Đang tải... (xem toàn văn)
Đột biến các gen IDH là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng trong u thần kinh đệm (UTKĐ). Đột biến p.R132H của gen IDH1 do thay đổi từ guanine thành adenine tại nucleotide 395 là thường gặp nhất trong những đột biến này.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN p.R132H CỦA GEN IDH1 TRONG U THẦN KINH ĐỆM BẰNG KỸ THUẬT ASO-PCR Hoàng Anh Vũ*, Đỗ Phú Quang**, Trần Minh Thơng*** TĨM TẮT Mục tiêu: Đột biến gen IDH yếu tố tiên lượng quan trọng u thần kinh đệm (UTKĐ) Đột biến p.R132H gen IDH1 thay đổi từ guanine thành adenine nucleotide 395 thường gặp đột biến Chúng tơi xây dựng quy trình kỹ thuật ASO-PCR để xác định đột biến bệnh phẩm mô vùi nến UTKĐ Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu thực 33 mẫu UTKĐ từ Bệnh Viện Chợ Rẫy Mẫu tách chiết DNA kít ReliaprepTM FFPE gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ) Kỹ thuật giải trình tự DNA thực số mẫu để chọn chứng dương có mang đột biến p.R132H Mồi đặc hiệu cho alen mang đột biến thiết kế tối ưu hóa điều kiện ASO-PCR chứng dương ứng dụng vào xác định đột biến cho mẫu lại nghiên cứu Kết quả: ASO-PCR sử dụng mồi phản ứng cho phép khuếch đại đặc hiệu mẫu có mang đột biến p.R132H, kiểm chứng giải trình tự DNA Chúng tơi phát 11 trường hợp đột biến 28 mẫu UTKĐ độ II III (39,3%), khơng có đột biến trường hợp UTKĐ độ I IV Kết luận: ASO-PCR sử dụng bước sàng lọc đột biến p.R132H gen IDH1 UTKĐ Từ khóa: U thần kinh đệm, gen IDH1, đột biến, ASO-PCR ABSTRACT DETECTION OF IDH1 GENE MUTATION (p.R132H) IN GLIOMAS BY ASO-PCR Hoang Anh Vu, Do Phu Quang, Tran Minh Thong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No - 2015: 281 - 285 Objectives: IDH gene mutational status is one of the important prognostic factors in gliomas The p.R132H mutation in IDH1 gene due to a substitution from guanine to adenine at nucleotide 395 is the most common of these mutations We establish an ASO-PCR procedure to identify this mutation from paraffin blocks of gliomas Materials and Methods: The study was performed with 33 glioma samples collected from Cho Ray Hospital Samples were DNA extracted using FFPE gDNA ReliaprepTM Miniprep System kit from Promega, USA Some first samples were investigated by DNA sequencing technique to select positive control carrying p.R132H mutation Specific primer for mutant allele was designed and ASO-PCR conditions with positive control were optimized and applied to verify the mutation in the remaining samples Results: ASO-PCR using primers in one reaction allows amplifying specifically p.R132H mutant samples, confirmed by DNA sequencing We detected 11 mutations in 28 cases of WHO grade II and III gliomas (39.3%), but not any mutation in cases of WHO grade I and IV gliomas (glioblastoma) Conclusion: ASO-PCR can be used in the screening step of IDH1 gene mutations (p.R132H) in gliomas Key words: Gliomas, IDH1 gene, mutations, ASO-PCR * Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh *** Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Pháp Việt Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Chợ Rẫy Tác giả liên lạc: TS.BS Hoàng Anh Vũ ĐT: 0122-2993537, Email: hoangvuxinh@yahoo.com ** 281 Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ U thần kinh đệm (UTKĐ, glioma) khối u nội sọ nguyên phát thường gặp nhất, chiếm 80% trường hợp u não ác tính 30% trường hợp u hệ thần kinh trung ương nói chung Mặc dù tương đối hiếm, chúng gây tỷ lệ mắc bệnh tử vong đáng kể; Mỹ tỷ lệ mắc u não nguyên phát 18,1/100.000 dân năm, tỷ lệ sống tương ứng với 2, 5, 10 20 năm 62%, 54%, 45% 30%(6) Ở Việt Nam, theo nghiên cứu tác giả Trần Minh Thông, thời gian 1/2000-7/2007 Bệnh viện Chợ Rẫy có 1187 trường hợp u bào chẩn đốn phẫu thuật, u bào độ ác cao (u bào thoái sản, u nguyên bào thần kinh đệm) chiếm 56%(10) Sự khác biệt thương tổn lành tính ác tính rõ ràng u não u quan khác Một số UTKĐ có đặc điểm mơ học lành tính, bao gồm số phân bào thấp, tính đồng dạng tế bào cao, tăng trưởng chậm, lại xâm nhập mơ não, từ dẫn đến biểu lâm sàng nghiêm trọng tiên lượng xấu Tuy nhiên, kết luận chẩn đoán tiên lượng phụ thuộc vào định chủ quan nhà giải phẫu bệnh, nên gặp nhiều khó khăn hạn chế Vì thế, việc nghiên cứu tìm dấu ấn sinh học khách quan hơn, giúp tiên lượng bệnh quan trọng Gần đây, người ta chia UTKĐ thành nhóm chính(4) dựa dấu ấn khối u đột biến vùng khởi động gen TERT, đột biến gen IDH đoạn đồng thời nhiễm sắc thể 1p 19q Sự phân chia có ý nghĩa mặt tiên lượng bệnh hứa hẹn sớm đưa vào ứng dụng lâm sàng Trong UTKĐ, đột biến gen IDH xác định xảy gen IDH1 IDH2 Hơn 90% đột biến ghi nhận gen IDH1, tập trung codon R132 exon 4, với loại khác mô tả sau: đột biến thay p.R132H (c.395G>A) thường gặp nhất, chiếm khoảng 92,4%, theo sau p.R132C (3,2%), p.R132G 282 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 (2,1%), p.R132S (1,6%) p.R132L (A), làm sở cho việc triển khai nghiên cứu sâu rộng dấu ấn sinh học có giá trị chẩn đoán tiên lượng bệnh bệnh nhân Việt Nam ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng Chúng tiến hành khảo sát đột biến gen IDH1 cho bệnh phẩm chẩn đoán u bào (một loại u điển hình UTKĐ) với cấp độ từ I đến IV lưu trữ Khoa Giải Phẫu Bệnh - Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh, giai đoạn từ tháng 12/2013 đến tháng 06/2015 Nghiên cứu đột biến gen thực Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp Tách chiết genomic DNA Bệnh phẩm mô vùi nến sử dụng để Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 chẩn đoán giải phẫu bệnh Các mẫu chọn tiêu nhuộm HE có 50% số tế bào u Genomic DNA tách chiết kít ReliaprepTM FFPE gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Khuếch đại exon gen IDH1 kỹ thuật PCR Một cặp mồi thiết kế phần mềm CLC Main Workbench dựa trình tự chuẩn gen IDH1 mang accession number NG_023319 GenBank để khuếch đại exon có mang codon R132 Trình tự mồi xuôi IDH1-F: 5’-GTGGAAATCACCAAATGGCA-3’; mồi ngược: IDH1-R: 5’AGATACCAAAAGATAAGAAT-3’) Mồi đặt tổng hợp Integrated DNA Technologies (Mỹ) Kỹ thuật PCR thực với cặp mồi đặc hiệu thiết kế kit TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) Chu trình luân nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức), bao gồm giai đoạn biến tính DNA ban đầu 980C phút Tiếp theo, phản ứng tổng hợp chuỗi DNA thực với 50 chu kỳ gồm bước: biến tính 980C 10 giây, thực phản ứng lai 540C 20 giây, sau tổng hợp mạch 720C 30 giây Phản ứng kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 720C phút Sản phẩm PCR phát điện di thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Sản phẩm PCR sau tinh QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất kiểm tra lại điện di thạch agarose 1,5% Thực giải trình tự chuỗi DNA Sản phẩm PCR tinh chạy phản ứng cycle sequencing với BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystem, Mỹ) theo chiều xi ngược, sau kết tủa ethanol, hòa tan Hi-Di formamide, biến Nghiên cứu Y học tính phút 960C làm lạnh đột ngột đá bào Trình tự DNA xác định máy giải trình tự ABI 3130 Genetic Analyzer với POP-7 polymer capillary 50 cm Kết phân tích phần mềm CLC Main Workbench Thiết kế mồi cho ASO-PCR Mồi xuôi IDH1-MUF (5’AAACCTATCATCATAGGCCA-3’), bổ sung đặc hiệu với alen mang đột biến c.395G>A, thiết kế tổng hợp Integrated DNA Technologies (Mỹ) Trong mồi IDH1-MUF, vị trí nucleotide đầu tận 3’ thay từ G sang A Đồng thời, để tăng tính đặc hiệu mồi, vị trí nucleotide thứ đầu tận 3’ thay từ T sang C(5) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đặc điểm mẫu nghiên cứu Có tất 33 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân chọn vào nghiên cứu, gồm 16 nam 17 nữ Bệnh nhân nhỏ tuổi tuổi, lớn 55 tuổi, với số trung vị 30,5 tuổi Vì mục tiêu nghiên cứu thiết lập kỹ thuật phát đột biến ASO-PCR nên tập trung chọn mẫu bệnh phẩm xếp loại độ mơ học có tần suất đột biến cao nhất: mẫu độ I, 15 mẫu độ II, 13 mẫu độ III mẫu độ IV Phát đột biến IDH1 kỹ thuật giải trình tự DNA Trong giai đoạn đầu nghiên cứu này, cần phát mẫu chứng dương có mang đột biến c.395G>A (p.R132H) để tiến hành chuẩn hóa điều kiện ASO-PCR Exon gen IDH1 có mang codon R132 khuếch đại từ DNA 12 mẫu bệnh phẩm, sau giải trình tự theo hai chiều Chúng tơi phát mẫu có mang đột biến gen IDH1 codon R132 (Hình 1), trường hợp đột biến c.394C>G (p.R132G) trường hợp đột biến c.395G>A (p.R132H) Một hai mẫu có đột biến c.395G>A sử dụng cho nghiên cứu 283 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Sử dụng quy trình ASO-PCR tối ưu hóa, chúng tơi tiến hành khảo sát đột biến c.395G>A cho 21 mẫu UTKĐ lại Hình 2B minh họa hình ảnh điện di số sản phẩm ASO-PCR, mẫu khơng có đột biến biểu sản phẩm 240 bp, mẫu mang đột biến có sản phẩm 240 bp 137 bp Trong số 21 mẫu khảo sát ASOPCR, phát thêm trường hợp có mang đột biến c.395G>A Các kết hoàn toàn phù hợp sau kiểm chứng lại giải trình tự DNA sản phẩm 240 bp tách từ băng điện di Hình 1: Hai kiểu đột biến gen IDH1 phát giải trình tự DNA Phát đột biến IDH1 kỹ thuật ASO-PCR Kỹ thuật ASO-PCR lần mô tả nghiên cứu tế bào ác tính bệnh nhân đa u tủy(2) Đây kỹ thuật nhạy, cho phép phát bất thường gen tế bào ác tính quần thể 104-105 tế bào bình thường(2,7) Để thực ASO-PCR phát đột biến p.132RH gen IDH1 UTKĐ, dùng mồi phản ứng khuếch đại gen (Hình 2A) Mồi IDH1-F IDH1-R đóng vai trò chứng nội tại, tạo sản phẩm có kích thước 240 bp Chỉ có mẫu khuếch đại đoạn gen đánh giá xem có hay khơng có mang đột biến c.395G>A Vì mồi IDH1-MUF thiết kế bổ sung đặc hiệu với alen đột biến nên cặp mồi IDH1-MUF IDH1-R hoạt động để tạo sản phẩm 137 bp mẫu có mang đột biến c.395G>A Chúng tơi thay đổi tỷ lệ khác mồi phản ứng nhận thấy tỷ lệ hoạt động tốt IDH1F/IDH1-MUF/IDH1-R = 1/2/2, với nhiệt độ bắt cặp tối ưu xác định 540C 284 Như vậy, chúng tơi phát 12 trường hợp có mang đột biến codon R132 gen IDH1 tổng số 33 mẫu UTKĐ, chiếm tỷ lệ chung 36,4% (1 trường hợp p.R132G 11 trường hợp p.R132H) Đột biến p.R132H phát mẫu UTKĐ độ II (6/15 hay 40%) độ III (5/13 hay 38,5%); mẫu độ I IV không phát có đột biến Mặc dù nghiên cứu có số mẫu nhỏ, bước đầu cho thấy đột biến gen IDH1 chủ yếu gặp UTKĐ độ II III (11/28 hay 39,3%), phù hợp với kết nhiều nghiên cứu khác giới(4,9,12) Ngoài đột biến p.R132H gen IDH1, giải trình tự DNA cho phép xác định đột biến khác gen IDH1 IDH2(8,11) Tuy nhiên, kỹ thuật ASO-PCR chúng tơi lựa chọn phương pháp sàng lọc ban đầu giúp phát khoảng 40% trường hợp có mang đột biến Kỹ thuật có lợi điểm xác, nhanh chóng dễ thực hiện(1) Với hệ thống khuếch đại gen thường quy sẵn có nhiều sở giải phẫu bệnh có kèm chẩn đốn phân tử, tồn quy trình kỹ thuật chẩn đốn đột biến ASO-PCR thực vòng ngày làm việc Trong thời gian tới, ASO-PCR kết hợp với giải trình tự DNA tiến hành nghiên cứu với số mẫu lớn để đánh giá xác giá trị tiên lượng đột biến gen IDH UTKĐ Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Hình 2: (A) ASO-PCR thực mồi, mồi IDH1-MUF khuếch đại alen đột biến (B) Hình điện di sản phẩm ASO-PCR (giếng 2-15) với băng 240 bp chứng nội băng 137 bp sản phẩm tương ứng với mẫu có đột biến p.R132H Giếng 1: thang chuẩn DNA; giếng 16: nước KẾT LUẬN Chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình ASO-PCR giúp xác định đột biến p.R132H gen IDH1 thường gặp UTKĐ Kết bước đầu phát 39,3% mẫu UTKĐ độ II III có mang đột biến, làm sở cho nghiên cứu sâu hơn, quy mô lớn đột biến gen IDH UTKĐ TÀI LIỆU THAM KHẢO Ashraf S, Noguera NI, Di Giandomenico J, et al (2013) Rapid detection of IDH2 (R140Q and R172K) mutations in acute myeloid leukemia Ann Hematol;92(10):1319-23 Billadeau D, Quam L, Thomas W, et al (1992) Detection and quantitation of malignant cells in the peripheral blood of multiple myeloma patients Blood;80(7):1818-24 Dahse R, Berndt A, Dahse AK, et al (2008) Two allele-specific PCR assays for screening epidermal growth factor receptor gene hotspot mutations in lung adenocarcinoma Mol Med Report;1(1):45-50 Eckel-Passow JE, Lachance DH, Molinaro AM, et al (2015) Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors N Engl J Med;372(26):2499-508 Liu J, Huang S, Sun M, et al (2012) An improved allelespecific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application Plant Methods;8(1):34 10 11 12 Porter KR, McCarthy BJ, Freels S, et al (2010) Prevalence estimates for primary brain tumors in the United States by age, gender, behavior, and histology Neuro Oncol;12(6):520-7 Roche-Lestienne C, Soenen-Cornu V, Grardel-Duflos N, et al (2002) Several types of mutations of the ABL gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment Blood;100(3):1014-8 Sanson M, Marie Y, Paris S, et al (2009) Isocitrate dehydrogenase codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in gliomas J Clin Oncol;27(25):4150-4 Sonoda Y, Kumabe T, Nakamura T, et al (2009) Analysis of IDH1 and IDH2 mutations in Japanese glioma patients Cancer Sci;100(10):1996-8 Trần Minh Thông (2007) Đặc điểm giải phẫu bệnh 1187 ca u bào Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh;11(3):41-46 Van Den Bent Mj, Dubbink HJ, Marie Y, et al (2010) IDH1 and IDH2 mutations are prognostic but not predictive for outcome in anaplastic oligodendroglial tumors: a report of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor Group Clin Cancer Res;16(5):1597-604 Verhaak RG, Hoadley KA, Purdom E, et al (2010) Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1 Cancer Cell;17(1):98–110 Ngày nhận báo: 20/08/15 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/06/2015 Ngày báo đăng: 05/09/2015 285 ... Hai ki u đột biến gen IDH1 phát giải trình tự DNA Phát đột biến IDH1 kỹ thuật ASO-PCR Kỹ thuật ASO-PCR lần mô tả nghiên c u tế bào ác tính bệnh nhân đa u tủy(2) Đây kỹ thuật nhạy, cho phép phát. .. nhất: m u độ I, 15 m u độ II, 13 m u độ III m u độ IV Phát đột biến IDH1 kỹ thuật giải trình tự DNA Trong giai đoạn đ u nghiên c u này, cần phát m u chứng dương có mang đột biến c.395G>A (p.R132H) ... nhỏ tuổi tuổi, lớn 55 tuổi, với số trung vị 30,5 tuổi Vì mục ti u nghiên c u thiết lập kỹ thuật phát đột biến ASO-PCR nên tập trung chọn m u bệnh phẩm xếp loại độ mơ học có tần suất đột biến