Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu này được tiến hành để đánh giá KTTP trên tiểu phân nano polyme Eudragit RL100 và tiểu phân nano liposome, cấu tạo gồm HSPC và cholesterol với tỉ lệ mol 8:2 và 7:3.
VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-26 Original Article Impact of Sample Concentration on the Determination of Particle Size of Nano Polymer Particles and Nano Liposomes by Dynamic Light Scattering Tran Thi Hai Yen, Le Thi Huyen, Tran Hong Nhung, Le Thi Thu Trang, Pham Thi Minh Hue Hanoi University of Pharmacy, 13-15 Le Thanh Tong, Hoan Kiem, Hanoi, Vietnam Received 15 October 2019 Revised 21 October 2019; Accepted 15 November 2019 Abstract: Determination of particles size is important in pharmaceutical research and manufacturing of drug delivery system in nano scale This study was carried out to evaluate particles size of nano polymer particles, composed of Eudragit RL 100, and nano liposomes, composed of hydrogenated soy phosphatidylcholine and cholesterol Dynamic light scaterring was used to determine nano particles size The results showed that, dilution ratio influenced differently on the determined nanoparticles Liposomal suspension, which was diluted to count rate less than 170 kcps, had statistically significant larger particle than that, which had greater count rate Polymer particles, which were diluted to count rate less than 126 had statistically significant larger particles than that, which had greater count rate Keywords: Particle size, nano polymer particle, nano liposomes, dynamic light scattering (DLS) Corresponding author Email address: tranyendhd@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnuer.4181 19 VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-26 Đánh giá ảnh hưởng mức độ pha lỗng đến kết xác định kích thước hệ tiểu phân nano polyme nano liposome phương pháp tán xạ ánh sáng động Trần Thị Hải Yến*, Lê Thị Huyên, Trần Hồng Nhung, Lê Thị Thu Trang, Phạm Thị Minh Huệ Trường Đại học Dược Hà Nội, 13-15 Lê Thánh Tơng, Hồn Kiếm, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 15 tháng 10 năm 2019 Chỉnh sửa ngày 21 tháng 10 năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 15 tháng 11 năm 2019 Tóm tắt: Xác định kích thước tiểu phân khâu quan trọng nghiên cứu bào chế, sản xuất hệ mang thuốc có kích thước nano Nghiên cứu tiến hành để đánh gía KTTP tiểu phân nano polyme Eudragit RL100 tiểu phân nano liposome, cấu tạo gồm HSPC cholesterol với tỉ lệ mol 8:2 7:3 Phương pháp xác định kích thước tiểu phân nano phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) Kết phân tích kích thước cho thấy, tỉ lệ pha loãng mẫu ảnh hưởng khác đến KTTP thu Count rate đại lượng số lượng photon đến detector giây, đặc trưng cho nồng độ tiểu phân hệ, hay đặc trưng cho tỉ lệ pha loãng mẫu Các mẫu liposome pha loãng đến count rate nhỏ 170 kcps có đường kính trung bình lớn có ý nghĩa thống kê so với mẫu có count rate lớn Các mẫu hỗn dịch tiểu phân nano polyme pha loãng đến count rate nhỏ 126 kcps có đường kính trung bình lớn có ý nghĩa thống kê so với mẫu có count rate lớn Từ khóa: Kích thước tiểu phân, tiểu phân nano polyme, tiểu phân nano liposome, nhiễu xạ ánh sáng động Đặt vấn đề Các nhà khoa học sử dụng vài phương pháp khác để xác định kích thước tiểu phân hệ nano như: hiển vi điện tử truyền qua (TEM), hiển vi điện tử quét (SEM), nhiễu xạ ánh sáng động, tán xạ ánh sáng laze … Một kĩ thuật sử dụng phổ biến việc xác định kích thước hạt có kích thước Kích thước phân bố kích thước tiểu phân thông số quan trọng kiểm nghiệm, đánh giá độ ổn định hệ nano mang thuốc Vì vậy, thơng số cần đánh giá q trình bào chế, sản xuất bảo quản Tác giả liên hệ Địa email: tranyendhd@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4181 20 T.T.H Yến et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-26 nano tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) phương pháp dễ tiến hành, không cần công đoạn xử lý mẫu phức tạp phương pháp hiển vi điện tử, thời gian cần thiết để đo mẫu không dài độ lặp lại kết tương đối tốt Phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động xác định kích thước tiểu phân dựa tán xạ ánh sáng laze tiểu phân chuyển động Brown môi trường phân tán Các tiểu phân có kích thước nhỏ chuyển động nhanh so với tiểu phân có kích thước lớn Do đó, kích thước tiểu phân trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ chuyển động chúng Trong phương pháp tán xạ ánh sáng động, chiếu chùm ánh sáng laze qua mẫu cần đo, tiểu phân mẫu chuyển động Brown gây tượng tán xạ ánh sáng theo hướng khác Ánh sáng tán xạ phát ghi nhận detector góc định (các thiết bị thường thu nhận ánh sáng tán xạ góc 90o 173o) Cường độ ánh sáng khuếch tán dùng để tính KTTP trung bình theo cường độ (Z-avergae) thơng qua hệ thức Stokes – Einstein [1] 𝐊𝐓 D = 𝟔𝛈𝛑𝐫 Trong D: tốc độ khuếch tán K: số Boltzman T: Nhiệt độ η: độ nhớt môi trường r: bán kính tiểu phân Phương trình Stoke-Einstein phát triển dựa giả thuyết tiểu phân chất rắn hình cầu [2] Độ xác độ lặp lại kết đo bị ảnh hưởng nhiều yếu tố như: khoảng phân bố KTTP hệ, count rate, độ nhớt… Trong đó, count rate đại lượng số lượng photon đến detector đơn vị thời gian giây, theo quy định thiết bị đo sử dụng nghiên cứu, count rate yêu cầu nằm khoảng 100 - 500 kcps Count rate mẫu đo phụ thuộc vào tỉ lệ pha loãng mẫu Mục tiêu nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng mức độ pha loãng mẫu (chỉ số count rate) đến độ xác độ lặp lại kết đo kích thước hạt hỗn dịch nano liposome, hỗn dịch nano polyme chưa mang thuốc 21 Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu thiết bị Nguyên liệu: Eudragit RL 100 công ty Evonik -Đức cung cấp; ethanol tuyệt đối cung cấp công ty hóa chất Đức Giang (Việt Nam); phosphatydin cholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidyl cholin HSPC) sản xuất Lipoid (Đức); cholesterol MP Biomedicals North America (Mỹ) cung cấp Các thiết bị sử dụng: hệ thống cất quay Rovarpor R-210 Buchi (Đức), bể siêu âm Wiseclean (Đức), máy khuấy từ gia nhiệt WiseStir (Đức), cân phân tích, máy đồng hóa Unidriver X1000 Homogenizer (Đức), hệ thống phân tích kích thước Malvern Zetasizer ZS90 (Anh) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp bào chế hỗn dịch nano liposome Liposome bào chế phương pháp tiêm ethanol [2] HSPC, cholesterol hòa tan 10 ml ethanol 96% nhiệt độ 60oC Dùng xi lanh 1ml gắn đầu kim tiêm bơm từ từ dung dịch vào 100ml nước cất nhiệt độ 60oC với tốc độ 1ml/phút Loại dung môi cách cất quay áp suất giảm 30 phút nhiệt độ 60oC Hỗn dịch liposome (20 ml) để ổn định nhiệt độ phòng sau bảo quản nhiệt độ 2-8oC Phương pháp bào chế hỗn dịch nano polyme Hỗn dịch nano polyme bào chế phương pháp kết tụ tiểu phân thay đổi dung môi [2] Eudragit RL100 hòa tan 30 ml ethanol 96% Dùng xi lanh ml có gắn đầu kim tiêm bơm từ từ vào 30 ml nước cất Vừa phối hợp pha vừa khuấy trộn máy khuấy từ 15 phút Đồng hóa máy đồng hóa tốc độ cao 15.000 vòng/phút 15 phút Loại dung môi ethanol cách cất quay áp suất giảm 15 phút Hỗn dịch thu (20ml) bảo quản nhiệt độ phòng Phương pháp đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP) Phương pháp xác định kích thước tiểu phân: T.T.H Yến et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-26 22 Mẫu liposome nano polyme pha loãng nước cất lọc qua màng lọc 0,2 µm tỉ lệ khác Các mẫu đo tiến hành khảo sát KTTP máy Malvern Zetasizer ZS 90 sử dụng cuvet Polystyrene DTS002, tiến hành đo nhiệt độ 25oC Với mẫu liposome, cài đặt thông số đo hệ số khuếch tán môi trường nước 1,33; hệ số hấp thụ phosphatidylcholin 1,44 Với mẫu hỗn dịch nano polyme, hệ số hấp thụ Eudragit cài đặt 1,38 Đường kính trung bình tiểu phân biểu diễn thơng số Z-average (d.nm) gọi KTTP nghiên cứu Ngồi thiết bị đưa thơng số PDI (Polydispersity Index) số phân bố kích thước Theo tiêu chuẩn ISO 22412 (2008) [3] PDI định nghĩa thước đo không thứ nguyên độ rộng phân bố kích thước PDI có giá trị nằm khoảng đến Khi PDI < 0,3 mẫu có phân bố kích thước hẹp, mẫu có PDI >0,5 mẫu có khoảng phân bố rộng Nếu PDI lớn, gần 1, mẫu khơng phù hợp với phương pháp đo nhiễu xạ ánh sáng động có chứa nhiều tiểu phân có kích thước lớn q giới hạn đo máy Phương pháp xử lý số liệu Số liệu trình bày dạng trung bình ± SD So sánh khác biệt nhóm xử lí phần mềm thống kê SPSS 20 với kiểm nghiệm ANOVA, mức ý nghĩa p = 0.05 Kết nghiên cứu 3.1 Ảnh hưởng độ pha loãng mẫu tới kết đo KTTP hỗn dịch nano polyme Hỗn dịch tiểu phân nano polyme pha loãng với tỉ lệ khác nhau, sau đem đo KTTP máy Nano sizer ZS 90 mô tả mục 2.3 Với mẫu hỗn dịch, với tỉ lệ pha lỗng, thơng số count rate, đường kính tiểu phân trung bình Z-average PDI thu được thể bảng Bảng Kích thước tiểu phân hỗn dịch nano polyme Eudragit RL100 tỉ lệ pha loãng khác Mẫu n A1 A2 A3 A4 A5 A6 5 5 Count rate (kcps) 105,4 ± 1,19 126,3 ± 0,89 162,9 ± 1,75 173,8 ± 1,68 233,6 ± 2,91 261,3 ± 10,33 PDI Z-average (d.nm) 0,144 ± 0,017 0,138 ± 0,022 0,095 ± 0,027 0,146 ± 0,012 0,110 ± 0,032 0,101 ± 0,038 181,8± 1,34 178,9 ± 2,67 178,4 ± 1,34 177,1 ± 1,47 178,4 ± 1,50 179,0 ± 3,66 RSD (%) KTTP 0,78 1,49 0,75 0,83 0,84 2,00 200 195 190 185 180 175 170 100 150 200 250 300 Hình Đồ thị biểu diễn KTTP trung bình hỗn dịch polyme Eudragit RL 100 count rate khác T.T.H Yến et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-26 Từ kết thu ta thấy, mẫu từ A1 đến A6 có tỉ lệ pha lỗng giảm dần, nồng độ tiểu phân tăng dần Khi đó, số lượng tiểu phân đơn vị thể tích tăng, số lượng photon đếm giây tăng, count rate mẫu tăng dần từ A1 đến A6 Chỉ số đa phân tán PDI mẫu < 0,3 chứng tỏ khoảng phân bố kích thước hạt tương đối hẹp KTTP thu lần đo khác nồng độ có độ lặp lại tốt (RSD ≤ 2%) Các mẫu A2, A3, A4, A5, A6 có KTTP trung bình khác biệt khơng có ý nghĩ thống kê (p>0,05) Các mẫu từ A2 đến A6 có count rate trung bình từ 126,3kcps – 261,3kcps có KTTP trung bình nằm khoảng 177,1 – 179,0 nm Trong đó, mẫu A1 có count rate nhỏ 105,4 kcps, cho kết KTTP lớn tất mẫu từ A2 đến A6 (181,8 nm), khác biệt có 23 ý nghĩa thống kê (p0,05 nhóm II gồm mẫu từ B5 đến B7, có KTTP khoảng 135,7 đến 138,9 nm, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p>0,05 Tuy nhiên KTTP nhóm I lớn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm II (p0,05 nhóm II gồm mẫu từ C3, C4, C5 có KTTP 151,7 nm Tuy nhiên KTTP nhóm I lớn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm II (p170 kcps Điều chứng tỏ thành phần liposome có ảnh hưởng đến độ ổn định KTTP Tỉ lệ mol HSPC: cholesterol 7:3 cho lớp màng kép liposome chắn tỉ lệ 8:2 Như nhiều tài liệu công bố, cholesterol phân bố xem kẽ trong lớp màng phospholipid kép, đóng vai trò lớp vữa để tăng tính ổn định màng [5, 6] Hình Đồ thị phân bố KTTP mẫu hạt nano 26 T.T.H Yến et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 1-8 Ngoài giá trị KTTP, giá trị PDI thước đo không thứ nguyên độ rộng khoảng phân bố mẫu Do đó, giá trị biến thiên khoảng tương đối lớn mẫu tỉ lệ pha loãng khảo sát Tuy nhiên giá trị PDI mẫu tập trung chủ yếu quanh 0,1 cho thấy mẫu có khoảng phân bố kích thước hẹp, thể đồ thị hình So sánh giá trị PDI nhóm mẫu A1-A6, B1-B7, C1-C5 cho thấy, giá trị PDI có xu hướng tăng count rate giảm Việc pha loãng làm cho mẫu giảm tính đồng hạt nano mẫu giảm, dẫn đến PDI tăng Chỉ số count rate đại lượng thể cho mức độ pha lỗng mẫu thơng số đại diện cho cường độ tán xạ ánh sáng tiểu phân Đầu dò hệ thống máy thể tuyến tính khoảng rộng nhiên nằm ngồi khoảng vùng phi tuyến tính Trong tán xạ ánh sáng động (DLS) dao động cường độ tán xạ ánh sáng phụ thuộc thời gian sử dụng để tính tốn KTTP Chính để đạt kết xác phép đo phải thể vùng tuyến tính đầu dò hay đo nồng độ thích hợp Theo kết thu nghiên cứu này, khoảng pha loãng phù hợp với hệ tiểu phân nano polyme không nên nhỏ 126 kcps, khoảng pha loãng phù hợp với hệ tiểu phân nano liposome không nên nhỏ 170 kcps Hay nói cách khác, xác định KTTP hệ nano polyme nano liposome phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động cần pha lỗng với tỉ lệ thích hợp để count rate mẫu tương tự nằm gần giá trị 200 kcps Kết luận Khi tỉ lệ pha loãng lớn, nồng độ mẫu nhỏ count rate giảm dần Các mẫu liposome pha lỗng đến count rate nhỏ 170 kcps có kích thước lớn có ý nghĩa thống kê so với mẫu có độ pha lỗng thấp Các mẫu hỗn dịch tiểu phân nano polyme pha loãng đến count rate nhỏ 126 kcps có kích thước lớn có ý nghĩa thống kê so với mẫu có độ pha lỗng thấp Do đó, để so sánh kích thước tiểu phân mẫu hỗn dịch nano polyme nano liposome, nên pha loãng cho mẫu có count rate gần count rate nên nằm gần giá trị 200 kcps Tài liệu tham khảo [1] E.H.M Sakho, E Allahyari, O.S Oluwafemi, S Thomas, and N Kalarikkal, Dynamic Light Scattering (DLS) in: Thermal and rheological measurement techniqus for nanometerials characterization, Elsevier, Europe 2017 [2] V.X Minh, P.T.M Hue, Applications of nanotechnology and liposomes in Pharmaceuticals and cosmetics, Medical publishing house, Hanoi, 2013 (in Vietnamese) [3] ISO 22412:2017, Particle size analysis - Dynamic light scattering (DLS) [4] J Panchal, J Kotarek, E Marszal, and E.M Topp, Analyzing Subvisible Particles in Protein Drug Products: a Comparison of Dynamic Light Scattering (DLS) and Resonant Mass Measurement (RMM), AAPS J., 16(3) (2014) 440–451 http://doi.org/ 10.1208/s12248-014-9579-6 [5] A Chaudhury et al, Lyophilization of cholesterolfree PEGylated liposomes and its impact on drug loading by passive equilibration, Int J Pharm., 430(1–2) (2012) 167–175 https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2012.04.036 [6] T Ishida, H Harashima, and H Kiwada, Liposome clearance, Biosci Rep., 22(2) (2002) 197–224 https://doi.org/10.1023/A:1020134521778 ... Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-26 ánh giá ảnh hưởng mức độ pha lỗng đến kết xác định kích thước hệ tiểu phân nano polyme nano liposome phương pháp tán xạ ánh sáng động Trần... dài độ lặp lại kết tương đối tốt Phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động xác định kích thước tiểu phân dựa tán xạ ánh sáng laze tiểu phân chuyển động Brown môi trường phân tán Các tiểu phân có kích thước. .. chuyển động nhanh so với tiểu phân có kích thước lớn Do đó, kích thước tiểu phân trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ chuyển động chúng Trong phương pháp tán xạ ánh sáng động, chiếu chùm ánh sáng laze