochondrial DNA and disease Annals of Medicine 37, 222 - 232 Lowell BB, S.G (2005) Mitochondrial dysfunction and type diabetes Science 307, 384 - 387 10 Chagnon P, et al (1999) Phylogenetic analysis of the mitochondrial genome indicates significant differences between patients with Alzheimer disease and controls in a FrenchCanadian founder population Am J Med Genet 85, 20 - 30 11 Walt JM, et al (2003) Mitochondrial polymorphisms significantly reduce the risk of Parkinson disease Am J Hum Genet 72, 804 - 811 12 Claus Desler, M.L.M., Keshav K Singh and Lene Juel Rasmussen (2011) The Importance of Mitochondrial DNA in Aging and Cancer Journal of Aging Research 13 Chen F., Dang Y., Yan C et al (2009) Sequence-length variation of mtDNA HVS-I C-stretch in Chinese ethenic groups J Zhejiang Univ Sci B 10, 711 - 720 Summary SEQUENCING ANALYSIS OF mtDNA HYPERVARIABLE AND HYPERVARIABLE OF CHAM ETHIC IN VIETNAM The objective of this study was to perform the sequencing analysis of mtDNA HV1, HV2 and to identify single nucleotide polymorphisms (SNP) of the HV1 and HV2 on Cham people in Vietnam Sequencing method is used to analyze 100 DNA samples of Cham The results were compared with the rCRS sequence, reported in the Human mitochondrial database, and then classified those sequences into the mitochondrial DNA haplogroups We have performed sequencing analysis of 14 TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC the HV1, HV2 and discovered many SNPs in the sample It was found that the frequencies of SNP A73G and A263G are 100%, 315insC is 100%, 309insC is 64%, T16189C is 56%, A16183C is 44%, C16223T is 37%, G16129A is 23%, T16304C is 21%, C16261T is 20%, C150T is 20%, A210G is 20% In conclusion, we have assessed the single nucleotide polymorphisms of mitochondrial DNA HV1 and HV2 of 100 Cham ethnic samples Key words: mitochondrial DNA, HV1 gene, HV2 gene, Chăm ethnic TCNCYH 108 (3) - 2017 15 ... 543 bp 422 bp Kết phân tích trình tự vùng gen HV1 HV2 2.1 Trình tự nucleotid vùng gen ty thể HV1 Hình Các vị trí đa hình nucleotid đơn (SNP) vùng gen HV1 đối chiếu với trình tự chuẩn Anderson... LUẬN Trình tự vùng gen ty thể HV1 HV2 phân tích có kích thước tương ứng 543bp 422bp theo trình tự chuẩn CRS/ rCRS gen ty thể Trong thực tế, tài liệu khác xác định độ dài vùng gen HV1 HV2 khác Vùng. .. chỉnh vùng gen HV1 HV2, xác định vị trí đa hình gen HV1, HV2 Đây số liệu hồn chỉnh trình tự gen HV1 HV2 dân tộc Chăm Việt Nam với số lượng mẫu tương đối lớn V KẾT LUẬN Nghiên cứu xác định trình tự