Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A

6 72 0
Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A

Đang tải... (xem toàn văn)

Thông tin tài liệu

Bài viết nhằm xác định các dạng đột biến trên gen F8 ở bệnh nhân Hemophilia A tại Việt Nam thông qua chẩn đoán trên lâm sàng được phân tích gen F8. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết các nội dung nghiên cứu.

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Lưu Vũ Dũng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh Trư ng h YH N H g n h nh r n ng tr n n tr n nh th g t nh g r t n tr n t n t nh 5000 tr tr Ch nn r t nh ngh n t ng n g h nh tN hư ngh n n t n n ng t n ng t ngh n th h n nh nh ng t n tr n g n nh nh n h h t tN nh nh n H h h n n tr n ng h n h nt hg n th t n r n - PC t PC th t g tr nh t g n ụng h th n t n tr n t n g n t h th nh nh n t ng n g nh nh n t n n nh nh n t n nh nh n t n t n t nh nh n hư h t h n t n tr n g n Từ khóa: Hemophilia A, đột biến gen F8 I ĐẶT VẤN ĐỀ Hemophilia A bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp với tần suất mắc 1/5000 trẻ trai [1] Bệnh gây nên thiếu khơng có yếu tố VIII huyết tương - yếu tố tham gia q trình đơng máu Gen F8 gen lớn thể, nằm nhánh dài nhiễm sắc thể giới tính X (Xq28) khơng có alen tương ứng nhiễm sắc thể Y, kích thước 186 kb gồm 26 exon, exon có chiều dài từ 69 đến 3106 cặp bp [2] Kể từ trình tự gen F8 công bố năm 1984, số lượng lớn đột biến gây bệnh Hemophilia A xác định; phổ biến đột biến điểm đột biến thay nucleotid, đột biến vô nghĩa (nonsense mutation), đột biến thêm nucleotid nucleotid, chiếm tỷ lệ khoảng 45 - 50%; đột biến đảo đoạn intron intron 22 chiếm tỉ lệ khoảng 30 - 35%, gặp chủ yếu bệnh nhân hemophillia A thể nặng, đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỉ lệ cao (khoảng 30 - 33%); lại đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ 10 - 15% [2; 3; 4] Tùy vào kiểu vị trí đột biến gây thể bệnh nặng nhẹ khác [2] Để xác định toàn diện dạng đột biến gen F8, cần phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác tùy vào dạng đột biến [5] Đối với đột biến điểm, kỹ thuật giải trình tự thường sử dụng để xác định đột biến, nhiên đột biến nằm rải rác khắp chiều dài gen F8 nên cần phải giải trình tự tồn gen F8 phát đột biến Đối với đột biến đảo đoạn, h n h Tr n n h nh Tr ng t Pr t n trư ng h YH N n h nh h Ng nh n 22 2014 Ngh n n- có nhiều kỹ thuật xác định kỹ thuật Southern Blot, kỹ thuật LD - PCR (Long distance - PCR) kỹ thuật I - PCR (Inversion - PCR), kỹ thuật có ưu nhược điểm khác nhau, kỹ thuật Southern Blot phát triển để phát đột biến đảo đoạn intron intron 22, nhiên kỹ thuật phức tạp, thời gian thường khoảng - 10 ngày có sử dụng chất phóng xạ nên độc hại Kỹ thuật LD - PCR không phức tạp kỹ thuật Southern Blot, thời gian tiến hành nhanh cần phải khuếch đại đoạn PCR dài (10 - 12 kb) nên đơi gặp nhiều khó khăn, vùng gen có chứa đảo GC Gần đây, kỹ thuật I - PCR (Invesion - PCR) ứng dụng nhiều xác định đột biến đảo đoạn intron intron 22 gen F8, kỹ thuật có ưu điểm độ xác cao, dễ tiến hành, sản phẩm PCR có kích thước ngắn (487 559 bp) nên dễ khuếch đại [6; 7; 8; 9; 10; 11] Với đột biến xóa đoạn, người ta thường dùng kỹ thuật PCR để xác định đột biến [5] Tại Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu lâm sàng điều trị bệnh hemophilia A, nhiên chưa có cơng trình cơng bố tồn diện loại đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Xác định dạng đột biến gen F8 số bệnh nhân hemophilia A Việt Nam II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng - Nhóm chứng: người nam bình thường, tiền sử gia đình khơng có người mắc bệnh di truyền - Nhóm nghiên cứu: 30 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh hemophilia A dựa vào triệu chứng lâm sàng định lượng protein yếu tố VIII huyết tương viện 13 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Nhi Trung ương viện Huyết học - Truyền máu Trung ương; gồm: 22 bệnh nhân thể nặng, bệnh nhân thể trung bình bệnh nhân thể nhẹ Phương pháp Quy trình nghiên cứu thực theo bước sau: - Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 intron bệnh nhân hemophilia A thể nặng - Các bệnh nhân thể nặng không phát có đột biến đảo đoạn với bệnh nhân lại khuếch đại 26 exon gen F8, giải trình tự gen so sánh với trình tự gen F8 GenBank để phát đột biến điểm, đột biến đột biến thêm exon 2.1 Kỹ thuật tách chiết DNA - DNA tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân hemophilia A, sử dụng QIAGEN Kit - Kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tách chiết phương pháp đo quang máy NanoDrop: nồng độ DNA 300 - 380ng/ml; đánh giá độ tinh tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0 2.2 Kỹ thuật Inversion – PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22 gen F8 Quy trình kỹ thuật gồm bước Rosetti cộng [3] :(1) Cắt DNA enzym BclI, (2) Nối DNA T4 ligate, (3) Khuếch đại DNA phản ứng multiplexPCR với cặp mồi gen F8 (IU ID) cặp mồi gen F8 (IU ED) Hình ảnh điện di sản phẩm PCR DNA người bình thường có băng kích thước 487 bp, DNA bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron 22 cho băng kích thước 559 bp 2.3 Kỹ thuật PCR xác định đột biến đảo đoạn intron gen F8 Theo quy trình chuẩn Tizzano cộng [11]: DNA khuếch đại hai phản ứng multiplex PCR cho đoạn int1h - int1h - với mồi tương ứng: 9F, 9cR, int1h - 2F int1h 2F, int1h - 2R, 9F Với DNA người bình thường (khơng có đột biến đảo đoạn intron 1): phản ứng int1h - 1, mồi 9F mồi 9cR bắt cặp với khuếch đại đoạn gen có kích thước 1908 bp phản ứng int1h - 2, mồi int1h - 2F mồi int1h - 2R bắt cặp với khuếch đại đoạn gen có kích thước 1191 bp Người bị đảo đoạn intron1, mồi 9F mồi int1h2R nhân đoạn gen tái tổ hợp exon trình tự int1h có kích thước 1776 bp, mồi 9F int1h2R nhân đoạn gen tái tổ hợp exon trình tự int1h, có kích thước 1323 bp Như vậy, hình ảnh điện di sản phẩm PCR DNA người bình thường có băng ứng với kích thước 1908 bp 1191 bp, DNA bệnh nhân đảo đoạn intron có băng ứng với kích thước 1323 bp 1776 bp 2.4 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp 26 exon gen F8 giải trình tự với 38 cặp mồi theo quy trình: - Khuếch đại exon kỹ thuật PCR với cặp mồi tương ứng - Chạy PCR sequencing cặp mồi xi ngược - Giải trình tự máy ABI sequencer - So sánh kết thu với trình tự gen F8 Genbank (NG_011403) Đạo đức nghiên cứu Bệnh nhân người nhà hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân hồn tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân người nhà bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Kết xác định đột biến đảo đoạn intron 22 intron gen F8 Đột biến đảo đoạn intron 22: Hình Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR DNA bệnh nhân xác định đảo đoạn intron 22 gen F8 22 bệnh nhân hemophilia A thể nặng xét nghiệm phát đột biến đảo đoạn intron 22 gen F8 phương pháp Inversion-PCR M: Marker kích thước 100bp 14 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 1: Người bình thường 3, 7: đột biến đảo đoạn int22 2, 4, 5, 6, 8: đảo đoạn Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR gen F8 cho thấy: mẫu DNA giếng người bình thường, mẫu DNA giếng 2, 4, 5, 6, bệnh nhân không bị đảo đoạn intron 22, mẫu DNA giếng giếng bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron 22 Kết 9/22 bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn intron 22, chiếm tỉ lệ 41% Xác định đột biến đảo đoạn intron 1: 13/22 bệnh nhân thể nặng không bị đột biến đảo đoạn intron 22 tiếp tục xét nghiệm phân tích gen tìm đột biến đảo đoạn intron Hình Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR DNA bệnh nhân hemophilia A xác định đảo đoạn intron gen F8 M: Marker kích thước 1kb; giếng - 2, - 4, - - ứng với mẫu DNA bốn bệnh nhân Giếng 2, 4, 6, 8: băng điện di kích thước 1191 bp phản ứng int1h - giếng 1, 3, 5, 7: băng điện di kích thước 1908 bp phản ứng int1h - Hình ảnh điện di sản phẩm PCR DNA bốn bệnh nhân với phản ứng int1h - int1h - xuất băng ứng với đoạn DNA kích thước 1908 bp 1191 bp, DNA bốn bệnh nhân khơng có đột biến đảo đoạn intron Kết 13 bệnh nhân thể nặng đột biến đảo đoạn intron Kết phát đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A giải trình tự gen 13 bệnh nhân thể nặng xác định khơng có đột biến đảo đoạn intron 22 intron 1, bệnh nhân thể trung bình bênh nhân thể nhẹ (tổng cộng số bệnh nhân 21/30) giải trình tự tồn gen F8 để phát đột biến điểm Hình Hình ảnh giải trình tự gen F8 bệnh nhân mã số HE05 Kết cho thấy exon 23 bệnh nhân mã số HE05 có đột biến thay nucleotid G>A vị trí 108900 gen F8 15 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Hình ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân mã số HE05 có đột biến thay nucleotid G thành nucleotid A (G > A) vị trí 108900 exon 23 gen F8 (Hình 3A) Phần mềm CLC xác định thay đổi exon 23 c.6545 G > A, dẫn đến acid amin vị trí p 2182 protein yếu tố VIII từ Arginin thành Histidin (Hình 3B) Như bệnh nhân có đột biến exon 23 gen F8 vị trí c.6545 G > A (p.Arg2182His) Bảng Kết giải trình tự phát dạng đột biến gen F8 21 bệnh nhân Mã số bệnh nhân Exon Thay đổi nucleotid Thay đổi acid amin Thể bệnh HE 16 c.65 G > T p.Arg22Ile Nặng HE 02 c.223 G > T p.Asp75Tyr Trung bình HE 30 c.301 G > C p.Asn101His Nặng HE 06 c.386 A > T p.GLu129Val Nhẹ HE 12 c.446 C > T p.Pro149Leu Nặng HE 28 c.1268 insG p.Asp366Gly*Stop Nặng HE 25 12 c.1801 A > C p.Asn601His Nặng HE 03 14 c.2777 - insC p.Ser927Lys Nặng HE 17 14 c.2185 delG p.Ser729Ile Trung bình HE 01 14 c.3388 delA p.Arg1130Gly*fs Trung bình HE 18 14 c.3637 insA p.Ile1213Asn*fs Nặng HE 11 14 c.5093 T > C p.Ile1698Thr Nhẹ HE 04 14 c.5144 - delCTC p.Phe1672del Nặng HE 07 14 c.5177 G > A p.Trp1726Stopl Nặng HE 13 18 c.5953 C > T p.Arg1985Stop Nặng HE 09 22 c.6374 G > C pSer2125Thr Nặng HE 14 23 c.6545 C > T p.Arg2182Cys Trung bình HE 05 23 c.6545 G > A p.Arg2182His Trung bình HE 29 chưa phát đột biến Nặng HE 26 chưa phát đột biến Nặng HE 08 chưa phát đột biến Nhẹ Giải trình tự exon gen F8 21 bênh nhân phát 17 bệnh nhân bị đột biến điểm, bệnh nhân bị đột biến nucleotid, bệnh nhân không phát đột biến, đột biến công bố gây nên bệnh Trong 30 bệnh nhân hemophilia A phân tích gen F8 phát hiện: bệnh nhân thể nặng bị đột biến đảo intron 22, 17 bệnh nhân bị đột biến điểm (11 bệnh nhân thể nặng, bệnh nhân thể trung bình, bệnh nhân thể nhẹ), bệnh nhân thể trung bình bị đột biến nucleotid bệnh nhân chưa phát đột biến (2 bệnh nhân thể nặng bệnh nhân thể nhẹ) 16 IV BÀN LUẬN Hiện việc chẩn đoán hemophilia A thực số phòng thí nghiệm cách sử dụng phương pháp gián tiếp khai thác tiền sử, định lượng nồng độ yếu tố máu chảy - máu đông nồng độ yếu tố VIII huyết tương Các phương pháp bộc lộ nhiều hạn chế, khó chẩn đốn trường hợp không đủ thông tin từ phả hệ gia đình trường hợp hemophilia A mắc Bởi vậy, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen cho phép xác định vị trí đột biến TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 gen F8 gây bệnh hemophilia A với độ tin cậy xác cao Các nhà nghiên cứu đưa nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Đột biến đảo đoạn intron 22 intron 1, đột biến xóa đoạn thêm đoạn lớn dẫn đến bất hoạt làm đứt gãy gen F8 mã hóa tổng hợp protein yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A thể nặng Các đột biến điểm thay nucleotid, đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã kết thúc đột biến gây lệch khung dịch mã dẫn đến không tổng hợp tổng hợp protein khơng có chức năng; dạng đột biến chế gây bệnh hemophilia A thể vừa nhẹ Các nghiên cứu mối quan hệ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A kháng thể kháng yếu tố VIII cải thiện việc điều trị yếu tố VIII tái tổ hợp liệu pháp điều trị gen [12] Bệnh nhân hemophilia A thể nặng chiếm tỉ lệ cao thường bị đột biến đảo đoạn intron 22 intron gen F8, đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm 30 - 35% đột biến đảo đoạn intron chiếm khoảng - 2% [2] Do đó, việc làm trước tiên phân tích gen tìm đột biến đảo đoạn intron 22 intron Nghiên cứu sử dụng phương pháp Inversion PCR Rosetti cộng phát đột biến đảo đoạn intron 22 Kết 9/22 bệnh nhân chẩn đoán hemophilia A thể nặng bị đột biến đảo đoạn intron 22, chiếm 41% phù hợp với nghiên cứu nhiều tác giả trước công bố Áp dụng kỹ thuật Tizzano cộng sự, nghiên cứu khơng phát trường hợp có đột biến đảo đoạn intron 1, kết cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ Một nghiên cứu gần đưa tỷ lệ đột biến intron 1% [10; 11] 13 bệnh nhân hemophilia A thể nặng không phát có đột biến đảo đoạn intron, bệnh nhân thể trung bình, bệnh nhân thể nhẹ khuếch đại 26 exon gen F8 giải trình tự để tìm đột biến khác Có 17 bệnh nhân (11 bệnh nhân thể nặng, bệnh nhân thể trung bình, bệnh nhân thể nhẹ) tìm thấy bị đột biến thay nucleotid Hình minh họa kết xác định đột biến điểm gen F8 bệnh nhân phương pháp giải trình tự gen Bệnh nhân mã số HE 05 có đột biến thay nucleotid G thành nucleotid A (G > A) vị trí 108900 exon 23 Để kiểm tra khả làm thay đổi acid amin xác định vị trí mRNA chuỗi polypeptid bất thường bệnh nhân, nghiên cứu sử dụng phần mềm CLC so sánh NBCI Phần mềm CLC xác định vị trí nucleotid thay đổi exon 23 c.6545 G > A, dẫn đến protein yếu tố VIII vị trí p.2182 từ Arginin thành Histidin Như bất thường đột biến gây bệnh đột biến Tuddenham công bố năm 1994 [5] Từ kết luận bệnh nhân HE 05 có đột biến exon 23 gen F8 vị trí c.6545 G > A (p.Arg2182His) đột biến nguyên nhân gây bệnh hemophilia A bệnh nhân Các bệnh nhân khác có vị trí đột biến bảng công bố sở liệu HAMSTeRS CDC trang quản lý thông tin bệnh hemophilia A Anh Mỹ Có 3/21 bệnh nhân khơng phát đột biến, chiếm tỷ lệ 10% Như vậy, 27/30 bệnh nhân phát vị trí đột biến gen F8, chiếm tỉ lệ 90%, Anne Goodeve cộng sử dụng nhiều phương pháp khác để xác định đột biến toàn gen F8 exon, intron vùng khởi động promoter tỷ lệ không phát đột biến ÷ 7% [14] Tỷ lệ khơng phát đột biến nghiên cứu cao so với Anne Goodeve phù hợp với công bố Maurizio Margaglione nghiên cứu 1296 bệnh nhân Hemophilia A Italia 11% [15] V KẾT LUẬN Với kỹ thuật xác định đảo đoạn intron 22, intron giải trình tự tồn 26 exon gen F8, nghiên cứu phân tích gen 30 bệnh nhân hemophilia A phát bệnh nhân thể nặng bị đột biến đảo intron 22, 17 bệnh nhân bị đột biến điểm (11 bệnh nhân thể nặng, bệnh nhân thể trung bình, bệnh nhân thể nhẹ), bệnh nhân thể trung bình bị đột biến nucleotid bệnh nhân chưa phát đột biến (2 bệnh nhân thể nặng bệnh nhân thể nhẹ) Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A” nhóm nghiên cứu xin tran trọng giúp đỡ cán trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, mơn Hố sinh, trường Đại học Y Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Miao Liang Liu, Michael EP, Murphy, et al (1998) A domain mutations in 65 haemophilia A families and molecular modelling of dysfunctional factor VIII proteins rt h rn H t g 103, 1051 - 1060 Shin YL, Yi NS, Chia CH, et al (2008) Mutation spectrum of 122 hemophilia A families from Taiwanese population by LD-PCR, DHPLC, multiplex PCR and evaluating the clinical application of HRM n t (53), 205 - 220 Dezsö D,Célia V, Isabel M, et al (2006) The spectrum of mutations and molecular pathogenesis of hemophilia 17 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 A in 181 Portuguese patients.H t g 91, 840 - 843 Zhihui H, Juan C , Shiyan X, et al (2013) A Strategy for the Molecular Diagnosis in Hemophilia A in Chinese Population C h h 65, 463 – 472 Tuddenham EG, Cooper DN (1994) Haemophilia A: database of nucleotide substitutions, deletions, insertions and rearrangements of the factor VIII gene, second edition N 22, 3511 - 3516 Liu Q, Nozari G, Sommer S (1998) Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in haemophilia A 92, 1458 – 1459 Tizzano EF, Domenech M, Baiget M (1995) Inversion of intron 22 in isolated cases of severe hemophilia Thr H t 73, – Bowen DJ, Keeney S (2003) Unleashing the longdistance PCR for detection of the intron 22 inversion of the factor VIII gene in severe haemophilia Thr H t 89, 201 – 202 Antonarakis SE, Rossiter JP, Young M, et al (1995) Factor - VIII gene inversions in severe hemophilia - A: results of an international consortium study 86, 2206 - 2212 10 Rossetti LC, Radic CP, Larripa IB, De Brasi CD (2005) Genotyping the Hemophilia Inversion Hotspot by Use of Inverse PCR H t n Thr 154 – 158 11 Tizzano EF, Cornet M, Baiget M (2003) Inversion of intron of the factor VIII gene for direct molecular diagnosis of hemophilia A H t g 88(1), 118 - 120 12 Kaufman RJ, Pipe SW (1998) Can we improve on nature? Super molecules of factor VIII H h 4, 370 - 379 13 Repesse Y, Slaoui M, Ferrandiz D (2007) Factor VIII (FVIII) gene mutations in 120 patients with hemophilia A: detection of 26 novel mutations and correlation with FVIII inhibitor development Thr H t 5, 1469 – 1476 14 Anne Goodeve (2008) Molecular genetic testing of Hemophilia A Thr n H t 34, 491 - 501 15 Maurizio Margaglione, Giancarlo Castaman, Massimo Morfini, et al (2008) The Italian AICE Genetics Hemophilia A database: results and correlation with clinical phenotype H t g 93(5), 722 - 728 Summary MUTATION ANALYSIS OF F8 GENE IN HEMOPHILIA A PATIENTS Hemophilia A is an inherited recessive X-linked disease caused by mutation of gene F8 with an incident rate of one in 5,000 males So far, many studies on gene mutations have been reported worldwide, but a study with all types of mutation has not been published in Vietnam The aim of this study is to detect mutation of gene F8 in Viet Nam Hemophilia A patient 30 Hemophilia A patients were selected for this study Inversion-PCR, multiplex PCR and direct sequencing were used to detect mutation in F8 gene The results showed that patients were found to have intron 22 inversion, 17 patients had point mutation, had small deletion, remaining patients were not detected for any mutation in F8 gene Keywords: Hemophilia A, F8 gene mutation 18 ... Giancarlo Castaman, Massimo Morfini, et al (2008) The Italian AICE Genetics Hemophilia A database: results and correlation with clinical phenotype H t g 93(5), 722 - 728 Summary MUTATION ANALYSIS... thường đột biến gây bệnh đột biến Tuddenham công bố năm 1994 [5] Từ kết luận bệnh nhân HE 05 có đột biến exon 23 gen F8 vị trí c.6545 G > A (p.Arg2182His) đột biến nguyên nhân gây bệnh hemophilia A. .. phát đột biến Nặng HE 08 ch a phát đột biến Nhẹ Giải trình tự exon gen F8 21 bênh nhân phát 17 bệnh nhân bị đột biến điểm, bệnh nhân bị đột biến nucleotid, bệnh nhân không phát đột biến, đột biến

Ngày đăng: 15/01/2020, 16:28

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan