Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích nghiên cứu của luận văn là đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986).
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận văn Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO. Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học PhápAnhMỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17]. Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: PeriodicAcid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza khơng đặc hiệu ức chế bằng NaF và khơng ức chế, photphataza kiềm và axit. Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, khơng cần máy móc hiện đại, dễ triển khai. Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu kỹ thuật nhuộm Sudan Periodic Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần. Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp. Theo Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đốn giữa hình thái họchóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc hiệu là 73,77% [25]. Theo tác giả Nguyễn Hữu Tồn thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19]. Hiên nay, tác gi ̣ ả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học Truyền máu, Bộ Cơng an đã nghiên cứu và chế tạo thành cơng kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, PeriodicAxit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls Bộ kít khắc phục được các yếu điểm ở trên. Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế xã hội cấp thiết 2. Mục đích nghiên cứu Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đốn thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986) 3. Nội dung nghiên cứu: Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần đầu tại Viện Huyết họcTruyền máu trung ương Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đốn thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls trên bệnh nhân bạch cầu cấp 4. Bố cục của đề tài Đề tài gồm 71 trang, trong đó có 65 hình vẽ, đồ thị, 26 bảng biểu, chưa kể 41 trang phụ lục và 57 tài liệu tham khảo. Ngồi phần mở đầu và kết luận, đề tài được chia làm ba chương: chương 1 – Tổng quan tài liệu, gồm 25 trang; chương 2 –Phương pháp nghiên cứu, gồm 9 trang; chương 3 – Kết quả và bàn luận, gồm 33 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang Liên quan đến nội dung đề tài đã đăng 1 bài trên Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào Trong ngành Huyết học thường sử dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào như sau: PeriodicAxit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza khơng đặc hiệu, Esteraza khơng đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axít. Các kỹ thuật này dựa trên ba ngun lý chính là phản ứng hóa học (PAS), khuếch tán vật lý (Sudan B) và enzym (6 kỹ thuật còn lại). Hai kỹ thuật nhuộm PAS và Sudan B ít có cải tiến, riêng các kỹ thuật nhuộm enzym đã phát triển mạnh kể từ khi tìm ra phản ứng tạo chất màu với sự xúc tác của enzym theo ngun lý hình thành phẩm màu azo vào những năm 50 của thế kỷ XX 1.2. Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào Từ đầu những năm 1970, bộ mơn Huyết họcTruyền máu đã triển khai các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào tại khoa Huyết họcTruyền máu Bệnh viện Bạch Mai. Một số tác giả như: Lê Đức Ngọc, Nguyễn Đình Triệu, Lưu Văn Bơi đã tiến hành một số nghiên cứu về cơ chế phản ứng, tổng hợp cơ chất, đánh giá mối tương quan giữa hoạt tínhcấu trúc và cải tiến các phương pháp đánh giá các phương pháp nhuộm hóa học tế bào. Các kết quả đã giúp nâng cao chất lượng của các kỹ thuật nhuộm ứng dụng trong chẩn đốn dòng tế bào phục vụ cho cơng tác điều trị bệnh bạch cầu 1.3. Kít nhuộm hóa học tế bào Các bộ kít thường tiến hành qua các bước chính như sau: Ph ản ứng Nhu ộnm Làm tiêu b ả ọc Cố đhóa h ịnh Tế bào Tế bào Nhuộm Nhuộm bạch cầu bạch cầu lên chưa cố đã cố màu các hồng cầu định định chất Như vậy, nhuộm hóa học tế bào là dùng các phản ứng hóa màu hoặc phản ứng dưới xúc tác của enzym để phát hiện các chất hóa học có trong tế bào. Sự xuất hiện màu chứng tỏ có chất cần phát hiện và cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của chúng có trong tế bào. Các kỹ thuật này cần đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cần thiết để đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm 1.4. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào là cơ sở để chẩn đốn phân biệt bệnh bạch cầu kinh với nhiễm trùng bạch cầu đơn nhân và dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB. 1.5. Các cơng cụ tốn học sử dụng trong nghiên cứu y học Kế hoạch hóa thực nghiệm nhằm tìm điều kiện tối ưu để đạt được kết quả nhuộm tốt nhất phải dựa trên các cơng cụ tốn học. Các phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm đơn hình và khảo sát mặt mục tiêu thường hay được sử dụng trong nghiên cứu. Hiện nay các phần mềm thống kê như: SPSS, Modde, Excel đã hỗ trợ tốt cho việc xử lý dữ liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 202 bệnh nhân có chỉ định chọc tủy tại Viện Huyết họcTruyền máu trung ương 2.2. Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu Nghiên cứu mơ tả cắt ngang Phương pháp nghiên cứu mơ tả cắt ngang Nhuộm 10 kỹ thuật theo hướng dẫn của bộ kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC sản phẩm của đề tài cấp bộ mang mã số: BH 2011 BV198 11 Kỹ thuật nhuộm hình thái tế bào bằng thuốc nhuộm giemsa; Kỹ thuật nhuộm glycogen bạch cầu bằng thuốc thử Schiff; Kỹ thuật nhuộm lipit bạch cầu bằng thuốc thử Sudan B; Kỹ thuật nhuộm peroxidaza bạch cầu bằng cơ chất là benzidin; Kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol ASD 2cloaxetat; Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS axetat; Kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu bằng cơ chất là naphtol AS axetat với chất ức chế NaF; Kỹ thuật nhuộm photphataza axit bạch cầu bằng cơ chất là naphtol ASBI photphat ở pH axit; Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm bạch cầu bằng cơ chất là naphtol ASBI photphat ở pH kiềm; Kỹ thuật nhuộm ngun hồng cầu hoặc các tế bào lưới nội mơ ứ sắt bằng Kali Feroxyanua CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu Bệnh bạch cầu cấp là bệnh lý ác tính của hệ tạo máu được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Trong tổng số 202 mẫu chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học Truyền máu Trung ương có 142 trường hợp được chẩn đốn ban đầu mắc bạch cầu cấp trong đó có 60 trường hợp kết luận đúng thể bệnh, như vậy chỉ dựa vào lâm sàng mức độ chẩn đốn đúng thể bệnh đạt tỷ lệ rất thấp (42,3%). Do đó cần kết hợp nhiều phương pháp chẩn đốn khác nhau. Tiêu chuẩn FAB (1986) sử dụng kết quả hình thái họcnhuộm hố học tế bào, marker và di truyền làm cơ sở để phân loại thể bệnh và dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp nhằm chẩn đốn và lựa chọn phác đồ điều trị cho bệnh nhân đạt hiệu quả cao nhất [33, 36, 37, 39, 40] Bang 3 ̉ 1. Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp Kết luận Bạch cầu cấp Bệnh khác Tổng Số lượng 60 142 202 Tỷ lệ (%) 29,7 70,3 100 Trong tổng số 202 trường hợp chọc tủy lần đầu tại viện Huyết học Truyền máu Trung ương trong đó có 60 trường hợp có kết luận đúng thể bệnh chiếm 29,7%. Tỷ lệ này tương đương với cơng bố của Trần Thị Minh Hương và cộng sự (32.1%) tại Bệnh viện Bạch Mai [1] Bang ̉ 3.2. Phân loại bạch cầu cấp theo giới tính Giới tính Nam Nữ Tổng Số lượng 28 32 60 Tỷ lệ (%) 46,7 53,3 100 Về giới: Tỷ lệ mắc bệnh của nữ giới là 53,3%, cao hơn nam giới và cao hơn so với cơng bố của Siegel M. P. H. R., và cộng sự ghi nhận tại Mỹ năm 2014 là 0,756 (23.370 nữ/30.900 nam) [52]. Sự khác nhau có thể là do ảnh hưởng của mơi trường sống cũng như thói quen sinh hoạt của người Mỹ và Việt Nam cũng như số lượng mẫu thu thập có thể còn thấp chưa mang tính đại diện Hinh 3.1. Bi ̀ ểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi và giới tính Về độ tuổi: Qua hình 3.1 cho thấy bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, tuy vậy đối với nam tần suất mắc bệnh tỷ lệ nghịch với độ tuổi, dưới tuổi lao động chiếm tỷ lệ cao nhất (21,5%). Ngược lại, ở nữ giới thì độ tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là ở ngồi độ tuổi lao động (20,0%) 3.2. Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 3.2.1. Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho Bang 3.3 ̉ Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính Giới tính Nam Nữ Tổng Số lượng 14 11 25 Tỷ lệ (%) 56,0 44,0 100 Về giới tính: bệnh gặp ở cả 2 giới. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở nam cao hơn nữ, nam chiếm 56,0%, nữ chiếm 44,0 % (nam/nữ =1,3) Hinh 3.3. Bi ̀ ểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi Về độ tuổi: Mẫu nghiên cứu có tuổi thấp nhất là 1 tháng tuổi và cao nhất là 93 tuổi, bệnh gặp ở mọi lứa tuổi. Theo tiêu chuẩn quy định độ tuổi lao động của người Việt Nam: độ tuổi lao động của nam giới từ 1860 tuổi, độ tuổi lao động của nữ giới từ 18 55 tuổi. Qua hình 3.3 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho