Đang tải... (xem toàn văn)
Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), một loài cây có hình thái tương tự như hoàn ngọc đỏ (Pseuderanthemum bacteatum), có dược tính do mang chất betuline và đang được sử dụng như một bài thuốc dân gian khá phổ biến và hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp nhưng chưa có công bố khoa học nào về thành phần hóa học cũng như dược tính. Nghiên cứu này đã chứng minh so với hoàn ngọc đỏ, bán tự mốc cũng có hoạt tính kháng oxi hóa và mang cùng dược chất betuline. Nghiên cứu của chúng tôi chủ yếu tập trung sàng lọc và tìm ra nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa từ cây bán tự mốc, từ đó ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu này một cách chủ động. Bằng cách sử dụng phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh và phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH, phân đoạn ethanol rễ được xác định có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất trong các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau từ các bộ phân khác nhau của bán tự mốc. Để tạo nguồn rễ in vitro, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tạo rễ bất định bằng auxin và tạo rễ tơ bằng phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ Agrobacterium rhizogenesATCC 15834. Với 2 phương pháp này, rễ cây bán tự mốc có thể được tạo thành một cách chủ động chỉ sau 10 ngày nuôi cấy.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 NGHIÊN CỨU NI CẤY RỄ CÂY BÁN TỰ MỐC (Hemigraphis glaucescens C B Clarke) LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN BETULINE Quách Ngô Diễm Phương*, Vũ Thị Bạch Phượng, Giống Hối Khoánh, Trần Ngọc Trung, Bùi Văn Lệ Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Hồ Chí Minh, *qndphuong@hcmus.edu.vn TĨM TẮT: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), lồi có hình thái tương tự hồn ngọc đỏ (Pseuderanthemum bacteatum), có dược tính mang chất betuline sử dụng thuốc dân gian phổ biến hữu hiệu điều trị cao huyết áp chưa có cơng bố khoa học thành phần hóa học dược tính Nghiên cứu chứng minh so với hoàn ngọc đỏ, bán tự mốc có hoạt tính kháng oxi hóa mang dược chất betuline Nghiên cứu chủ yếu tập trung sàng lọc tìm nguồn ngun liệu có hoạt tính kháng oxi hóa từ bán tự mốc, từ ứng dụng kỹ thuật ni cấy in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu cách chủ động Bằng cách sử dụng phương pháp thử lực khử Yen & Duh phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH, phân đoạn ethanol rễ xác định có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh phân đoạn cao có độ phân cực khác từ phân khác bán tự mốc Để tạo nguồn rễ in vitro, sử dụng phương pháp tạo rễ bất định auxin tạo rễ tơ phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ Agrobacterium rhizogenesATCC 15834 Với phương pháp này, rễ bán tự mốc tạo thành cách chủ động sau 10 ngày nuôi cấy Từ khóa: Hemigraphis glaucescens, Pseuderanthemum bacteatum, chống oxi hóa, rễ bất định, rễ tơ MỞ ĐẦU Theo kinh nghiệm dân gian, phần mặt đất bán tự mốc thường dùng chữa viêm đại tràng cấp mạn tính, rối loạn tiêu hóa, đau bụng co thắt, đầy chướng bụng, trĩ nội chảy máu, đại tiện máu, chảy máu chấn thương; có nơi dùng chữa viêm loét dày, chữa bệnh cao huyết áp Lá bán tự mốc dùng tươi, phơi khơ sắc với nước, dùng đắp vết thương giúp vết thương mau lành [7] Tuy nhiên, hiệu chữa bệnh chưa có luận khoa học cụ thể Betuline (C30H50O2) hợp chất triterpen có nhiều giá trị dược liệu quý, quan tâm nay: chống viêm, chống virus, chống ung thư [4] Hiện nay, betuline phân lập từ vỏ bạch dương, hoàn ngọc đỏ chiếm khoảng 30% trọng lượng khơ [2, 3] Betuline dễ dàng chuyển đổi thành acid betulinic (nhóm rượu thay nhóm acid carboxylic) [1], có hoạt tính sinh học hoạt động mạnh so với betuline Acid betulinic có khả chữa bệnh tương tự betuline: có tác dụng chống lại số khối u ác tính, số dạng herpes chí AIDS [5]; chống viêm, chống HIV, chống sốt rét có khả gây độc số dòng tế bào ung thư [6] Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm chứng minh hoạt tính kháng oxi hóa diện betuline rễ bán tự mốc, đồng thời nghiên cứu nuôi cấy in vitro rễ nhằm hướng đến việc thu nhận nguồn vật liệu sản xuất betuline cách chủ động tương lai VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa phận khác hệ dung môi khác từ bán tự mốc Điều chế cao: tươi chia làm ba phần rễ, thân, (kg) đem sấy khô 50oC đến khối lượng không đổi, xay nhuyễn tạo bột (g) Lần lượt ngâm dầm bột với loại dung mơi có độ phân cực tăng dần: diethy eter, chloroform, etanol, nước nhiệt độ phòng; lọc sau 48 Phương pháp cô quay chân không dùng để tạo cao dung môi diethyl eter, chloroform ethanol Đối với dung môi nước, cao tạo phương pháp đông khô 145 Quach Ngo Diem Phương et al Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa phương pháp thử lực khử Yen & Duh: hút ml (nồng độ 0,5 mg/ml) chất thử nghiệm; 2,5 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,2M pH 6,6; 2,5 ml dung dịch potassium ferricyanide 1%; ổn định 20oC sau 20 phút; thêm 2,5 ml acid tricloroacetic 10%; ly tâm 2.000 vòng/phút 10 phút; thu dịch nổi; hút 1ml dịch qua ống nghiệm khác; thêm ml nước cất 0,5 ml dung dịch FeCl3 1%; lắc để yên sau phút; đo bước sóng 700 nm Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH: bảy loại cao có kết tốt từ phương pháp Yen & Duh đem xác định giá trị IC50 phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,6 mM ethanol cách hòa tan 4,728 mg với 20 ml dung dịch methanol Mỗi phân đoạn cao pha thành nồng độ: 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/ml Thực phản ứng cho nồng độ pha sau: ethanol (3 ml), dịch thử (0,5 ml), dung dịch DPPH (0,5 ml); lắc hỗn hợp 15 giây; sau ủ hỗn hợp tối nhiệt độ phòng 30 phút đo mật độ quang bước sóng 516 nm Hoạt tính kháng oxi hóa (%) tính theo cơng thức sau: (HTCO%) = [(ODchứng - ODthử)/ODchứng] Từ đồ thị biễu diễn tương quan HTCO% nồng độ mẫu, giá trị IC50 xác định Chứng minh diện betuline bán tự mốc Các mẫu cao ethanol thân, lá, rễ bán tự mốc gửi phân tích diện xác định hàm lượng betuline HPLC-UV phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nuôi cấy rễ in vitro bán tự mốc nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu in vitro chủ động sản xuất betuline Nguồn mẫu: bán tự mốc thu hái quận Tân Phú, Hồ Chí Minh; chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834, mua từ tổ chức RIKEN-PRC thông qua dự án Mext, Nhật Bản Môi trường sử dụng: Murrashige Skoog 146 (MS), bổ sung đường (30g/l), pH 5,8 dùng nuôi cấy thực vật môi trường Nutrient Broth (NB) dùng tăng sinh vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 Điều kiện nuôi cấy: chiếu sáng 16 giờ/ngày; với cường độ chiếu sáng 3.000 lux; nhiệt độ phòng ni cấy: 22-25oC; ẩm độ trung bình: 70% Khử trùng tạo nguồn mẫu in vitro Quy trình khử trùng chồi bên bán tự mốc gồm rửa xà phòng, lắc với acid benzoid 0,3% 45 phút, rửa lại nước cất Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng, lắc với cồn 70% phút, rửa nước cất vô trùng; lắc mẫu dung dịch javen: nước (1:2) có bổ sung tweens 20 15 phút, rửa lại nước cất vô trùng Mẫu cấy vào môi trường MS để tạo nguồn nguyên liệu in vitro ban đầu Khảo sát tạo rễ bất định cảm ứng loại hormon khác Các mẫu lớp mỏng khác (rễ, thân, lá) cấy mơi trường có bổ sung loại hormone thực vật khác nhau: (1) MS; (2) MS+0,5 mg/l NAA; (3) MS+0,5 mg/l BA; (4) MS+0,5 mg/l Kinetin; (5) MS+0,5 mg/l 2,4D Sau tuần nuôi cấy, theo dõi tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), chiều dài rễ (cm) công thức Khảo sát tạo rễ tơ A rhizogenes ATCC 15834 Chủng A rhizogenes ATCC 15834 hoạt hóa 48 môi trường NB 25-28oC dùng xâm nhiễm lên mô thực vật Cắt tạo vết thương phận ngâm dịch khuẩn 30 phút Chuyển mẫu vào môi trường MS, sau 5-7 ngày, khuẩn lạc phát triển, rửa mẫu với kháng sinh cefotaxime 200 mg/l, chuyển mẫu vào môi trường MS Sau tuần, theo dõi tỷ lệ tạo rễ (%), chiều dài rễ (cm) Khảo sát điều kiện tăng trưởng rễ Dựng đường cong tăng trưởng rễ so sánh hiệu bước nuôi chuyển tiếp sang môi trường lỏng trước nuôi cấy rễ độc lập: 0,5 g rễ in vitro loại (rễ lỏng, rễ agar) nuôi lỏng lắc erlen 100 ml chứa 50 ml môi trường MS điều kiện 180 vòng/phút, 25-28oC, trọng lượng tươi trọng TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 lượng khơ rễ xác định sau ngày, vòng 30 ngày Khảo sát thành phần mơi trường thích hợp: 0,5 g rễ in vitro nuôi lỏng lắc (100 vòng/phút, 25-28oC) erlen 100 ml chứa 50 ml với môi trường: MS, B5, SH Sau tuần, ghi nhận tăng trưởng rễ qua chênh lệch khối lượng Δ(g) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa phận hệ dung môi khác Sau hút ẩm sấy khô loại cao đến khối lượng không đổi, so sánh với khối lượng khô ban đầu, thu kết cao nước với phương pháp đơng khơ có hiệu suất cao Riêng phương pháp cô quay chân không, phận rễ dung mơi ethanol có hiệu suất tạo cao tốt nhất, phận thân dung môi chloroform có hiệu suất tạo cao tốt (bảng 1) Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa phương pháp thử lực khử theo Yen & Duh Kết định tính khả kháng oxi hóa loại cao trình bày bảng Từ phương pháp Yen & Duh, sàng lọc bảy loại cao có kết kháng oxi hóa tốt nhất, cao R2, R3, R4, T1, T2, T3 T4, đó, cao ethanol rễ (R3) có kết tốt Bảng Hiệu suất loại cao từ phận rễ, thân, Dung môi Diethyl eter Chloroform Etanol Nước Rễ khô (270g) 0,7379 0,9336 2,3377 26,9416 Khối lượng cao (g) Thân khô Lá khô (500g) (600g) 2,7832 1,8855 3,8900 11,3502 2,3741 1,6181 55,1300 39,1506 Hiệu suất cao (%) Rễ Thân Lá 0,2733 0,3458 0,8658 9,9784 0,5566 0,7780 0,4748 11,0260 0,3143 1,8917 0,2697 6,5251 Bảng Tính khử loại cao theo phương pháp Yen & Duh (1993) Bộ phận Rễ Thân Lá Dung dịch đo Chứng dương Chứng âm Cao diethyl eter Cao chloroform Cao ethanol Cao nước Cao diethyl eter Cao chloroform Cao ethanol Cao nước Cao diethyl eter Cao chloroform Cao ethanol Cao nước Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH Vit E ĐC R1 R2 R3 R4 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 ABS ± SE 1,507±0,07353 0,595±0,05231 0,679±0,12929 0,966±0,14757 1,968±0,22379 0,919±0,10303 0,696±0,10930 0,825±0,15060 1,324±0,19654 0,823±0,24229 0,642±0,15829 0,631±0,13949 0,673±0,10468 0,624±0,04814 Gía trị IC50 bảy