Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra

27 102 0
Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM MỸ DUNG PHẠM MỸ DUNG NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, 2018 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Công Hoạt GS.TS Lê Huy Hàm TS Phạm Công Hoạt TS Lê Huy Hàm Phản biện Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ họp Viện Khoa học Nơng Nghiệp Việt Nam Có thể tìm kiếm luận án thư viện: Thư Viện Quốc Gia Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Gelatinase enzym nghiên cứu nhiều với tác dụng thủy phân gelatin, pheromone, collagen, casein fibrinogen thành đoạn peptit ngắn axít amin Gelatinase enzym chứa kim loại, thuộc nhóm protease ngoại bào sử dụng ngành cơng nghiệp hóa chất, y học, cơng nghệ thực phẩm Gelatinase tự nhiên thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn thuộc chi khác Staphylococcus, Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter, Bacillus… Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn sinh gelatinase nói đối tượng vi sinh vật (VSV) gây bệnh gây hại người, động vật nên không sử dụng trực tiếp để sản xuất gelatinase Ngoài ra, vi khuẩn tự nhiên sinh gelatinase có hoạt tính khơng cao Để khắc phục tồn nguồn gelatinase tự nhiên, hướng nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp nhà khoa học, doanh nghiệp quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao hoạt tính enzym, sản xuất quy mô lớn ứng dụng rộng rãi Ngoài ra, gelatinase tái tổ hợp sản xuất loại trừ tính độc chủng vi khuẩn tự nhiên, hạn chế tác dụng gây hại tới người hay động vật Một phương pháp hiệu trọng phát triển giới ứng dụng kỹ thuật di truyền công nghệ lên men tạo chủng VSV tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hoạt tính cao, sản lượng lớn có khả ứng dụng cơng nghiệp Bên cạnh đó, nước có diện tích 6.078 ni cá Tra đạt sản lượng xuất 1,11 triệu tấn/năm có tổng giá trị xuất cá tra Việt Nam đạt 1,78 tỷ USD năm 2017 Sản phẩm xuất chủ yếu cá phi-lê dạng miếng, theo ước tính ÷ 2,5 kg cá nguyên liệu chế biến kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến tùy sản phẩm cụ thể, lại ÷ 1,5 kg nằm phần phụ phẩm chế biến, da cá chiếm từ ÷ 6% tổng lượng phụ phẩm Từ da cá tạo sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao có nhiều ứng dụng thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Vì thế, cơng nghệ chế biến nhằm tăng giá trị phụ phẩm từ nhà máy chế biến cá Tra sản xuất dầu, collagen, gelatin, thức ăn quan tâm hàng đầu Hiện nay, gelatin thủy phân môi trường kiềm axit Tuy nhiên, công nghệ sản xuất yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu axit base, đồng thời gây nhiễm mơi trường Hơn nữa, việc sử dụng dung dịch base axit để thủy phân gelatin dễ gây tượng làm chuyển dạng đồng phân axít amin, ngun nhân làm hoạt tính axít amin Vì vậy, công nghệ enzym lựa chọn giải pháp an toàn Xuất phát từ sở thực tiễn trên, tiến hành đề tài “ Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp ứng dụng thủy phân gelatin da cá Tra” 2 Mục tiêu luận án Tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Ý nghĩa khoa học Kết luận án góp phần cung cấp thêm liệu nguồn gen chủng vi sinh vật tổng hợp gelatinase tự nhiên Từ tạo chủng E coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu ứng dụng gelatinase thủy phân da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn ni cá Mú giống Ý nghĩa thực tiễn Đưa khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân da cá Tra thành bột axít amin ứng dụng bổ sung vào thức ăn ương nuôi cá Mú chấm đen nhằm nâng cao hiệu Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu - Chủng vi khuẩn MD4 sinh gelatinase Bộ sưu tập vi sinh vật Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội; Các chủng E coli BL21(DE3), XL1-blue, nhận từ phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học, Trường Đại học Quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.- Da cá Tra thu công ty cổ phần Vĩnh Ngun, Khu cơng nghiệp Trà Nóc,Thành phố Cần Thơ Mẫu sau thu gom bảo quản tủ đông nhiệt độ -20±2°C xử lý phân tích - Da cá Tra thu công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc,Thành phố Cần Thơ Mẫu sau thu gom bảo quản tủ đông nhiệt độ 20±2°C xử lý phân tích Cá Mú chấm đen: khỏe mạnh, đồng kích cỡ cm/con, khối lượng cá trung bình 7,067 g/con thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An 4.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng thủy phân gelatin da cá tra với quy mơ phòng thí nghiệm, triển khai phòng thí nghiệm cơng nghệ sinh học – Viện Đại học Mở HN -Nghiên cứu ứng dụng bổ sung chế phẩm axit amin triển khai phạm vi mô hình thử nghiệm, triển khai trại thực nghiệm nuôi hải sản – Trường Đại học Vinh 4.3 Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017 Những đóng góp luận án -Là luận án phân lập nguồn gen gel mã hóa GEL từ nguồn vi khuẩn Enterococcus faecalis phân lập Việt Nam - Đã tạo chủng E coli BL21[pET22(b)-gelE] tái tổ hợp sinh gelatinase - Ứng dụng hiệu rGEL thủy phân gelatin da cá Tra tạo chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn giống Cấu trúc luận án: Luận án gồm 119 trang với 15 bảng số liệu 39 hình Luận án gồm phần: Mở đầu (4 trang); Tổng quan tài liệu (45 trang); Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết thảo luận (46 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang) Luận án tham khảo 199 tài liệu 20 tài liệu tiếng Việt 173 tài liệu tiếng Anh, tài liệu từ Website CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong chương luận án trình bày cấu trúc, tính chất, ứng dụng gelatin; đặc điểm, cấu trúc, chức năng, chế hoạt động nguồn sản xuất gelatinase; trình bày nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp: gen mã hóa gelatinase, biểu gen gelatinase tái tổ hợp, số yếu tổ ảnh hưởng đến lên men sinh tổng hợp gelatinase, thu hồi tinh gelatinase; nghiên cứu tình hình sản xuất ứng dụng gelatinase Việt Nam, sản xuất gelatinase, ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá Tra, ứng dụng bổ sung axít amin thủy phân từ da cá Tra vào thức ăn cho cá mú Sản xuất gelatinase tái tổ hợp nhiều quan tâm nhiều chúng enzyme thủy phân ứng dụng để chế biến nguyên liệu thủy sản lại sau chế biến phi lê xem giải pháp hữu hiệu để tăng giá trị chất lượng sản phẩm thủy phân, đồng thời việc ứng dụng sản phẩm thủy phân từ da cá Tra vào lĩnh vực thực phẩm, chăn ni quan tâm nhiều Vì vậy, sản phẩm đề tài luận án sở khoa học cho việc ứng dụng enzyme tái tổ hợp vào thủy phân da cá Tra để phục vụ cho nhiều mục đích khác CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu nghiên cứu - Chủng giống vi sinh vật: + Chủng vi khuẩn E coli DH5α [end A1 rec A1 hsdR17 supE44 gypA96 thi-1relA1Δlac U169 (Φ80 lacZM15)] sử dụng làm chủng tách dòng + Chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) [F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3] sử dụng làm chủng biểu + Chủng vi sinh vật sinh gây bệnh cho cá nước hồ nuôi Hà Nội lưu giữ phòng thí nghiệm cơng nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, - Da cá Tra: thu công ty cổ phần Vĩnh Ngun, Khu cơng nghiệp Trà Nóc, Thành phố Cần Thơ Mẫu sau thu gom bảo quản tủ đông nhiệt độ -20 ±2oC xử lý phân tích - Cá Mú chấm đen: khỏe mạnh, kích cỡ 7,009 ± 0,185 cm/con, nặng 7,038 ± 0,176 g/con thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An • Thức ăn công nghiệp dạng viên (loại thức ăn dùng cho cá biển cỡ cá giống) 2.2 Nội dung nghiên cứu -Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa GEL từ vi khuẩn phân lập Việt Nam -Tạo chủng E coli tái tổ hợp sinh gelatinase nghiên cứu điều kiện lên men biểu rGEL -Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật nghiên cứu đặc tính rGEL -Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da cá Tra 2.3.Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase 2.4.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao * Định tính gelatinase phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Ball, 1997): * Xác định khả hóa lỏng gelatine dịch nuôi cấy (Shanmugasundaram et al., 2012) *Xác định hoạt tính gelatinase ( Tran Nagano, 2002) 2.4.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa định tên chủng vi khuẩn lựa chọn * Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn lựa chọn * Đặc điểm sinh trưởng chủng vi khuẩn lựa chọn - Ảnh hưởng nhiệt độ pH môi trường: 2.4.1.3 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hoá 16S rDNA * Tách chiết ADN tổng số ( Sambrook Russell, 2001) *Phân loại chủng tuyển chọn dựa phân tích trình tự 16S rDNA 2.4.2 Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp 2.4.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen gel E faecalis MD4 2.4.2.2 Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase 2.4.2.3 Giải trình tự phân tích gen gelE 2.4.2.4 Tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen gelE * Chuẩn bị tế bào khả biến * Chuyển gen gelE vào vector tách dòng * Biến nạp vào tế bào khả biến E coli (Sambrook Russell, 2001) *Tách chiết plasmid *Điện di DNA gel agarose 2.4.2.5 Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu gen gelE E coli 2.4.2.6 Phương pháp kiểm tra protein tái tổ hợp *Điện di protein gel polyacryalmide SDS – PAGE ( Laemmli, 1970) *Định lượng protein (Bradford, 1976) 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu rGEL 2.4.3.1 Nuôi cấy E coli tái tổ hợp 2.4.3.2 Thu nhận GEL từ E coli tái tổ hợp 2.4.3.3 Ảnh hưởng điều kiện biểu hiện: pH, nhiệt độ IPTG, thời gian thu hồi 2.4.4 Phương pháp thu hồi, tinh đặc tính rGEL 2.4.4.1 Thu hồi tinh rGEL 2.4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ độ bền nhiệt rGEL 2.4.4.3 Ảnh hưởng pH độ bền pH rGEL 2.4.4.4 Ảnh hưởng ion kim loại 2.4.4.5 Ảnh hưởng chất tẩy rửa 2.4.4.6 Động học rGEL với chất gelatin 2.4.5 Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da tra 2.4.5.1 Phương pháp nghiên cứu thủy phân gelatin da cá Tra rGEL *Phương pháp xử lý mẫu da cá Tra *Phương pháp trích ly gelatin *Phương pháp khảo sát điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra rGEL * Phương pháp xác định mức độ thủy phân * Phương pháp định lượng axit amin sản phẩm thủy phân 2.4.5.2 Đánh giá hiệu bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen * Phương pháp bổ sung chế phẩm vào thức ăn công nghiệp: *Phương pháp xác định tăng trưởng cá Mú thí nghiệm: định kỳ ngày kiểm tra lần khối lượng, chiều dài thân cá, từ đánh giá tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG), tốc độ tăng trưởng đặc trưng (SGR) Cuối đợt thí nghiệm đánh giá hệ số sử dụng thức ăn (FCR) Xác định hệ số phân đàn (CV): Đánh giá thời điểm thả cá thời điểm kết thúc thí nghiệm CV (%) = Độ lệch chuẩn/ giá trị trung bình x 100 Xác định tỷ lệ sống cá Mú ương 2.4.6 Phương pháp thu thập xử lý số liệu Toàn số liệu thu thập q trình thí nghiệm xử lý phương pháp thống kê sinh học phần mềm Excell 2007, SPSS 16.0 Dùng phép kiểm định Duncan, LSD0,05 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE 3.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao Từ sưu tập giống gồm 216 chủng vi sinh vật có khả sinh enzym thủy phân gelatin phân lập từ mẫu mẫu cá nước bị bệnh lở loét, xuất huyết, đốm đỏ, tuột nhớt, tuột vẩy hồ nuôi cá Hà Nội phòng thí nghiệm cơng nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, tiến hành sàng lọc tuyển chọn chủng có khả sinh gelatinase cao để tìm nguồn gen mã hóa gelatinase tạo chủng tái tổ hợp Bảng 3.1 Hoạt tính phân giải gelatin dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập phân lập từ mẫu cá nước bị bệnh sau 48 nuôi cấy STT Ký hiệu chủng Đường kính vòng phân giải gelatin (D-d, mm) Hoạt tính gelatinase (U/ml) MD1 20,50 ± 0,01 0,34±0,12 MD2 26,51 ± 0,03 0,40±0,10 MD3 24,60 ±0,11 0,40±0,16 MD4 28,21 ± 0,16 0,64±0,11 MD5 23,02 ±0,13 0,43±0,15 MD6 21,01 ±0,21 0,38±0,10 MD7 25,00 ±0,12 0,41±0,16 MD8 25,02 ±0,15 0,39±0,12 MD9 22,02 ±0,05 0,30±0,12 10 MD10 25,01 ±0,15 0,33±0,10 11 MD11 23,00 ±0,02 0,31±0,18 Ghi chú: D: Đường kính vòng phân giải (mm), d: Đường kính lỗ thạch (mm) Trong số 11 chủng trên, chủng MD4 cho hoạt tính cao nhất, đạt 0,64±0,11 U/ml (Bảng 3.1) có khả hóa lỏng thạch gelatin 7,5g/L (Hình 3.1) lựa chọn chủng cung cấp nguồn gen mã hóa gelatinase cho nghiên cứu 3.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa định tên chủng vi khuẩn lựa chọn * Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Ở nhiệt độ 30oC sau 24 khuẩn lạc vi khuẩn có kích thước khơng đều, bề mặt bóng, mặt cắt hình lồi nhọn, mép khuẩn lạc dạng rễ hình cưa, cấu trúc dạng sợi, bề mặt nhớt, vi khuẩn bắt màu xanh tím nhuộm Gram, soi kính hiển vi với vật kính x100 thấy hình dạng vi khuẩn hình cầu bầu dục, liên kết thành cặp chuỗi kích thước tế bào từ 0,5 µm đến 0,7µm a Khuẩn lạc MD4 mơi trường MPA b Hình ảnh tế bào MD4 c Nhuộm Gram (x100 lần) KHV điện tử quét (x 10.000) Hình 3.3 Hình ảnh khuẩn lạc mơi trường MPA (a), tế bào MD4 kính hiển vi điện tử quét (b) nhuộm Gram (c) Chủng MD4 Khả đồng hoá nguồn carbon nitơ đặc điểm sinh trưởng chủng MD4 sau ngày nuôi cấy 37°C bảng 3.2 Bảng 3.2 Khả đồng hoá nguồn carbon nitơ đặc điểm sinh trưởng chủng MD4 sau ngày nuôi cấy 37°C L-Asparagin monohydrate L-Histidine monohydrate L-Phenylalanin L-Leucin L-Tryptophan L-Arginin L-Isoleucin L-Valin L-Methionin L-Lysin L-Threonin Khả sinh trưởng + + + + + Nguồn đường (1,0%, w/v) D glucose Arabinose Mannose Manitol N-acetyl glucosamine Maltose Gluconate Caprate Adipate Malate Citrate Khả sinh trưởng + + + + + + + + Đối chứng âm (MPA) - Đối chứng âm - Khoảng nhiệt độ sinh trưởng: 20 ÷45°C (nhiệt độ tối ưu: 37°C) Nồng độ muối: pH Khả phân giải: 0÷5% 4÷10 ( pH thích hợp 7) Tinh bột Casein Gelatin + + + Nguồn Nito (1,0%, w/v) Ghi chú: (+) Phát triển tốt tốt đối chứng dương (D-Glucose); (-) Không phát triển phát triển yếu đối chứng âm (khoáng); (++) Phát triển tốt * Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hố 16S rDNA - Khuếch đại gen 16S rDNA Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb (Thermo scientific, Mỹ); Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA chủng MD4 Kết khuếch đại gen 16S rDNA chủng MD4 cho thấy, sản phẩm PCR cho băng rõ nét có kích thước khoảng 1,4kb (Hình 3.4) Như vậy, sản phẩm PCR thu đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh giải trình tự gen 16S rDNA - Phân tích trình tự gen 16S rRNA Bảng 3.3 Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn MD4 với trình tự gen tương ứng chủng đăng ký Genbank (NCBI) Trình tự gene 16S rDNA chủng vi Mã số truy cập Độ tương đồng khuẩn so sánh GenBank (%) Enterococcus faecalis UFLA WFC616 KY660402.1 99 Enterococcus faecalis NBRC 100480 NR_113901.1 99 Enterococcus faecalis subsp SJYF 14 KJ174472.1 99 Enterococcus faecalis ATCC 19433 NR_115765.1 99 Enterococcus dispar LMG 13521 NR_114781.2 98 Enterococcus lactis BT159 NR_117562.1 98 Từ sở liệu trên, Cây phát sinh chủng loại thiết lập sở khoảng cách di truyền theo Kimura, việc sử dụng phương pháp Neighbor-joining Phân tích giá trị Bootstrap phát sinh chủng loại tính với 1000 mẫu thử (Hình 3.5) 11 tự gen gelE tương ứng có mã số truy cập M37185.1, D85393.1, EF105504.1, EU862241.3 có vài vị trí khác biệt Trình tự axít amin suy diễn chủng E faecalis MD4 có tương đồng cao (99%) so với gen gelE khuếch đại từ chủng E faecalis khác (Hình 3.10) Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn gelE chủng E faecalis MD4 3.2.4 Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu gen gelE E coli BL21(DE3) Để gắn gen gelE vào vector biểu pET-22b(+) chiều, khung đọc, pJet1.2: gelE pET22b(+) cắt SalI HindIII tạo gen gelE pET-22b(+) có hai đầu dính tương ứng a) Thu gen gelE có hai đầu dính hai enzym HindIII SalI Thu vùng agarose chứa vệt DNA mong đợi tinh thu lấy đoạn gen kit Invitrogen Sản phẩm gen gelE sau tinh kiểm tra điện di gel agarose 1% Gen gelE tinh cho vệt có kích thước 1,5 kb Như vậy, chúng tơi có gen gelE với hai đầu bổ sung tạo hai enzym HindIII SalI b) Tạo đầu dính cho vector pET-22b(+): Plasmid pET-22b(+) xử lý với hai enzym giới hạn Sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% Kết cho thấy vector mở vòng hồn tồn đảm bảo cho việc gắn gen tạo vector biểu Sau điện di, phần agarose chứa vector pET-22b(+) thu lại xử lý qua kit tinh DNA (Invitrogen) Như vậy, chúng tơi có sẵn ngun liệu cho việc tạo vector biểu c) Gắn gen gelE vào vector pET-22b(+) Dưới tác dụng T4-ligase, gen gelE gắn vào vector biểu tạo thành hệ thống biểu hoàn chỉnh Sau phản ứng ghép nối gen, sản phẩm ghép nối biến nạp vào tế bào E coli DH5 để tạo dòng gen (a) (b) Hình 3.12 Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) plasmid tái tổ hợp xử lý HindIII SalI (b) Ghi chú: Giếng (Hình a): pET22b(+) đối chứng, Giếng ÷ (Hình a): pET22b(+) mang đoạn chèn; Giếng (Hình b): Thang DNA chuẩn, Giếng 12 (Hình b): pET 22b-gelE cắt HindIII SalI Các plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn vector pET22b(+) (Hình 3.12a) Sau xử lý với HindIII SalI, sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp cho hai đoạn gen có kích thước tương đương với pET22b(+) (5,5 kb) gen gelE (1,5 kb) tương ứng (Hình 3.12b) Plasmid pET22b(+) mang gen gelE đặt tên pET22b-gelE 3.2.5 Tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen gelE Mẫu cảm ứng IPTG có vệt protein khác biệt so với mẫu khơng cảm ứng (Hình 3.13) có kích thước khoảng 46 kDa, tương đương với kích thước theo tính tốn phân tử protein tái tổ hợp mong đợi Hình 3.13 Điện di đồ protein tái tổ hợp SDS-PAGE Ghi chú: Giếng M: Thang protein chuẩn; Giếng 2: Protein tổng số từ E coli tái tổ hợp cảm ứng 0,4 mM IPTG protein tổng số từ tế bào E coli tái tổ hợp không cảm ứng IPTG Enzym GEL tái tổ hợp tạo vệt rõ nét vệt protein khác chứng tỏ trình biểu thực tốt Hoạt tính chủng tái tổ hợp đạt 2,45 U/ml dịch lên men, cao hoạt tính chủng gốc lần 3.3 ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL 3.3.1 Ảnh hưởng pH đến biểu rGEL Để lựa chọn pH thích hợp cho chủng tái tổ hợp sinh trưởng biểu protein, chủng E coli tái tổ hợp nuôi cấy mơi trường LB có pH thay đổi từ 5÷ với điều kiện cơng nghệ giữ Mẫu thu sau cảm ứng, xác định hoạt tính protein Hình 3.15 Ảnh hưởng pH đến biểu gelE tái tổ hợp Hình 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu gelE tái tổ hợp 13 Chủng E coli BL21[pET22(b)-gelE] biểu gelE thích hợp vùng pH trung tính 6,5 ÷ (Hình 3.15) Khoảng pH phù hợp cho sinh trưởng E coli nói chung 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu rGEL Trong thí nghiệm này, chủng E.coli tái tổ hợp ni cấy 37oC đến OD600 đạt 0,5 ÷ 0,8 Sau tế bào cảm ứng IPTG 0,4 mM tiếp tục nuôi 25, 28, 34 37oC 16 Mức độ biểu rGEL 25oC, 28oC, 34oC 37oC cho vệt protein rõ nét khoảng 46 kDa không khác đáng kể Tuy nhiên, hoạt tính rGEL thu nhiệt độ khác nhau, cụ thể nhiệt độ 25oC sau 10 hoạt tính GEL đạt cao U/ml; 28oC sau hoạt tính đạt cao 2,18 U/ml; 34oC đạt 2,53 U/ml thời điểm nhiệt độ 37oC đạt 2,89 U/ml thời điểm (Hình 3.16) Để kiểm tra khả biểu protein 37oC, điện di kiểm tra protein hòa tan thu phá tế bào E coli tái tổ hợp phần xác tế bào không tan sau biểu (Hình 3.17) (a) (b) Hình 3.17 Điện di đồ GEL biểu 37oC (a) 34oC gel SDS-PAGE (b) Hình (a) biểu 37oC: Giếng M: Thang protein chuẩn, Giếng 1: Protein tan, Giếng 2: Protein khơng tan từ xác tế bào; Hình (b) biểu 34oC: Giếng M: Thang protein chuẩn, Giếng 1: Protein không tan từ xác tế bào, Giếng 2: Protein tan Theo kết hình 3.17a, cho thấy băng (protein không tan chạy từ xác tế bào) có vệt protein đậm rõ (Hình 3.17a) có khối lượng khoảng 46 kDa tương ứng băng (protein hòa tan thu phá tế bào E coli tái tổ hợp) Như vậy, 37oC tế bào có khả biểu protein ngoại lai với hiệu suất cao phần protein ngoại khơng đóng gói để tiết ngồi mơi trường mà giữ bên tế bào Do vậy, nhiệt độ 37oC không tốt GEL trình biểu 14 Tương tự, chúng tơi tiến hành kiểm tra khả biểu GEL 34oC (Hình 3.17b) Khi biểu 34oC đa số protein tái tổ hợp dạng tan (Giếng 2) 3.3.3 Ảnh hưởng IPTG đến biểu rGEL Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng biểu GEL Nồng độ IPTG Mật độ quang, Hoạt tính (mM) OD600nm cuối (U/ml) 3,82 ± 0,04 0,01 3,55 ± 0,11 1,21 ± 0,05 0,02 3,33 ± 0,22 1,75 ± 0,13 0,05 3,21 ± 0,13 2,86 ± 0,09 0,1 3,10 ± 0,12 2,69 ± 0,05 0,2 3,01 ± 0,24 2,29 ± 0,16 0,3 3,06 ± 0,02 2,05 ± 0,14 0,4 3,11 ± 0,42 1,98 ± 0,12 0,5 3,16 ± 0,05 1,85 ± 0,04 Ghi chú: ± sai số thí nghiệm, số thí nghiệm n=3 Nồng độ IPTG cao sinh trưởng chủng giảm (Bảng 3.6) Hoạt tính GEL mẫu cảm ứng với nồng độ IPTG 0,05 mM cao nhất, đạt 2,86 U/ml dịch lên men Với nồng độ IPTG cao hoạt tính GEL thu giảm, đặc biệt nồng độ IPTG 0,5 mM hoạt tính giảm khoảng 1,39 lần so với nồng độ IPTG 0,05 mM 3.3.4 Động thái trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp Hình 3.19 Động thái trình lên men sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp Kết nghiên cứu động thái trình lên men cho thấy chủng sinh trưởng nhanh sau lên men đạt cực đại thứ 10 Trong đó, GEL bắt đầu sinh tổng hợp sau cảm ứng, tăng dần theo thời gian lên men đạt cao sau 8,5 (hoạt tính đạt khoảng 2,89 U/ml sau sinh trưởng đạt cực đại) Sau thời điểm này, hoạt tính 15 enzym khơng tăng lên mà giảm dần Như vậy, thời điểm thu hồi protein tái tổ hợp thích hợp sau 8,5 lên men 3.4 THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL 3.4.1 Thu hồi tinh rGEL Bảng 3.7 Hiệu suất tinh GEL tái tổ hợp Dịch chiết enzym thô Tinh Hoạt độ Protein Hoạt độ (số tổng (U) tổng (mg) riêng (U/mg) lần) 72,25 23,24 3,11 100 Mẫu sau tinh 60,89 84,27 Mẫu 2,78 21,90 7,04 Hiệu suất thu hồi (%) Hình 3.20 Điện di đồ protein tái tổ hợp trước sau tinh GEL cột sắc ký lực M: Thang protein chuẩn, 1: Mẫu protein tổng trước tinh sạch, 2: Sản phẩm protein tinh Kết điện di sản phẩm protein thu sau trình tinh cho thấy, băng hai xuất vệt protein đậm, có trọng lượng xấp xỉ 46 kDa, tương ứng với trọng lượng enzym tái tổ hợp mẫu protein tổng trước tinh Protein tinh có hoạt độ riêng 21,9 U/mg protein, tăng 7,04 lần với ban đầu hiệu suất thu hồi enzym 84,27 % (Bảng 3.7) 3.4.2 Đặc tính rGEL 3.4.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ độ bền nhiệt Hình 3.22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính rGEL Hình 3.23 Độ bền nhiệt rGEL 16 Sự biến thiên hoạt tính rGEL cho thấy, hoạt tính tăng dần theo tăng nhiệt độ từ 20 ÷ 55oC đạt giá trị cao 40oC , giảm nhẹ từ 45 ÷ 55oC 60% hoạt tính xúc tác 55oC Như vậy, nhiệt độ xúc tác GEL dao động 37 ÷ 45oC Từ kết thu cho thấy hoạt tính gelatinase tái tổ hợp tương đối ổn định đầu (giữ 97%), sau thời gian ủ lâu hoạt tính giảm Đến khả thủy phân gelatin đạt 39,8% so với hoạt tính ban đầu mức nhiệt độ 45oC, tiếp đến 46,9% mức nhiệt độ 40oC cuối đạt 70,2% nhiệt độ 37oC 3.4.2.2 Ảnh hưởng pH độ bền pH Hình 3.24 Ảnh hưởng pH tới hoạt Hình 3.25 Ảnh hưởng pH đến độ bền động xúc tác GEL GEL tái tổ hợp Kết cho thấy, GEL xúc tác dải pH kiềm với biên độ rộng, từ 7,5 ÷ 11, hoạt động tốt pH ÷ 7,5 Sau thời gian ủ nhiệt độ 40oC pH pH7,5 hoạt tính GEL trì mức xấp xỉ 97÷100%, sau hoạt tính enzym giảm dần đến hoạt tính gelatinase 75%; 73% so với ban đầu (p>0,05) Đối với pH 8,5 hoạt tính tương đối ổn định đầu sau hoạt tính giảm dần tiếp theo, đến hoạt tính GEL đạt 58,9% so với ban đầu Mặt khác, pH5 sau hoạt tính enzym 83,1%, đến lại có 25% hoạt tính GEL Còn pH7 pH7,5 hoạt tính GEL trì ổn định giờ, điều cung cấp thơng tin sở cho thí nghiệm thủy phân gelatin sau 3.4.2.3 Ảnh hưởng ion kim loại Bảng 3.8 Ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính GEL tái tổ hợp STT Ion bổ sung Ca2+ Fe2+ Hoạt tính tương đối (%) Không bổ sung ion mM 100 115 ± 1,2 100 95 ± 1,5 17 Co2+ Mn2+ Cu2+ Mg2+ EDTA β-mercaptoetanol 100 100 100 100 100 100 92 ± 3,0 97 ± 2,0 104 ± 4,6 100 ± 2,5 0,0 ± 5,0 0,0 ± 4,9 Kết nghiên cho thấy có mặt Ca2+ làm tăng hoạt tính GEL cao nhất, xấp xỉ 15 ± 1,2%, ion Mg2+, Cu2+ khơng làm ảnh hưởng mà làm tăng nhẹ hoạt tính GEL, hoạt tính tương đối 100%, 104 ± 4,6% Trong ion như: Fe2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính enzym EDTA β-mercaptoetanol gây kìm hãm mạnh hoạt tính rGEL, hàm lượng mM, hai chất ức chế hoàn toàn hoạt động enzym 3.4.2.4 Ảnh hưởng chất tẩy rửa Một số chất tẩy rửa có hoạt tính bề mặt Tween 20, Triton X-100, SDS gây ảnh hưởng đến hoạt tính gelatinase Tween 20 nồng độ 0,05) Từ kết bảng 3.12, 3.13 cho thấy lúc bắt đầu thí nghiệm chiều dài khối lượng cá thí nghiệm cơng thức thí nghiệm (p>0,05) Nhưng kết thúc thí nghiệm, có sai khác tăng trưởng trung bình(ADG), tăng trưởng đặc trưng (SGR) theo chiều dài hay khối lượng cá Mú chấm đen nghiệm thức có mức bổ sung chế phẩm axít amin khác (p0,05) Điều nói lên nuôi cá Mú chấm đen sử dụng thức ăn có 22 hàm lượng protein thơ khoảng 46,5%, hàm lượng lysine khoảng 1,7% cho hiệu tăng trưởng cá đạt cao 3.5.2.4 Hệ số chuyển đổi thức ăn Qua q trình thí nghiệm chúng tơi thu kết hệ số chuyển đổi thức ăn cá Mú chấm đen giai đoạn giống mức bổ sung chế phẩm axít amin sau: Bảng 3.14 Hệ số chuyển đổi thức ăn cá Mú mức bổ sung chế phẩm axit amin khác Khối lượng Khối lượng cá thả Khối lượng cá Khối lượng (g) thu (g) cá tăng (g) CT1 7,067 ± 0,185a 12,607±0,503a 268,56 989,38 4,39±0,05b CT2 7,024 ± 0,536a 13,738±0,186b 323,16 983,36 3,66±0,03ab CT3 7,035 ± 0,356a 15,114±0,161c 320,20 984,9 3,05±0,12a CT4 7,038 ± 0,176a 15,043±0,129c 212,92 985,32 3,08±0,34a CT5 7,042 ± 0,065a 12,365±0,025a 237,00 985,88 4,63±0,05b CT6 7,075 ± 0,083a 13,000±0,217a 243,52 990,5 4,18±0,01b CT7 7,063 ± 0,196a 13,151±0,410a 268,56 988,82 4,06±0,01b Chỉ tiêu thức ăn FCR dùng (g) Ghi chú: chữ khác viết kèm bên giá trị cột biểu thị cho khác có ý nghĩa thống kê (p

Ngày đăng: 18/01/2020, 05:06

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan