Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu nhằm phát hiện đột biến gen ATP7B trên 6 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh Wilson trong cùng một gia đình. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.
TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON Phan Tơn Hồng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Lê Văn Hưng Nguyễn Ngọc Hùng, Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh Trư ng h YH N n nh tr tr ng tr ng tr nh ụ t h th n nh n TP t g n nh t g n TP g n n n tr n nh th thư ng g h tr nh h th h n h t n g n TP tr n nh nh n h h ng 21 h n t h th nh nh n -4 C C tr n n1 45 n n t n g n TP nn tr th tr ng tr ng th Ngh n th h n n nh n tr ng ng h 21 n g n n h PC g h th n t n ng h t tr n n n h n tg tr nh tr n Từ khóa: gen ATP7B, bệnh Wilson, đột biến gen I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Wilson hay bệnh rối loạn chuyển hóa đồng, bệnh lý liên quan đến tổn thương gen Đây bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể (NST) thường, đồng tích tụ số quan thể, đặc biệt gan não, gây nhiều biến chứng Trên giới, tần suất mắc bệnh dao động khoảng 1/30.000 ÷ 1/100.000 người [1] Ở Việt Nam, nghiên cứu lâm sàng chủ yếu tập trung vào đặc điểm lâm sàng [2] Năm 2010, lần phát hai trường hợp bệnh nhân có đột biến gen Arg778Leu [3] Các nghiên cứu sau xác định đột biến số vùng đột biến trọng điểm hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen ATP7B Năm 2011,trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein thuộc trường Đại học Y Hà Nội tiến hành nghiên cứu phát đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson [4; 5] Về sinh bệnh học phân tử, nguyên nhân gây bệnh Wilson thiếu hụt enzym ATPase typ P (P - ATPase), mã hóa gen ATP7B NST 13q14.3 Enzym P - ATPase đóng vai trò vận chuyển đồng qua màng tế bào Sự thiếu hụt giảm hoạt tính enzym dẫn đến giảm tiết đồng từ tế bào gan vào mật gây ứ đọng đồng gan Khi lượng đồng gan tăng mức, đồng theo hệ thống tuần hoàn tới quan như: não, mắt, thận gây tổn thương cho quan Chẩn đoán bệnh Wilson dựa triệu h YH h Ng nh Ng h h 30 n h Tr n H Th nh N th nh h n 24 2014 th n 11 2014 nH nh trư ng chứng lâm sàng gan, não, vòng Kayser - Fleischer mắt xét nghiệm hóa sinh máu (nồng độ đồng nước tiểu 24 giờ, hàm lượng ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng gan) [6] Đột biến điểm đột biến thường gặp gen ATP7B chủ yếu sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phát đột biến, nhiên đột biến nằm rải rác khắp chiều dài gen ATP7B nên cần phải giải trình tự tồn gen ATP7B với 21 exon phát đột biến nên tốn thời gian Các nghiên cứu mức độ sinh học phân tử cần thiết đề xác định xác đột biến gây bệnh giúp cho cơng tác điều trị xác định người lành mang gen bệnh để có tư vấn di truyền thích hợp Bởi đề tài thực nhằm mục tiêu: Phát đột biến gen ATP7B bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh Wilson II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Nhóm bệnh: bệnh nhân gia đình, chẩn đốn mắc bệnh Wilson dựa vào triệu chứng lâm sàng xét nghiệm hóa sinh máu Nhóm chứng: người bình thường, tiền sử gia đình khơng có người mắc bệnh di truyền Phương pháp 2.1 Quy trình lấy mẫu: Bệnh nhân lấy 2ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA Quy trình đảm bảo tuyệt đối vơ trùng 2.2 Quy trình tách chiết DNA tổng số: Quy trình tách chiết DNA tổng số tiến hành theo quy trình phenol/chloroform Nồng độ độ tinh DNA kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260/280) TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 2.3 Quy trình giải trình tự gen xác định đột biến + Kỹ thuật PCR: Toàn 21 exon gen ATP7B khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu Quy trình phản ứng PCR tích 20μl chứa thành phần: 20ng cDNA, 50ng primer, 200μmol/L dNTPs, đơn vị enzym Taq polymerase (do hãng Qiagen cung cấp), 2μL GeneAmp 10xBuffer (gồm 10mmol/L Tris- HCl μl 10 X buffer, pH 8,2 50 mmol/L KCl) Chu trình nhiệt phản ứng sau: Đầu tiên giai đoạn biến tính 96°C phút, 35 chu kỳ gồm biến tính 96°C phút; gắn mồi 60°C phút bước kéo dài 72°C phút, cuối giai đoạn hoàn chỉnh 72°C phút bảo quản tạm thời sản phẩm PCR 4°C + Kỹ thuật giải trình tự gen: sản phẩm PCR tinh từ gel sử dụng Kit QIAGEN Sản phẩm sau tinh giải trình tự trực tiếp máy ABI 3100 Genetic Analyzer Kết thu thập xử lý phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 BLAST NCBI Đạo đức nghiên cứu Bệnh nhân người nhà hoàn tồn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân người nhà bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ 21 cặp mồi đặc hiệu sử dụng để khuyếch đại gen ATP7B bệnh nhân mã số W7.00 Kích thước sản phẩm PCR khoảng 100÷200 bp Hình minh họa sản phẩm PCR exon gen ATP7B Hình Hình ảnh đai diện sản phẩm PCR khuếch đại exon gen ATP7B C: mẫu đối chứng, - 7: mẫu bệnh nhân, MarkerФ174 Sản phẩm khuếch đại exon thu đặc hiệu, rõ nét đảm bảo cho phản ứng sequencing để phát đột biến điểm Sản phẩm PCR toàn 21 exon gen ATP7B bệnh nhân mã số W7.00 tinh tiến hành giải trình tự gen Kết cho thấy có đột biến điểm dị hợp tử ins47-48CGGCG exon c.1523G>C (p.Val456Leu) Hình Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon exon bệnh nhân mã số W7.00 31 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Chú thích: Mũi tên thẳng đứng vị trí đột biến, chữ số mũi tên vị trí nucleotid acid amin thay đổi Đột biến dị hợp tử thêm nucleotid CGGCG sau vị trí 47 exon (NM-000053, GeneBank) làm thay đổi khung dịch mã Đây đột biến chưa công bố ngân hàng liệu bệnh Wilson (wilsondiseas.med.ualberta ca) Đột biến dị hợp tử thứ hai thay G > C vị trí 1523 (c.1523G > C, NM_000053, GeneBank) exon làm cho ba vị trí 456 mã hóa Valine chuyển thành Leucin (p.Val456Leu) Hình Phả hệ gia đình bệnh nhân Wilson mã số W7.00 Phả hệ gia đình gồm hệ, bệnh nhân phát đột biến gen ATP7B hệ thứ tư (IV.1) Phả hệ có người mắc bệnh theo chẩn đoán lâm sàng (III - 1, III - 3, III - 5, II - 8, IV - 1, IV - 3, IV - 4), 15 người bình thường (I.1, I.2, II.1, II.2, II.3, II.4, III.2, III.4, III.6, III.7, III.9, III.10, IV.2, IV.5, V.1 IV BÀN LUẬN Cho đến nay, khoảng 500 đột biến tìm thấy bệnh nhân mắc bệnh Wilson [7; 8] Mỗi quốc gia, chủng tộc người khác có loại đột biến khác Đột biến p.His1069Glu đột biến thường gặp quần thể nguời da trắng, chiếm khoảng 37% đến 63% tổng số đột biến Trên quần thể người Trung Quốc, đột biến p.Arg778Leu chiếm 34 ÷ 38% tống số đột biến [9; 10] Protein ATP7B mang đầy đủ đặc điểm đặc trưng cho protein thuộc họ protein P - APTase với vùng chức chính: Vùng MBSs (vị trí bám cho nguyên tử đồng), vùng N (vùng bám ATP), vùng P (vùng phosphor hóa), vùng A (vùng khử phosphor) vùng xuyên màng (nằm exon: exon ÷ exon 12 exon 19, exon 20) [1] Đột biến thêm nucleotid c.47 - 48insCGGCG nằm exon gen ATP7B, vùng nằm trước vị trí bám phân tử đồng, đột biến gây lệch khung dịch mã tạo mã kết thúc sớm dẫn đến protein P - ATPase không tổng hợp Với 32 trường hợp bệnh nhân có đột biến dị hợp tử tức có alen bị đột biến chức alen lại có chức bình thường, thường khơng ảnh hưởng đến kiểu hình Tuy nhiên kết hợp đột biến dị hợp tử tạo “cộng hưởng” ảnh hưởng tới hình thành protein P - ATPase gây nên bệnh lý nguyên nhân ảnh hưởng đến nồng độ ceruloplasmin huyết Đột biến thay thế, p.Val456Leu công bố đột biến không gây bệnh (non disease variant) Tuy nhiên, đột biến xuất với đột biến khác, yếu tố làm tăng thêm mức độ nặng bệnh, thể qua tụt giảm nồng độ ceruloplasmin huyết Đột biến xuất bệnh nhân Wilson, khơng có người bình thường, điều chứng tỏ biến dị hay SNP (single nucleotide polymorphism) đặc trưng quần thể người mắc bệnh Wilson [11] Bệnh nhân Wilson nhận alen bệnh người bố alen bệnh người mẹ hai alen bệnh người bố người mẹ Bố, mẹ TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 bệnh nhân mang gen đồng hợp lặn gen dị hợp Các anh chị em bệnh nhân mang gen bệnh khơng Những người mang gen bệnh có khả di truyền cho cháu Một điểm khác biệt so với nhiều bệnh di truyền khác người mang gen dị hợp tử biểu bệnh thường kèm theo dạng đột biến khác [1; 12] Theo nhận định trên, phả hệ gia đình bệnh nhân Wilson cho thấy: để người hệ IV mắc bệnh, chồng bệnh nhân (III.2, III.4) phải người mang gen bệnh Tương tự, cặp vợ chồng hệ II(II.2, II.4) phải người mang gen bệnh theo quy luật Menden Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu có giả thuyết khác để lý giải tính di truyền phả hệ gia đình bệnh nhân số W7.00: dựa vào tính chất cá thể dị hợp (heterozygous) Khái niệm bị nhầm lẫn với người lành mang gen bệnh (Carrier) Cá thể dị hợp y sinh học di truyền tượng alen lặn chứa hai đột biến dị hợp tử, nằm vị trí (locus) có khả gây bệnh lý di truyền Ở cá thể này, hai đột biến dị hợp tử gen thuộc hai alen khác (nghĩa hai allen mang đột biến nằm vị trí khác nhau) [13] Đặc điểm cho thấy tính đa dạng di truyền bệnh lý di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường Bệnh hình thành sau nhiều lần trao đổi chéo – hoán vị gen So với các thể mang đột biến đồng hợp tử gen lặn, cá thể dị hợp tử, bệnh xuất muộn biểu lâm sàng nhẹ Khái niệm giải thích rõ xuất bệnh hệ thứ III IV phả hệ gia đình số W7.00 Các bệnh nhân hệ IV mang gen chứa đồng thời hai đột biến dị hợp tử allen (do trao đổi chéo – hoán vị gen) nhận từ người mẹ (thế hệ III) Những người mẹ nhận đột biến dị hợp từ người mẹ (thế hệ II) - người mang đặc điểm cá thể dị hợp Điều cần kiểm chứng lâm sàng người thuộc thệ II nghiệp khoa học cấp Bộ Y tế năm 2012 - 2013 giúp đỡ nghiên cứu viên Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội V KẾT LUẬN 10 Lei Wan, Chang - Hai Tsai, Yuhsin Tsai (2006) Mutation analysis of Taiwanese Wilson disease patients h n h r h C n t n 345, 734 - 738 Nghiên cứu phát dạng đột biến điểm dị hợp tử: ins47 - 48CGGCG exon p.V456L exon bệnh nhân Wilson gia đình Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Bộ: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson Việt Nam, kinh phí từ ngân sách Sự TÀI LIỆU THAM KHẢO Bull P, Thomas G R, Forbes J, Rommens J M, Cox D W (1993) The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes disease gene N t r n t 5, 327 - 337 Lê Đức Hinh (1989 - 1990) Một số đặc điểm bệnh Wilson Việt Nam ng tr nh ngh n h h 3, 316 - 334 Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2010) Đột biến gen R778L bệnh nhân Wilson Việt Nam T h Nh h 3, 231 - 235 Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2011) Xây dựng quy trình xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson T h Ngh n Yh 74(3), 26 - 29 Nguyễn Thị Mai Hương, Ngô Diễm Ngọc, Nguyên Phương Mai, cộng (2013) Xác định đột biến gen ATP7B vùng hot-spots bệnh nhân Wilson T h Yh tN 407(2), 132 - 135 Cumings JN (1951), The effects of B.A.L in hepatolenticular degeneration r n 74(1), 10 – 22 Peter Ferenci (2006), Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson disease: impact on genetic testing, H n t 120, 151 - 159 Aftab Ala, Ann P Walker, Keyoumars Ashkan, et al (2007) n n t 369, 397 – 408 Danadevil Kuppala, Jie Deng, George J Brewer, (2009) Wilson Disease Mutations in the American Population: Identification of Five Novrl Mutation in ATP7B, Th nH t g rn 1, - 11 Liu HP, Lin WY, Wang WF, Tsai FJ (2013) Genetic variability in copper-transporting P-type adenosine triphosphatase (ATP7B) is associated with Alzheimer’s disease in a Chinese population g H t g nt 27(2), 319 - 327 12 G Loudianos, V Dessi, M Lovicu, A and A Cao (1999) Mutation analysis in patients of Mediterranean descent with Wilson disease, identification of 19 novel 33 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 mutations, n t 36(11), 833 – 836 13 Rossi E, Olynyk JK, Cullen DJ, Powell LW (2000) Compound heterozygous hemochromatosis genotype predicts increased iron and erythrocyte indices in women, C n Ch tr 46 (2), 162 – 166 Summary MUTATION ANALYSIS OF ATP7B GENE IN A FAMILY WITH WILSON DISEASE Wilson disease is an autosomal recessive disorder of copper metabolism caused by mutations in the ATP7B gene that encodes a P-type copper transporting ATPase The aim of this study was to screen and detect mutations of the ATP7B gene in a family with Wilson disease (n = 7) 21 exon of ATP7B gene was directly sequenced to detect mutation The results showed that 7/7 patients had different heterozygous mutations including: ins47_48CGGCG in exon and p.V456L in exon of ATP7B gene Keywords: Wilson disease, ATP7B gene 34 ... NM_000053, GeneBank) exon làm cho ba vị trí 456 mã hóa Valine chuyển thành Leucin (p.Val456Leu) Hình Phả hệ gia đình bệnh nhân Wilson mã số W7.00 Phả hệ gia đình gồm hệ, bệnh nhân phát đột biến gen ATP7B. .. LUẬN Cho đến nay, khoảng 500 đột biến tìm thấy bệnh nhân mắc bệnh Wilson [7; 8] Mỗi quốc gia, chủng tộc người khác có loại đột biến khác Đột biến p.His1069Glu đột biến thường gặp quần thể nguời... người mắc bệnh Wilson [11] Bệnh nhân Wilson nhận alen bệnh người bố alen bệnh người mẹ hai alen bệnh người bố người mẹ Bố, mẹ TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 bệnh nhân mang gen đồng hợp lặn gen dị