Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm xác định thành phần dinh dưỡng như: thành phần khoáng và nguyên tố vi lượng, acid amin, vitamin A, vitamin E. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ hai quả thể nấm Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02). Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH HOÀNG VĂN TRUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN – 2019 Công trin ̀ h đươ ̣c hoàn thành ta ̣i: Phòng thí nghiê ̣m Chuyên đề Hữu cơ, khoa Hóa ho ̣c, Trường Đa ̣i ho ̣c Vinh Người hướng dẫn khoa ho ̣c: GS TS Trầ n Đin ̀ h Thắ ng PGS TS Đinh Thị Trường Giang Phản biêṇ 1: PGS.TS Đặng Ngọc Quang Phản biêṇ 2: PGS.TS Đỗ Quang Huy Phản biêṇ 3: PGS.TS Hoàng Văn Lựu Luâ ̣n án đươ ̣c bảo vê ̣ ta ̣i Hô ̣i đồ ng đánh giá luâ ̣n án cấ p Trường ho ̣p ta ̣i: Phòng bảo vệ, tầng 6, Nhà Cơng nghệ cao Trường Đại học Vinh vào hồ i giờ phút, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiể u luâ ̣n án ta ̣i thư viê ̣n: Thư viê ̣n Quố c gia Viê ̣t Nam Trung tâm Thông tin & Thư viê ̣n Nguyễn Thúc Hào – Trường Đa ̣i ho ̣c Vinh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nấm sinh vật thiếu đời sống, khơng có nấm, chu trình tuần hồn vật chất bị mắt xích quan trọng việc phân hủy chất bã hữu Nấm nguồn thực phẩm giàu protein, đầy đủ acid amin thiết yếu, hàm lượng chất béo axit béo chưa bão hòa, giá trị lượng cao, giàu khống chất vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe người Ngoài ra, nấm chứa nhiều hoạt chất có tính sinh học, góp phần tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường sức khỏe, hỗ trợ phòng điều trị bệnh cho người Ngày nhà khoa học nghiên cứu dinh dưỡng, thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài nấm phát nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao tăng cường hệ miễn dịch, điều trị viêm gan, ung thư, HIV… Trong đó, Việt Nam quốc gia có đa dạng sinh học cao giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, kiểu sinh thái khác nhau… góp phần tạo nên đa dạng khu hệ nấm Việt Nam Đến năm 2015, có 2500 lồi nấm ghi nhận, số khoảng 1400 lồi thuộc 120 chi loài nấm lớn Các loài nấm lớn Việt Nam có giá trị tài nguyên, có 50 loài nấm ăn như: loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis), nấm chàm (Boletus aff felleus), nấm bào ngư (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) Có khoảng 200 loài nấm dùng làm dược liệu, có nhiều lồi dược liệu q như: linh chi (G.lucidum), linh chi sò (G.capense), cổ linh chi (G.applanatum), nấm vân chi (Tramethers versicolor), nấm phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris) Những nghiên cứu bước đầu hợp chất có hoạt tính sinh học số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng giàu hợp chất có trọng lượng phân tử lớn polysaccharide, polysaccharide-peptide, lectin, chất có trọng lượng phân tử nhỏ như: flavonoid, steroid, terpenoid… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị bệnh hiểm nghèo như: ung thư, tim mạch… Khoảng 50 lồi nấm có khả sinh enzym số hoạt chất quý ứng dụng công nghệ sinh học bảo vệ mơi trường Nghệ An tỉnh có nhiều vườn quốc gia như: vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt Đây vùng đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, có chứa đựng nguồn lợi lớn đa dạng sinh học, có nguồn lợi lớn nấm sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm… Các nghiên cứu nấm Việt Nam vấn đề mới, chưa nhận quan tâm mức nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu nấm yêu cầu thiết, có ý nghĩa lý luận thực tiễn, góp phần quan trọng việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, giá trị kinh tế tầm quan trọng nguồn dược liệu thiên nhiên Vì lý chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng hợp chất có hoạt tính sinh học từ số loài nấm lớn vùng Bắc Trung bộ” Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án dịch chiết loài nấm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) Trametes gibbosa (Mush 08) vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất từ loài dịch chiết loài nấm Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) Trametes gibbosa (Mush 08) - Xác định thành phần dinh dưỡng như: thành phần khoáng nguyên tố vi lượng, acid amin, vitamin A, vitamin E - Xác định hàm lượng ergosterol ergosterol peroxide - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất từ hai thể nấm Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02) - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau lấy rửa sạch, sấy khô 40 0C Việc xử lý mẫu phương pháp chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất dùng cho nghiên cứu nêu phần thực nghiệm - Phân tích thành phần dinh dưỡng: sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector khác phương pháp phổ khố i lươ ̣ng plasma cảm ứng (ICP – MS), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa hỉđrua (HG - AAS), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa lửa (F - AAS) - Phương pháp phân tích, tách hỗn hợp phân lập chất: sử dụng phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với pha tĩnh khác silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) pha đảo pha thường - Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất: cấu trúc hoá học hợp chất phân lập, xác định phương pháp vật lý đại phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR) hai chiều (2D-NMR) với kỹ thuật khác 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC HMBC sử dụng - Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư kháng viêm Những đóng góp luận án - Lần Việt Nam tiến hành nghiên cứu thành phần dinh dưỡng 08 loài nấm lớn: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) Trametes gibbosa (Mush 08) vùng Bắc Trung Bộ - Lần xác định hàm lượng ergosterol ergosterol peroxide 08 loài nấm - Từ dịch chiết thể nấm Daldinia concentrica thu 09 hợp chất Trong đó, hợp chất DCM1 [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E, 16S*,18S*,19R*) hợp chất (daldinin) Ngoài hợp chất biết [11]cytochalasa-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18,19-trihydroxy-16,18-dimethyl-10phenyl-(7S*,13E,16S*,18S*, 19R*) (DCM2), [11]-cytochalasa-6 (12),13-diene1,21-dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl-(7S*,13E,16S*,18R*) (DCM3), 8-methyleugenitol (DCM4); eugenitol (DCM5); uracil (DCM6), Dmannitol (DCM7); ergosterol (DCM8), ergosterol peroxide (DCM9) - Từ dịch chiết thể nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum thu 05 hợp chất bao gồm: Ergosterol (GAM1), 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien3β-ol (GAM2), ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3), lanosta-7,9(11),24-triene-3,26diol (GAM4), 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5).Trong hợp chất GAM3, GAM4, GAM5 lần phân lập từ loài nấm - Lần tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư với dòng tế bào ung thư khác hợp chất (DCM1, DCM2, DCM3, DCM4, DCM5) Các hợp chất DCM2 DCM3 cho thấy độc tính tế bào yếu tất dòng tế bào khối u thử nghiệm với giá trị IC50 nằm khoảng 23,0 ± 1,1 58,2 ± 2,3 M Các hợp chất DCM4 DCM5 cho thấy độc tính tế bào yếu tế bào HepG2 Hep3B với giá trị IC50 nằm khoảng 21,5 ± 5,1 46,9 ± 3,7 μM chúng khơng có hoạt tính đáng kể nồng độ thử nghiệm cao SK-LU-1 dòng tế bào SW480 Cấu trúc luận án Luận án bao gồm 120 trang với 23 bảng số liệu, 62 hình sơ đồ với 130 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp thực nghiệm (21 trang), kết thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang), danh mục cơng trình cơng bố (1 trang), tài liệu tham khảo (12 trang) Ngồi có phần phụ lục gồm 76 phổ số hợp chất chọn lọc CHƯƠNG 1: TỞNG QUAN Luận án tiến hành tở ng quan tài liệu nội dung: Thành phần dinh dưỡng nấm - Giới thiệu hàm lượng chất khơ; Protein acid amin; carbohydrate, Lipid; Vitamin Khống chất nấm Chi Daldinia - Giới thiệu đặc điểm chung hình thái chi Daldinia - Thành phần hóa học chi Daldinia Nấm than (Daldinia concentrica) Chi linh chi (Ganoderma) - Giới thiệu đặc điềm hình thái - Thành phần hóa học hoạt tính sinh học Nấm cổ linh chi ( Ganoderma applanatum) - Giới thiệu đặc điểm phân bố lồi nấm Ganoderma applanatum - Thành phần hóa học Ganoderma applanatum - Hoạt tính sinh học Ganoderma applanatum CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu: Các mẫu nấm bao gồm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) Trametes gibbosa (Mush 08) thu hái vườn quốc gia Pù Huống, Pù Mát- Nghệ An, Việt Nam vào tháng 08 năm 2015 Mẫu định danh PGS.TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học khoa học Huế Tiêu (Vinh-TSWu-20150815) lưu giữ Viện Công nghệ Hóa, Sinh Mơi trường, Trường Đại học Vinh 2.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc chất phân lập được: Sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); Sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất: Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (ESI-MS), (HRESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C- NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương hợp chất xác định phương pháp phổ NMR 2.1.4 Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học Quá trình thử hoạt tính Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên thực theo phương pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Hố chất: Các dung mơi để ngâm chiết mẫu nấm dùng loại tinh khiết (pure), dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) 2.2.2 Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lượng (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng 2.3 Nghiên cứu thành phần chất dinh dưỡng có lồi nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ 2.3.1 Xác định thành phần khoáng nguyên tố vi lượng 2.3.1.1 Xử lý mẫu phân tích Các mẫu xác định hàm lượng khoáng, nguyên tố vi lượng tiến hành theo quy trình AOAC 2.3.1.2 Điều kiện đo để định lượng khoáng nguyên tố vi lượng Chúng lựa chọn điều kiện thông số máy đo ICP-MS Agilent 7500 để xác định Ge Selen xác định phương pháp AAS sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa hiđrua (HG-AAS) Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn xác định phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa lửa (F-AAS) 2.3.2 Xác định hàm lượng acid amin 2.3.2.1 Chuẩn bị xử lí mẫu phân tích acid amin Mẫu nấm xay nhỏ bảo quản điều kiện thích hợp Quy trình xử lý mẫu phân tích theo Agilent 2.3.2.2 Tiến hành phân tích máy HPLC − Cột sắc ký: cột C18 150 4,6mm, kích thước hạt 5μm − Nhiệt độ cột: 400C − Tốc độ dòng: 0,45ml/phút − Pha động: Pha động A: Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 500 ml H2O + 90µl triethylamine (TEA) Điều chỉnh pH pH = 7,2 0,05 acid acetic 2% Thêm 1,5 ml tetrahydrofuran (THF) Pha động B: Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O Điều chỉnh pH pH = 7,2 0,05 acid acetic 2% Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitrin 200 ml methanol Detector: huỳnh quang (FLD) từ bước sóng λEx= 340, λEm= 455 nm 2.3.3 Xác định hàm lượng vitamin A E 2.3.3.1 Chuẩn bị xử lí mẫu phân tích vitamin A vitamin E Quy trình xử lý mẫu xác định vitamin A vitamin E thực theo AOAC 2.3.3.2 Tiến hành phân tích vitamin A máy HPLC - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút - Pha động: 100% ACN - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Detector: UV bước sóng λ =325 nm 2.3.3.3 Tiến hành phân tích vitamin E máy HPLC - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Pha động: 1,4 dioxan: n-hexan 1,2 : 98,8 - Nhiệt độ cột: 300C - Detector: Đo huỳnh quang (FLD) bước sóng λEx= 292nm, λEm= 330 nm 2.4 Xác định hàm lượng ergosterol ergosterol peroxide 2.4.1 Chất chuẩn Các chất chuẩn ergosterol ergosterol peroxide phân lập từ loài Ganoderma lucidum Cấu trúc chất xác định phổ 1H-, 13 C-NMR, HSQC, HMBC, MS, UV IR 2.4.2 Chiết sterol Phương pháp thử nghiệm thực theo quy trình mô tả Villares et al với số thay đổi nhỏ Bột nấm khô (~ g; độ ẩm 24%) chiết với 20 mL hỗn hợp MeOH / MeCN (85:15, v / v) cách khuấy bể siêu âm 4°C 30 phút Sau đó, hỗn hợp ly tâm tốc độ 3500 vòng / phút 10 phút Phần lại chiết hai lần, chất chiết gộp lại Các mẫu lưu trữ (4°C bóng tối) phân tích HPLC Trước phân tích HPLC, mẫu lọc qua màng lọc 0,45 μm 2.4.3 Phân tích sắc ký (HPLC) 2.4.3.1 Tiến hành phân tích ergosterol - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Dung dịch pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v ) - Nhiệt độ cột : 300C - Detector: UV bước sóng λ = 290 nm - Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút 2.4.3.2 Tiến hành phân tích ergosterol peroxide - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Pha động: Me0H 100% - Nhiệt độ cột: 35cC - Detector: UV bước sóng λ = 290 nm - Tốc độ dòng: 1ml/ phút 2.5 Nghiên cứu hợp chất từ loài nấm than (D concentrica) 2.5.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hợp chất phân lập Quả thể nấm than (D concentrica) (8,6 kg) phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết lần dung môi methanol (10L x 3) nhiệt độ phòng, thu dịch chiết cất giảm áp suất thiết bị quay cất chân không thu cao methanol (180g) Cao methanol hòa tan nước chiết phân bố với dung môi ethylacetate, chưng cất chân không thu hai phần: cao ethylacetate (105g) dịch chiết nước Cao ethylacetate tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexaneacetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 7:1; 5:1) hệ dung môi CHCl3:CH3OH (100:0; 6:1; 3:1; 2:1; 1:1) thu phân đoạn (kí hiệu từ F1 đến F7) (sơ đồ 2.1) Phân đoạn F1 (8,6 g) tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x cm) rửa giải hệ dung môi hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1), hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7) Phân đoạn F1.4 (1,0 g) sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x cm) với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1, hệ dung môi sử dụng 250 ml) thu hợp chất DCM7 (153 mg) Phân đoạn F1.6 (0,3g) tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1) thu hợp chất DCM3 (5mg) Phân đoạn F1.7 (0,5 g) tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 (100 gam, 60x3cm) với hệ dung môi giải hấp CH3OH:H2O thu DCM1 (134 mg) Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) với hệ dung môi rủa giải hexane:acetone (9:1 ; 6:1, hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6) Phân đoạn F2.6 (0,5 g) tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) giải hấp với hệ dung môi CH3OH:H2O thu hợp chất DCM6 (41 mg) Phân đoạn F3 (2,7 g) sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm) rửa giải hệ dung môi hexane:acetone (9:1; 6:1; 4:1; 1:1, hệ dung sử dụng 250ml) để thu bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4) Phân đoạn F3.2 (0,5 g) tiếp tục sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x cm) giải hấp hệ dung môi CH3OH:H2O thu hợp chất DCM2 (31 mg) Phân đoạn F4 (4,7 g) phân lập sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5cm) rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1; 10:1; 6:1; 4:1; 2:1, hệ sử dụng 200 ml) thu phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5) Phân đoạn F4.1 tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x cm) rửa giải hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1; 16:1, hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu hợp chất DCM4 (10 mg) hợp chất DCM8 (21 mg) Phân đoạn F5 (1,5 g) phân lập sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3cm) rửa giải hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu hợp chất DCM9 (43 mg) Phân đoạn F6 (1,2 g) tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) rửa giải hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, hệ sử dụng 200 ml) thu hợp chất DCM6 (13 mg) Sơ đồ 2.1 Phân lập hợp chất từ thể nấm linh chi (D concentrica) 2.5.2 Các liệu vật lý 2.5.2.1 Hợp chất DCM1 Tinh thể không màu (CHCl3), đ.n.c.216-217 °C; HR-ESI-MS m/z 546.2834 [M+Na]+ (C31H41O6NNa, cal m/z 546.2832); 1H-NMR (700MHz, Pyridine-d5) Bảng 3.14 2.5.2.2 Hợp chất DCM Tinh thể không màu, (CHCl3), đ.n.c.216-217°C; HR-ESI-MS m/z 467.2669 + [M] (C28H37O5N, cal m/z 467.2672); bảng 3.15 2.5.2.3 Hợp chất DCM Tinh thể không màu,(CHCl3), đ.n.c.120-121°C; HR-ESI-MS m/z 451.2717 + [M] (C28H37O4N, cal.m/z 451.2712); 2.5.2.4 Hợp chất DCM4 Tinh thể hình kim khơng màu, đ.n.c.182-184oC; EI-MS m/z (%): 220 (M+, C12H12O4); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 6,20 (1H, s, H-3), 2,40 (3H, s, 2- 11 carcinoma); HepG2: Ung thư tế bào gan người (human hepatocellular carcinoma); MCF7: Ung thư vú người (human breast carcinoma) CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết xác định hàm lượng chất dinh dưỡng số lồi nấm 3.1.1 Thành phần khống ngun tố vi lượng 3.1.1.1 Xây dựng đường chuẩn Để định lượng thành phần khoáng nguyên tố vi lượng, sử dụng phương pháp ICP – MS để đo Ge, phương pháp AAS-HG để đo Se, phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa lửa (F-AAS) để đo Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn Các thông số máy ICP – MS, AAS thể bảng 2.2 2.3 Các phương trình đường chuẩn thể mối quan hệ tuyến tính tín hiệu đo với nồng độ ion kim loại xây dựng Kết thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Phương trình đường chuẩn Chất chuẩn Ge (ppb) Na (ppm) K (ppm) Ca (ppm) Mg (ppm) Se (ppb) Fe (ppm) Cu (ppm) Zn (ppm) Phương trình hồi quy Y = 3,685.103X + 1,719.103 Y = 1,15002X + 0,1600 Y = 0,60203X + 0,0085 Y = 0,5192X + 0,0129 Y = 0,22055X + 0,00048 Y = 0,0085X - 0,0018 Y = 0,0669X + 0,0086 Y = 0,1079X + 0,0031 Y = 0,4624X + 0,0005 R2 1,00 0,99943 1,00 0,9998 0,9998 0,9996 0,9978 0,9999 0,9996 3.1.1.2 Kết xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg mẫu nấm lớn Sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu mục 2.3.1.1, điều kiện ghi đo thể bảng 2.2, bảng 2.3 đường chuẩn xây dựng mục 3.1.1.1, tiến hành định lượng nguyên tố nghiên cứu 08 mẫu nấm lớn Kết phân tích tính tốn thể bảng 3.2, bảng 3.3 Bảng 3.2 Kết xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg 08 mẫu nấm ST T Mẫu nấm (kí hiệu) Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07 Mush 08 Hàm lượng Ge (µg/g) ICP-MS 0,020 0,031 0,070 0,077 0,074 0,048 0,029 0,035 Hàm lượng Na, K, Ca, Mg (µg/g) theo phương pháp AAS Na K Ca Mg 36,892 41,225 32,644 29,156 39,726 21,721 16,894 45,265 1324,173 162,142 2932,645 1452,548 101,879 18,371 572,571 128,783 354,284 317,375 436,423 400,111 2226,421 341,513 1246,247 634,675 382,762 128,559 352,374 260,836 790,324 386,358 347,515 1372,692 12 Bảng 3.3 Kết xác định Se, Fe, Cu, Zn trong 08 mẫu nấm lớn ST T Mẫu nấm (kí hiệu) Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07 Mush 08 Hàm lượng Se, Fe, Cu, Zn (µg/g) theo phương pháp AAS Se 0,885 1,014 0,187 3,982 0,348 1,025 0,716 0,883 Fe 12,916 79,173 106,847 18,341 148,447 14,423 249,962 84,576 Cu 18,221 69,657 24,502 28,516 2,983 4,604 16,102 23,254 Zn 18,702 49,126 46,246 61,237 17,701 20,863 45,572 37,016 3.1.2 Hàm lượng acid amin mẫu nấm 3.1.2.1 Xây dựng đường chuẩn Để tiến hành xây dựng đường chuẩn chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn acid amin nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol Kết đo máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) bảng 3.4 Bảng 3.4 Phương trình đường chuẩn xác định acic amin TT 10 11 12 13 14 15 16 17 Phương trình đường chuẩn ( Y = aX +b) Aspatic Y = 50,892x + 268,560 Glutamic Y = 0,760x + 5,416 Serin Y = 0,869x – 0,972 Histidin Y = 0,575x + 0,115 Glycin Y = 0,872x - 5,387 Threonin Y = 0,845x – 1,787 Alanin Y = 0,884x – 0,590 Arginin Y = 0,882x + 4,068 Tyrosin Y = 0,825x + 2,598 Cys-ss-cys Y = 1,036x – 3,803 Valin Y = 0,946x – 5,502 Methionin Y = 0,947x – 5,071 Phenillalanin Y = 0,844x – 1,449 Isoleucin Y = 0,913x – 3,033 Leucin Y = 0,911x – 0,4 Lysin Y = 1,614x – 7,681 Prolin Y = 0,547x – 0,774 Axit amin Hệ số tương quan (R2) 0,9991 0,9990 1 0,9992 1 0,9997 0,9990 1 1 1 0.9995 3.1.2.2 Kết hàm lượng acid amin thủy phân mẫu nấm Sau tìm điều kiện tối ưu cho q trình xử lý mẫu phân tích acid amin mẫu nấm Đánh giá thống kê quy trình phân tích acid amin đạt giới hạn cho phép, chúng tơi tiến hành áp dụng phân tích mẫu thực tế gồm mẫu nấm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), 13 Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) Trametes gibbosa (Mush 08) Mẫu nghiên cứu gồm 08 loại nấm xử lý theo mục 2.3.2.1 Quy trình phân tích thể mục 2.3.2.2 Kết phân tích cụ thể hàm lượng acid amin 1,00g mẫu nấm bảng 3.5 Bảng 3.5 Hàm lượng acid amin thủy phân nấm nghiên cứu (μg/g) Mẫu nấm (ký hiệu) Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07 Threonin 123,53 50,34 40,47 110,32 323,15 34,64 51,11 Valin KPH 54,83 42,47 139,15 249,20 24,18 55,30 Methionin 119,84 13,37 8,74 64,41 110,9 KPH 12,75 Isoleucin 103,84 KPH 24,43 3,41 381,90 KPH KPH Leucin 253,34 74,47 47,00 187,35 320,65 40,17 74,98 Phenyllal 272,43 96,66 6,39 346,02 KPH 43,50 98,65 anin Lysin 324,95 57,00 64,18 253,32 276,10 22,30 70,21 Histidin KPH 19,98 235,13 35,00 4,35 KPH 19,28 Tổng axit amin thiết yếu 1197,93 468,81 366,65 1138,98 1666,25 164,79 382,28 (EAA) Aspatic 276,29 112,09 69,14 274,20 KPH 46,99 119,15 10 Glutamic 398,70 209,81 96,26 533,97 766,75 56,30 213,08 11 Serin 114,63 55,99 54,52 113,49 203,90 27,88 58,54 12 Glycin 213,56 63,03 KPH 181,36 27,30 57,47 80,23 Cys – ss – 13 296,19 75,88 96,17 271,74 276,20 72,64 88,48 Cys 14 Alanin 226,89 116,26 64,54 226,73 290,80 118,08 65,22 15 Arginin 190,09 86,078 69,55 212,58 368,50 26,65 98,89 16 Tyrosin 116,61 27,69 24,56 87,81 115,75 8,43 25,35 17 Prolin 146,42 134,10 513,78 135,20 378,60 88,28 117,79 Tổng acid amin không thiết 1979,38 988,52 881,26 2037,08 2427,8 502,72 866,73 yếu(NEAA) Tổng (TAA) 3177,31 1457,33 1247,91 3176,06 4094,05 667,51 1249,01 %(EAA/TAA) 37,70% 32,17% 29,38% 35,86% 40,70% 24,69% 30,61% TT Acid amin Mush 08 156,98 200,35 156,95 39,19 315,36 630,49 602,31 51,20 2152,83 298,33 450,94 126,18 235,11 637,38 248,67 271,10 222,21 163,55 2653,47 4806,30 44,79% Kết bảng 3.5 cho thấy, 08 loại nấm nấm Mush 08 có tổng hàm lượng acid amin cao (4806,30 μg/g), sau nấm Mush 05 (4094,05 μg/g) thấp Mush 06 (667,51 μg/g) Hiệu suất thu hồi phản ánh độ kết định lượng Hiệu suất thu hồi xác định thực nghiệm, sử dụng mẫu thêm chuẩn, tiến hành phân tích mẫu thật 14 Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi acid amin nấm cổ linh chi (G applanatum) TT 10 11 12 13 14 15 16 17 Acid amin Asp Glu Ser His Gly Thr Ala Arg Tyr Cys – ss – Cys Val Met Phe Ile Leu Lys Pro Cso+mẫu (ppm) KPH 16,593 5,048 1,435 1,224 7,648 6,699 9,157 4,011 6,661 6,137 3,513 1,560 8,890 7,689 6,934 8,659 Cmẫu (ppm) KPH 15,335 4,078 0,087 0,546 6,463 5,816 7,370 2,315 5,524 4,984 2,218 KPH 7,638 6,413 5,522 7,572 Cso (ppm) 1,33 1,47 1,05 1,55 0,75 1,19 0,89 1,74 1,81 1,21 1,17 1,49 1,65 1,31 1,31 1,46 1,15 H (%) 85,60 92,38 86,97 90,40 99,58 99,21 102,70 93,74 93,97 98,55 86,92 94,55 95,57 97,40 96,71 94,52 3.1.3 Hàm lượng vitamin mẫu nấm 3.1.3.1 Vitamin A 3.1.3.1.1 Xây dựng đường chuẩn vitamin A Dãy dung dịch chuẩn vitamin A khảo sát có nồng độ: 1ppm; 5ppm; 10 ppm; 100ppm Phân tích chuẩn nói xác định phương trình đường chuẩn dựa vào diện tích peak bảng 3.7 Bảng 3.7 Diện tích peak vitamin A tương ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn (ppm), x 10 100 Diện tích peak Lần Lần Lần 192,126 976,267 2053,859 15180,6 192,119 976,204 2053,883 15180,44 192,497 976,296 2053,794 15180,76 m b R2 150,202 195,87 0,9994 3.1.3.1.2 Kết phân tích Chúng tơi tiến hành xử lý 08 mẫu nấm, đồng thời để đánh giá độ kết khảo sát 01 mẫu thêm chuẩn 10 ppm theo sơ đồ 2.2 định lượng theo điều kiện chạy máy HPLC mục 2.3.2.2 Kết hàm lượng vitamin A mẫu nấm trình bày bảng 3.8 15 Bảng 3.8 Kết phân tích hàm lượng vitamin A nấm TT Mẫu (ký hiệu) Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07 Mush 08 Thể tích mẫu (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 C(μg/g) 1,093 0,361 0,446 0,927 0.541 0,285 0,738 1,208 Kết bảng 3.8 cho thấy hàm lượng vitamin A 08 mẫu nghiên cứu dao động từ 0,285 – 1,208 μg /g Hiệu suất thu hồi phương pháp thực với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn 98,71% Kết hiệu suất thu hồi cao phản ánh độ cao kết định lượng vitamin A mẫu nấm 3.1.3.2 Vitamin E 3.1.3.2.1 Xây dựng đường chuẩn vitamin E Dãy dung dịch chuẩn vitamin E khảo sát có nồng độ sau: 10ppm; 20ppm; 50 ppm Đo chuẩn nói xác định phương trình đường chuẩn dựa vào diện tích peak bảng 3.9 Bảng 3.9 Diện tích peak vitamin E tương ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn (ppm) 10 20 50 Diện tích peak Lần Lần Lần 120,31485 223,86580 535,42377 120,29823 223,66126 535,19625 120,30126 223,86985 535,42485 m b R2 10,61397 7,62161 0,9996 3.1.3.2.2 Kết phân tích Chúng tơi tiến hành xử lý mẫu nấm theo sơ đồ 2.2 định lượng theo điều kiện chạy máy HPLC mục 2.3.2.3 Kết hàm lượng vitamin E mẫu nấm trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết phân tích hàm lượng vitamin E nấm TT Mẫu (ký hiệu) Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07 Mush 08 Thể tích mẫu (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 C(μg/g) 70,565 16,959 14,881 35,544 23.772 45,613 36,704 49,331 16 Kết bảng 3.10 cho thấy hàm lượng vitamin E 08 mẫu nghiên cứu dao động từ 14,881 – 70,565 μg /g Hiệu suất thu hồi phương pháp thực với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn 97,85% Kết hiệu suất thu hồi cao phản ánh độ cao kết định lượng vitamin E mẫu nấm 3.2 Hàm lượng ergosterol ergosterol peroxide 3.2.1 Xây dựng đường chuẩn ergosterol ergosterol peroxide Chuẩn bị dãy chuẩn ergosterol khảo sát có nồng độ sau: 25ppm; 50ppm; 1000 ppm Chuẩn bị dãy chuẩn ergosterol peroxide khảo sát có nồng độ sau: 2.5ppm; 5ppm; 10ppm Tiến hành đo máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với điều kiện đo ergosterol theo mục 2.4.3.2, ergosterol peroxide theo mục 2.4.3.1 Kết thu bảng 3.11 hình 3.20, hình 3.21 Bảng 3.11 Diện tích peak ergosterol ergosterol peroxide ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn Ergosterol (ppm) 50 100 1000 Diện tích peak 127,12099 283,43860 2531,40381 Nồng độ chuẩn Ergosterol (ppm) 2,5 5,0 10,0 Diện tích peak 23,05513 46,45211 91,85735 3.2.3 Kết phân tích Bảng 3.12 Hàm lượng ergosterol mẫu nấm (μg/kg) TT Mẫu (ký hiệu) Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07 Mush 08 ergosterol 7,01 1,86 7,73 7,11 4,71 5,45 30,61 4,49 ergosterol peroxide 0,03 0,14 0,17 0,04 0,04 0,07 2,37 0,03 Kết phân tích cho thấy ergosterol ergosterol peroxide xác định có hàm lượng cao mẫu (Fomitopsis dochmius) Hàm lượng ergosterol ergosterol peroxide mẫu (Fomitopsis dochmius) có khác biệt đáng kể Hiệu suất thu hồi thực với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn 98,02% ergosterol 97,52% ergosterol peroxide Hiệu suất thu hồi cao phép xác định hàm lượng ergostero ergosterol peroxide chứng tỏ kết định lượng chất mẫu nấm cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao, độ đảm bảo 17 3.3 Nấm than (D concentrica) 3.3.1 Kết phân lập hợp chất Bảng 3.13 Các hợp chất tách từ nấm than (D concentrica) Ký hiệu hợp chất Tên chất DCM1 [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19methoxy-10-phenyl-(7S*,13E, 16S*,18S*,19R*) [11]-cytochalasa-6(12),13-diene-1,21-dione7,18,19-trihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl(7S*,13E,16S*,18S*, 19R*) [11]-cytochalasa-6 (12),13-diene-1,21-dione-7,18dihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl(7S*,13E,16S*,18R*) 8-Methyleugenitol Eugenitol Uracil D-mannitol Ergosterol Ergosterol peroxide DCM2 DCM3 DCM4 DCM5 DCM6 DCM7 DCM8 DCM9 Khối lượng (mg) 134 31 10 13 153 41 21 43 3.3.2 Xác định cấu trúc 3.3.2.1 Hợp chất DCM1 ([11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18-dihydroxy-16,18dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E, 16S*,18S*,19R*) DCM1 chất rắn vơ định hình, nhiệt độ nóng chảy 217-219°C Phổ khối lượng HRMS: m/z 546,2834 [M+Na]+ ứng với công thức phân tử C31H41O6N: 523,2933 Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton H-2 amid NH (δH 4,89); tín hiệu proton nhóm benzyl H-2’,6’(7,19), H-3’,5’(7,28) H-4’(7,25); proton ancol bậc hai H-7 (δH 4,74) Ngoài có hai proton exomethylen (δH 5,12, 5,45), hai tín hiệu proton olefin (δH 6,57, 5.12), ba proton methyl (δH 0,94, 0,89, 1,51) (Bảng 3.14) Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT (Bảng 3.14), cho thấy tín hiệu của 28 nguyên tử cacbon : ba cacbon cacbonyl C-21(δC 213,2), C-1(175,5), OCO (177.4) ; sáu cacbon thơm (δC 137,6, 130,1, 129,0, 127,1); bốn carbon olefin C13(δC 131,7), C-14(δC 133,8), C-12(δC 113,0), C-6(δC 151,8); ba cacbon bậc hai gắn oxy C-7(δC 72,1), C-19(δC 80,9), C-18 (δC 76,0); hai cacbon bậc bốn C-9(δC 64.8), C-18 (δC 76.0); năm cacbon nhóm metin C-3(53,3), C-4 (47,6), C-5(32,8), C-8 (52,8), C-16 (30,0); bốn cacbon nhóm methylen C-10 (43,8), C-15 (43,1), C17 (45,6), C-20 (29,7) năm cacbon nhóm methyl C-22 (25,1), C-23 (24,3), C11 (13,1), CH3COO (24,0) CH3O (58,8) Phổ HMBC hợp chất DCM1 cho thấy tương tác H-10, H-3’ với C-1’, C-2’,6’ cho thấy phần phenyl gắn trực tiếp với C-10; H-23 tương tác với C-18, C- 18 19 C-17; proton nhóm OCH3 tương tác trực tiếp với C-19; H-22 tương tác với C-15 C-16 Kết hợp phổ MS, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC COSY so sánh với tài liệu tham khảo [26] cho phép xác định cấu trúc DCE62-2 [11]-Cytochalasa-18-axeto- 6(12), 13-diene- 1, 21-dione-7, 18- dihydroxy-16,18dimethyl-19-metoxy-10-phenyl-(7S*, 13E, 16S*, 18S*, 19R*) Hợp chất hợp chất Hình 3.1 Phổ khối lượng hợp chất DCM1 Hình 3.2 Phổ IR hợp chất hợp chất DCM1 19 Hình 3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất DCM1 Hình 3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất DCM1 Hình 3.5 Phổ DEPT hợp chất DCM1 20 Hình 3.6 Phổ HMBC hợp chất DCM1 Hình 3.7 Phổ HSQC hợp chất DCM1 Hình 3.8 Hợp chất DCM1 21 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR DEPT hợp chất DCM1 δC (ppm) 175,5 53,3 47,6 32,8 151,8 72,1 52,8 64,8 43,8 13,1 113,0 Cacbon DEPT C CH CH CH C CH CH C 10 CH2 11 CH3 12 CH2 13 14 15 CH CH CH2 131,7 133,8 43,1 16 17 18 19 20 21 22 23 1' 2', 6' 3', 5' 4' OCH3 OCO COCH3 CH CH2 C CH CH2 C CH3 CH3 C CH CH CH 30,0 45,6 76,0 80,9 29,7 213,2 25,1 24,3 137,6 130,1 129,0 127,1 58,8 177,4 24,0 δH (J= Hz) 4,89 (d, 19,6) 3,63 (m) 3,15 (t, 6,3) 3,11 (d, 6,3) 4,74 (d, 11,2) 3,21 (t, 9,8) 2,69 (d, 6,3) 0,89 (d, 7,0) 5,45 (m) 5,12 (m) 6,57 (m) 5,12 (m) 1,93 (m) 1,67 (m) 1,17 (m) 2,92 (m); 1,41 (m) 3,66 (d, 5,6) 1,20 (m) 0,94 (d, 7,0) 1,51 (s) 7,19 (m) 7,28 (m) 7,25 (m) 3,75 (s) 2,26 (s) CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ QUẢ THỂ NẤM THAN (Daldinia concentrica ) 12 11 OH 10 1' N H 15 21 O O 22 14 13 16 19 20 18 17 MeO 4' 23 O O DCM1 22 12 11 12 OH 10 4' O O HO H 15 21 20 19 18 N 1' 13 11 23 16 10 OH N 1' 17 H 4' HO 8a 4a OH 15 23 16 17 OH HO 8a O CH3 CH3 H3C OH O (DCM4) 8-Methyleugenitol (DCM6) Uracil (DCM8) Ergosterol 22 14 21 20 19 18 6 H3C 13 DCM3 O O O DCM CH3 OH 22 14 4a O (DCM5) Eugenitol (DCM7) D-mannitol (DCM9) 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol 3.3.3 Kết thử hoạt tính sinh học Bảng 3.19 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư Mẫu DCM1 DCM2 DCM3 DCM4 DCM5 Ellipticine b SK-LU-1 IC50 (μM)a 11.4 ± 0.5 23.4 ± 2.1 40.2 ± 2.6 >50 >50 0.4 ± 0.1 HepG2 IC50 (μM)a 13.5 ± 1.3 32.8 ± 1.4 55.7 ± 4.0 21.5 ± 5.1 46.9 ± 3.7 0.4 ± 0.1 Hep3B IC50 (μM)a 13.3 ± 1.4 41.5 ± 2.3 53.1 ± 5.1 21.7 ± 2.8 35.2 ± 3.4 0.4 ± 0.1 SW480 IC50 (μM)a 13.1 ± 0.9 23.0 ± 1.1 58.2 ± 2.3 >100 >100 0.5 ± 0.1 MCF7 IC50 (μM)a 13.5 ± 1.2 31.7 ± 3.6 35.2 ± 1.5 43.6 ± 5.1 >100 0.4 ± 0.1 Thử hoạt tính sinh học gây độc tế bào với SW480: Ung thư đại tràng người (human colon adenocarcinoma), SK-LU-1: ung thư phổi người (human lung carcinoma); Hep3B: ung thư tế bào gan người (human hepatocellular carcinoma); HepG2: Ung thư tế bào gan người (human hepatocellular carcinoma); MCF7: Ung thư vú người (human breast carcinoma) Các chất 23 DCM1 DCM2 thể hoạt tính với IC50 = 11.4-41.1 µg/ml dòng tế bào khác 3.4 Nấm linh chi (Ganoderma applanatum (Pers.) Pat ) 3.4.1 Phân lập số hợp chất Quả thể nấm linh chi (G applanatum) ngâm chiết dung môi metanol Cất thu hồi dung môi dịch chiết thu cao thô metanol Hòa tan cao metanol vào nước chiết phân bố với dung môi clorofom thu cao clorofom dịch nước Từ cao cloroform nấm linh chi (G applanatum), phương pháp sắc ký cột silica gel phân lập hợp chất xác định hợp chất phương pháp phổ (Bảng 3.21) Bảng 3.21 Các hợp chất tách từ nấm linh chi (G applanatum) Ký hiệu hợp chất GAM1 GAM2 GAM3 GAM4 GAM5 Tên hợp chất Ergosterol 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol ergosta-7,22-dien-3β-ol lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid Khối lượng (mg) 123 10 31 38 30 3.4.2 Xác định cấu trúc (1) Ergosterol (GAM1) (2) 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol (GAM2) (3) Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) (4) Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) (5) 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) 24 KẾT LUẬN Đây công trình nghiên cứu thành phần dinh dưỡng hợp chất có hoạt tính sinh học 08 lồi nấm: G applanatum, D concentrica, G lucidum, G lobatum, G philippii, G multiplicatum, F dochmius T gibbosa lần Việt Nam Xác định hàm lượng nguyên tố khoáng vi lượng sau: Na (16,894 - 41,225 (µg/g)), K (18,371 - 2932,645 (µg/g)), Ca (317,375 - 2226,421 (µg/g)), Mg (128,559 - 1372,692 (µg/g)), Fe (12,916 - 249,962 (µg/g)), Cu (2,98369,657 (µg/g)), Zn (17,701 - 61,237(µg/g)), Ge (0,020 - 0,077(µg/g)), Se (0,187 3,982(µg/g)) Đã tiến hành định lượng nguyên tố phương pháp định lượng khác để đánh giá độ tin cậy kết phân tích Sự sai khác kết định lượng sử dụng phương pháp khác không lớn 10 % phản ánh độ tin cậy cao kết nghiên cứu Xác định hàm lượng acid amin thủy phân 08 loại nấm phương pháp HPLC, cho thấy tổng hàm lượng acid amin dao động từ 667,51 μg/g - 4806,30 μg/g, hiệu suất thu hồi từ 85,60% - 102,70% Tỉ lệ EAA/TAA dao động từ 29,38 - 44,79%, tỉ lệ hàm lượng acid amin thiết yếu nấm nghiên cứu tương đối cao Hàm lượng vitamin A, vitamin E, ergosterol ergosterol peroxide 08 mẫu nấm nghiên cứu xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cho kết quả: hàm lượng vitamin A (0,285-1,208 μg/g) với hiệu suất thu hồi 98,71%; hàm lượng vitamin E (14,881-70,565 μg/g) với hiệu suất thu hồi 97,85%; hàm lượng ergosterol (1,86 - 30,61 μg /kg) ergosterol peroxide (0,03 - 2,37 μg /kg) với hiệu suất thu hồi tương ứng 98,02% 97,52% Từ dịch chiết thể than (D concentrica) phân lập xác định cấu trúc hợp chất: [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18-dihydroxy16,18-dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E,16S*,18S*,19R*) hợp chất gọi tên daldinin (DCM1) Ngoài hợp chất biết [11]-cytochalasa-6(12),13diene-1,21-dione-7,18,19-trihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl(7S*,13E,16S*,18S*, 19R*) (DCM2), [11]-cytochalasa-6 (12),13-diene-1,21-dione7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl-(7S*,13E,16S*,18R*) (DCM3), 8methyleugenitol (DCM4); eugenitol (DCM5); uracil (DCM6), D-mannitol (DCM7); ergosterol (DCM8), ergosterol peroxide (DCM9) Từ dịch chiết thể nấm cổ linh chi (G applanatum) phân lập hợp chất: 02 hợp chất triterpenoid: lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4); 3βhydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5); 03 hợp chất sterol: ergosterol (GAM1); 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol (GAM2); ergosta7,22-dien-3β-ol (GAM3) Các hợp chất GAM3, GAM4, GAM5 lần phân lập từ loài nấm Đã tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư với dòng tế bào ung thư khác hợp chất (DCM1-5) Các hợp chất DCM2 DCM3 cho thấy độc tính tế bào yếu tất dòng tế bào khối u thử nghiệm với giá trị IC50 nằm khoảng 23,0 ± 1,1 58,2 ± 2,3 M Các hợp chất DCM4 DCM5 cho thấy độc tính tế bào yếu tế bào HepG2 Hep3B với giá trị IC50 nằm khoảng 21,5 ± 5,1 46,9 ± 3,7 μM chúng hoạt tính đáng kể nồng độ thử nghiệm cao dòng SK-LU-1 SW480 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Hoang Van Trung, Nguyen Ngoc Tuan, Nguyen Tan Thanh, Truong Thi Binh Giang, Dinh Thi Truong Giang, Isiaka Ogunwande, Tran Dinh Thang (2018), Detherrmination of ergosterol and ergosterol peroxide in higher fungi species by high-performance liquid, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 18(11) 14285-14292 Dinh Thi Truong Giang, Hoang Van Trung (2018), Research to determine the amount of Germanium (Ge) and some minerals (Na,K,Ca,Mg) in some mushrooms from North central region of Vietnam, Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học, 23(1) 187-193 Hoang Van Trung, Nguyen Tan Thanh, Nguyen Ngoc Tuan, Doan Manh Dung, Tran Dinh Thang (2018), The triterpenoid and steroid from the fruiting body of Ganoderma applanatum (Pers.) Pat in Vietnam, Vietnam Journal of Sciences and Technology, 56(5) 550-560 (ACI) Hoang Van Trung, Nguyen Thi Bich Ngoc, Nguyen Tan Thanh, Nguyen Ngoc Tuan, Tran Dinh Thang (2018), Characterization of cytochalasins and steroids from the fruiting bodies of Daldinia concentrica (Bolton fr ces & De not) in Vietnam, Vietnam Journal of Sciences and Technology, 56(4A) 83-89 (ACI) Hoàng Văn Trung, Đinh Thị Trường Giang, Trần Đình Thắng (2018), Xác định hàm lượng axit amin số loài nấm lớn Việt Nam sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học, (nhận đăng) Hoang Van Trung, Ping-Chung Kuo, Nguyen Ngoc Tuan, Nguyen Thi Ngan, Nguyen Tan Thanh, Tian-Shung Wu, Tran Dinh Thang (2018), Characterization of Cytochalasins and Steroids from the Ascomycete Daldinia concentrica and their Cytotoxicity, Nat Prod.Com., (aceptted) (SCIE) ... chọn đề tài: Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng hợp chất có hoạt tính sinh học từ số loài nấm lớn vùng Bắc Trung bộ Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án dịch chiết loài nấm: Ganoderma... điều trị bệnh cho người Ngày nhà khoa học nghiên cứu dinh dưỡng, thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài nấm phát nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao tăng cường hệ miễn dịch, điều... (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng 2.3 Nghiên cứu thành phần chất dinh dưỡng có lồi nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ 2.3.1 Xác định thành phần khoáng nguyên tố vi