Đang tải... (xem toàn văn)
Alpha thalassemia (α thalassemia) là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên do giảm hoặc mất hoàn toàn sự tổng hợp chuỗi α globin. Cho đến nay, hơn 35 loại đột biến được phát hiện trên gen α globin gây bệnh α thalassemia. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định một số đột biến phổ biến trên gen α globin ở bệnh nhân α thalassemia bằng kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR. 33 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là α thalassemia được lựa chọn vào nghiên cứu để xác định đột biến. Kết quả cho thấy 27/33 trường hợp mang đột biến chiếm 82,82% với 3 loại ñột biến phổ biến trên gen α globin. ðột biến SEA 54,7%, α4.2 (28,6%), α3.7 (16,7%), chưa phát hiện được một biến THAI, FIL..
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT HIỆN ðỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH ALPHA THALASSEMIA Bùi Thị Minh Phượng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Thị Thúy Hằng, Trần Vân Khánh Trường ðại học Y Hà Nội Alpha thalassemia (α thalassemia) bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên giảm hoàn toàn tổng hợp chuỗi α glob in Cho ñến nay, 35 loại ñột biến ñược phát gen α globin gây bệnh α thalassemia Nghiên cứu ñược thực nhằm xác ñịnh số ñột biến phổ b iến gen α globin bệnh nhân α thalassemia b ằng kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR 33 b ệnh nhân chẩn đốn xác định α thalassemia lựa chọn vào nghiên cứu ñể xác ñịnh ñột b iến Kết cho thấy 27/33 trường hợp mang ñột b iến chiếm 82,82% với loại ñột b iến phổ biến gen α globin ðột b iến SEA 54,7%, α4.2 (28,6%), α3.7 (16,7%), chưa phát ñược ñột biến THAI, FIL Từ khóa: Alpha thalassemia, Multiplex PCR I ðẶT VẤN ðỀ Alpha thalassemia (α thalassemia) bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể t hường ñột biến gen α globin, gây giảm hoàn toàn tổng hợp chuỗi globin α ðây bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố toàn giới Việt Nam khu vực châu Á [1] Theo thống kê: tỷ lệ người mang gen đột biến đoạn lớn dạng SEA (ðơng Nam Á) cao (tỷ lệ 90% - 95%), Bắc Thái Lan (14%), Nam Trung Quốc (5,0 - 8.8%), Hồng K ông (4,5%), Trung tâm Thái Lan (3,7%) dạng Bắc ðài Loan (3,5%) [1; 2] Tại Việt Nam, số nghiên cứu cơng bố có đột biến gây bệnh α thalassemia gồm SEA, α4.2, α3.7, chưa phát ñột biến THA I, FIL [3; 4] Alpha thalassemia bệnh thiếu máu tan máu nặng chư a có sống phụ thuộc vào việc truyền máu t hải sắt suốt đời, người bệnh có chất lượng sống thấp ñồng thời gánh nặng cho gia đình xã hội [3; 4] Xác định đột biến gen bệnh nhân ñể tiến tới phát người lành mang gen bệnh chẩn đốn trước sinh nhằm có nhữ ng tư vấn di t ruyền t hích hợp đóng vai trò quan trọng giúp ngăn ngừa làm giảm tỷ lệ mắc bệnh Phương pháp multiplex ARMS - P CR ñã ñược sử dụng rộng rãi ñể phát ñột biến gen gây bệnh α thalassemia độ xác cao, giá thành rẻ phức tạp [5] Xuất phát từ thực tiễn trên, nghiên cứu ñược tiến hành với mục tiêu: Xác ñịnh số ñột biến phổ biến gen α globin bệnh nhân α thalassemia kỹ thuật multiplex ARMS - PCR II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP phương pháp ñiều trị triệt để Alpha thalassemia thể nặng trung bình thường biểu thiếu máu từ trung bình đến nặng, ðối tượng 33 bệnh nhân chẩn đốn mắc bệnh α thalassemia Khoa Huyết học, Truyền máu, Bệnh viện B ạch Mai Bệnh viện Huyết học, ðịa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội Email: vankhanh73md@yahoo.com Ngày nhận: 22/7/2015 Ngày ñược chấp thuận: 9/9/2015 Truyền máu Trung ương dựa vào triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng điển hình Nghiên cứu có sử dung DNA người bình thườ ng để làm mẫu ñối chứng TCNCYH 96 (4) - 2015 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Phương pháp diện alen ñột biến ñược biểu sản phẩm DNA khuyếch đại với kích 2.1 K& thu*t tách chi.t DNA thước khác ñã biết trước (biểu ñồ 1) [5] + DNA ñược tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân α thalassemia sử dụng Kit tách chiết hãng QIAGEN (ðức) + Kiểm tra nồng ñộ ñộ tinh DNA ñược tách chiết phương pháp ño quang máy NanoDrop: nồng ñộ DNA 300380ng/ml, ñánh giá ñộ tinh tỷ lệ A260nm /A280nm = 1.8 2.2 K& thu*t multiplex ARMS - PCR 2.2.1 Thiết k ế mồi Mồi ñược thiết kế nhằm phát ñột biến t hường gặp Việt Nam với mồi ñặc hiệu bổ sung với ñột biến Các ñột biến là: α3.7, α4.2 , SEA, FIL & THAI - Mồi LIS: Khuy ếch ñại ñoạn gen tổng hợp protein lis ðây protein có tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên c hỉ Kỹ thuật multiplex A RMS - P CR ñược gen nội chuẩn, dùng ñể kiểm tra chất lượng dùng ñể sàng lọc diện nhiều ñột thao tác thực qui trình, kích t hước biến phản ứng Mỗi phản ứng 2.3kb - Mồi α2: Xác ñịnh thể ñột biến xuất dùng mồi đặc hiệu có trình tự đầu bổ sung với alen ñột biến mồi chung ñồ ñiện di ñột biến có ngược chiều với mồi đặc hiệu alen Sự kiểu gen dị hợp tử, kích thước khoảng 1.8kb Sơ ñồ Tổ hợp gen α globin vị trí mồi xác định đột biến A, Vị trí mồi xác ñịnh ñột biến; B, chiều dài tương ứng ñột biến ñoạn lớ n (α3 7, α 4.2 , SEA, FIL & THA I) Cặp mồi ñể xác ñịnh ñột biến phải dài ñoạn gen bị đột biến nằm ngồi vị trí đoạn gen ñột biến (ví dụ cặp mồi THA I-F THAI-R dùng ñể xác ñịnh ñột biến THAI FIL - F FIL - R dùng ñể xác ñịnh ñột biến FIL ) 2.2.2 Kỹ thuật multiplex A RMS - PCR 15 phút 40 giây, bám mồi 65o 90 Thành phần phản ứng gồm: nước cất 3µl, giây, kéo dài 72o C phút 30 giây,cuối master Mix Quiagen Taq 6µl, DNA 2µl, DMSO kéo dài 72oC phút Sau 1µl, primer LIS 1µl, primer α2/α3.7 1µl, primer nhân DNA đích, điện di sản phẩm DNA α2 1µl, primer α4.2 1µl, primer SE R 1µl, agarose gel 2% phân tích kết primer THA I 1µl, primer FIL 1µl Thực 35 ðạo ñức nghiên cứu o chu kỳ gồm giai ñoạn duỗi xoắn 95 C TCNCYH 96 (4) - 2015 Các đối tượng tham gia hồn tồn tự nguyện TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC có quyền rút khỏi nghiên cứu khơng đồng ý tham gia nghiên cứu Các thông tin liên quan ñến bệnh nhân ñược ñảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Trong số 33 bệnh nhân, ñã phát ñược 27/33 (82,82%) bệnh nhân có đột biến đoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia Bảng Các loại ñột biến kiểu gen phát gen α globin Dạng ñột biến SEA Dị hợp tử ñơn (n = 9) ðồng hợp tử (n = 4) Kiểu gen Số lượng α SEAα//α SEAα α 4.2 4.2 3.7 3.7 α α//α α α 3.7 α α//α α SEA α SEAα SEA//αα α 4.2 α 4.2α 4.2//αα 3.7 3.7 α 3.7 Dị hợp tử kép (n = 14) 4.2 α α //αα SEA SEA α 4.2 SEA/α 4.2 α //α α SEA/α 3.7 α SEAα SEA//α 3.7α α 4.2/α 3.7 α 3.7α//α4.2α Bệnh nhân có đột biến Tổng 27 Bệnh nhân khơng phát thấy đột biến 33 Các ñột biến t hườ ng gặp t rên gen α globin nhóm nghiên u đột biến SEA, α4.2, α3.7 Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử ñơn, ñồng hợp tử dị hợp tử kép kết hợp Biểu ñồ Tỷ lệ thể bệnh α Thalassemia 10 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong số 27 trường hợp phát đột biến có trường hợ p (15%) bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử, trường hợ p (33% ) ñột biến dị hợp tử 14 (52%) dị hợp tử kết hợp Tất 14 trường hợ p dị hợp tử kép gây thể HbH Biểu ñồ Tỷ lệ ñột biến bệnh nhân α Thalassemia Trong số loại ñột biến phát có 23 trường hợp đột biến SEA chiếm 54,7%; 12 trường hợp mắc ñột biến α4.2 chiếm 28,6%; trường hợp ñột biến α3.7 chiếm 16,7% IV BÀN LUẬN có khác biệt so với nghiên cứu Lý Thị dụng ñể phát loại ñột biến phổ biến gây Thanh Hà (5,9%), nghiên cứu Malaysia bệnh α thalassemia Nhóm nghiên cứu sử (0,25% ) nghiên cứu Chines (1,36%) [7; dụng kỹ thuật Multiplex ARMS - P CR ñã phát ñược 27/33 trường hợp bệnh nhân 9; 10] ðột biến α 3.7 chiếm tỷ lệ 16,7% tương ñối cao s o với nghiên cứu Lý có đột biến chiếm 82,82% Thị Thanh Hà (khơng phát được), nghiên Mẫu nghiên cứu chúng tơi thể HbH (dị hợ p tử kép), t hể dị hợp tử ñơn, cứu Malaysia (8% ) nghiên cứu Chines (2,7%) [3; 11] đồng hợp tử tất bệnh nhân Chưa t ìm thấy ñột biến THAI, FIL tình trạng thiếu máu nặng, thiếu máu vừa các bệnh nhân nghiên cứu Kết số xét nghiệm ñều giảm, kết ñiện di tương ñương với kết c Lý Thị Thanh huyết sắc tố HbA1 < 97%, HbA2 < 3%, có HbH Hà ðiều chứng tỏ đột biến Thai ñột thể HbH ñã ñược phát gen ñột biến biến FIL chưa phát thấy Việt Nam Hai tương ứng với ñặc ñiểm bệnh [2; 6] loại đột biến thường có tộc người Thái ðột biến SEA chiếm tỷ lệ cao 54,7% 2015 ðột biến α 4.2 chiếm tỷ lệ cao thứ 2: 28,6% Kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR ñược sử Lan Philipphin [12; 13] tương ứng nghiên cứu Lý Thị Thanh Ngoài loại ñột biến t rên nghiên cứu Hà cộng 58,8% Tuy nhiên, kết Lý Thị Thanh Hà phát có khác biệt với nghiên cứu thêm loại ñột biến ñiểm HbQs HbCs Malaysia (0, 5%) Chines (1,36%) ðiều cho thấy Việt Nam ñột biến SEA chiếm [3] Tuy nhiên, nghiên cứu c hưa tìm loại đột biến Vì thời gian chủ yếu [3; 7; 8] nghiên cứu chưa ñủ nên tiếp tục TCNCYH 96 (4) - 2015 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nghiên cứu để t ìm thêm c ác loại đột biến khác Do ñặc ñiểm phân bố gen α globin nhiễm sắc thể, nên biểu thể bệnh đa dạng β Thalassemia Có t hể α 1, α 2, thể HbH, thể Bart’s Trong thể α ñồng hợ p tử chiếm 15%, dị hợp tử ñơn chiếm 33%, dị hợp tử kép (HbH) chiếm 52% Theo Schneider cs người Mỹ da ñen tỷ lệ mang gen α Thalaasemia từ ñến 7%, hầu hết gặp bệnh HbH [7; 14; 15] Việc xuất bệnh HbH phụ thuộc vào người mang gen α Thalassemia (ñể người có k kết với nhau) mà phụ thuộc vào kiểu gen α cis hay α trans có mặt quần thể [16] V KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Công Khanh (2008) Bệnh hemoglobin Huyết học lâm s àng nhi k hoa Nhà xuất Y học, 127 - 146 Nguyễn Công Khanh (1993) Tần suất bệnh hemoglobin Việt Nam Y học Việt Nam, 174 (8), 11 - 16 Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai cộng (2010) Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đốn trước sau sinh bệnh alpha Thalassemia bệnh viên Nhi Trung ương Tạp chí Nhi k hoa, 3(3), 337 - 342 Bạch Quốc Tuyên., ðặng ðức Quý, Nguyễn ðình Lượng (1974) Một số trường hợp huyết sắc tố bình thường phát bệnh viện Bạch Mai Cơng trình nghiên c ứu huyết học truyền máu 1963 - 1974, Nhà Nghiên cứu ñã phát ñược 27/33 trường hợp mang gen ñột biến với loại ñột xuất Y học, Hà Nội biến đó: jindadamrongwech, Suporn Chuncharunee ðột biến SEA 23/42 c tỷ lệ cao 54,7% ðột biến α4.2 chiếm tỷ lệ 28,6% et al (2012) Multiplex A RMS - PCR A nalysis 16,7% ñột biến α3.7 nal of Hematology and Tranfusion Medicine, Trong số 27 bệnh nhân phát mang ñột biến gen α-globin phát ñược 15% Anchalee Thedsawad, Sumalee for Nineteen β - Thalassemia Mutation Jour22 (1), - 38 Chui DH, Waye JS (1998) Hydrops ñồng hợp tử; 33% mang dị hợp tử ñơn fetalis 52% dị hợp tử kép emerging health care problem Blood, 91, Lời cảm ơn caused by alpha-thalassemia: an 2213 - 2222 H.M Aderson H.M Ranney (1990) Huyết học, Truyền máu, B ệnh viện Bạch Mai Southeast Asian Iminmgarant: The new thalassemia in American, S eminars in Hemat ol- B ệnh viện Huyết học, Truyền máu Trung ogy, 27, 239 - 246 Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Khoa ương giúp đỡ q trình thực Flatz G (1965) Hemoglobinophathiess nghiên cứu ðề tài ñược thực với hỗ in Thai Lhann Br J Haematol, 11, 216 - 217 trợ kinh phí ñề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu số số sinh học, trình tự David J R (1977) The moleculer mechanism of α thalassemia in the black gen ty thể người Việt Nam trưở ng thành Blood, 50, 105 ñột biến gen gây bệnh thalassemia” thuộc ñề 10 Die sseroth A (1976) Hemoglobin syn- tài nhiệm vụ Quỹ gen “ðánh giá ñặc ñiểm di thesis in somatic cell hy brid: independent seg- truyền người Việt Nam” 12 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC regation of the human alpha and bet a globin lassemia Hà Nội Luận văn Tiến sỹ k hoa gene Science, 191, 1262 học, Trường ñại học Y Hà Nội, 36 - 42 11 Embury S.H (1979) Organization of 14 Hurst d (1991) Anaemia and hemoglo- the α globin gen in the chines α thalassemia bin parties in Southeast Asian refugee c hil- syndromes J.Clin.Invest, 63 12 Chui DH, Waye JS (1998) Hydrops dren The J.of Paediatrics, 102 (5), 692 fetalis caused by alpha-thalassemia, an emerging health care problem Blood, 91, 2213 - 2222 15 David J R (1977) The moleculer mechanism of α thalassemia in the black Blood, 50, 105 13 Dương Bá Trực (1996) ðặc ñiểm lâm 16 Told D.Lai MCS, Braga C.A, Soo N.H sàng huy ết học bệnh HbH trẻ em Việt (1969) Alpha thalassemia in Chinese cord Nam, Bước đầu tìm hiểu tần suất alpha tha- blood studies Br J.Haemat ol, 16, 551 - 556 Summary MOLECULAR DIAGNOSIS OF ALPHA-THALASSEMIA BY MULTIPLEX ARMS-PCR Alpha-thalassemia (α -thalassemia) is an autosomal recessive blood disorder that is characterized by an absence or a reduction in α-globin chain synthesis More than 35 different mutations located within the α-globin gene are currently recognized throughout t he world as causes for α-thalassemia The purpose of this study is to detect common mutations in α-globin using Multiplex ARMS - P CR 33 unrelat ed patients with α-thalassemia were selected for this study The results showed that 27 out of 33 patients having mutation, it accounted for 82.82% with common mutations in α-globin gene The most frequent mutations are SEA 54.7%, α4.2 (28.6%), α3.7 (16.7% ) Keywords: Alpha thalassemia, Multiplex PCR 2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 13 ... đến bệnh nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Trong số 33 bệnh nhân, ñã phát 27/33 (82,82%) bệnh nhân có đột biến ñoạn gen α globin gây bệnh α thalassemia Bảng Các loại ñột biến kiểu gen phát gen. .. 3.7α//α4.2α Bệnh nhân có đột biến Tổng 27 Bệnh nhân khơng phát thấy đột biến 33 Các ñột biến t hườ ng gặp t rên gen α globin nhóm nghiên u đột biến SEA, α4.2, α3.7 Bệnh nhân có đột biến dị hợp... gây thể HbH Biểu ñồ Tỷ lệ ñột biến bệnh nhân α Thalassemia Trong số loại ñột biến phát có 23 trường hợp đột biến SEA chiếm 54,7%; 12 trường hợp mắc ñột biến α4.2 chiếm 28,6%; trường hợp ñột biến