loại cao có kết tốt phương pháp Yen & Duh xác định 147 Quach Ngo Diem Phương et al phương pháp DPPH theo hình Cao ethanol rễ có hoạt tính kháng oxi hóa cao với IC50=75 µg/ml, cao ethanol thân (T3) có hoạt tính kháng oxi hóa mức cao với giá trị IC50=97 µg/ml Tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH bảy loại cao xếp theo thứ tự giảm dần sau: R3>T3>R2>R4> T4>T2>T1 Như vậy, rễ phận có hoạt tính kháng oxi hóa tốt bán tự mốc ethanol dung mơi thích hợp để tách chiết hoạt chất có hoạt tính cao từ rễ phân tích HPLC cho kết định lượng hình Kết bảng cho thấy, rõ ràng phận bán tự mốc có diện betuline, đó, mẫu rễ có chứa hàm lượng betuline cao Bảng Kết định lượng betuline phương pháp HPLC-UV Tên mẫu Lá Thân Rễ Kết phân tích (µg/g) 13,4 7,0 59,3 Nuôi cấy rễ in vitro nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu in vitro chủ động sản xuất betuline Khảo sát tạo rễ bất định cảm ứng loại hormone khác Hình Biểu đồ thể giá trị IC50 (µg/ml) bảy phân đoạn cao Chứng minh diện betuline Các mẫu cao ethanol rễ, thân, sau A B Kết cảm ứng tạo rễ hormone thực vật từ phận khác (rễ, thân, lá) bán tự mốc in vitro trình bày hình Trong đó, rễ bất định cảm ứng tạo thành môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l C D Hình Sắc kí đồ A: betuline 20 ppm; B: mẫu lá; C: mẫu thân; D: mẫu rễ Hình Đồ thị chiều dài rễ bất định môi trường MS+0,5mg/l NAA sau tuần 148 Sau tuần nuôi cấy, rễ bất định từ thân phát triển dài rễ bất định từ rễ, đó, để tạo rễ bất định cảm ứng hormone thực vật, đề xuất phân thích hợp thân hay lá, hormone thích hợp NAA Khảo sát tạo rễ tơ A rhizogenes ATCC 15834 Sau 10 ngày nuôi cấy, kết cho thấy rõ hiệu tác động tạo rễ A rhizogenes ATCC 15834 lên mẫu cắt ngang (lá, thân, rễ) có tạo vết thương: xuất rễ cơng thức có bổ sung A rhizogenes, cơng thức đối chứng TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 khơng có (hình 5) Khả phát triển rễ (chiều dài rễ) cảm ứng A rhizogenes A B 1cm C 1cm ATCC 15834 sau ghi nhận sau tuần trình bày hình D 1cm E 1cm F 1cm 1cm Hình Mẫu sau 10 ngày ni cấy: A: MS; B:MS+0,5 mg/l NAA; C: MS+0,5mg/l Kinetin; D:MS+0,5 mg/l 2,4D; E: MS+0,5 mg/l 2,4D; F: Rễ môi trường B (5 tuần) B A Hình A Mẫu khơng nhiễm A rhizogenes; B Mẫu có nhiễm A Rhizogenes Để chứng minh diện gen chuyển gennome rễ tạo thành nhờ A rhizogenes ATCC 15834, phản ứng PCR nhằm khuếch đại trình tự gen đặc trưng A rhizogenes ATCC 15834 diện gennome rễ tạo thành tiến hành, kết trình bày hình A 400bp 600bp B Hình Đồ thị thể chiều dài rễ sau tuần nuôi cấy từ phận nhiễm A rhizogenes Vẽ đường cong tăng trưởng rễ so sánh hiệu bước nuôi chuyển tiếp sang môi trường lỏng trước nuôi cấy rễ độc lập điều kiện lỏng-lắc (hình 8) Kết cho thấy, rễ tăng trưởng đặn đạt trọng lượng tối đa sau 18 ngày ni cấy, sau trọng lượng giảm dần lúc rễ bắt đầu tổng hợp sản sinh hợp chất thứ cấp, làm nồng độ áp suất thẩm thấu môi trường tăng cao, cản trở hấp thu chất dinh dưỡng, dẫn đến tăng trưởng giảm Hình Sản phẩm PCR A cặp mồi rolBF-rolBR; B cặp mồi rolCF-rolCR; Thang; Rễ invitro đối chứng; Rễ invitro chuyển gen Kết PCR cho thấy diện đoạn gen rolB (422bp) rolC (625bp) A rhizogenes ATCC 15834 genome rễ tạo thành Như vậy, A rhizogenes ATCC 15834 cảm ứng tạo rễ tơ từ mẫu bán tự mốc Khảo sát điều kiện tăng trưởng nguồn rễ độc lập Hình Đường cong tăng trưởng rễ lỏng Hình Đường cong tăng trưởng rễ agar 149 Quach Ngo Diem Phương et al Kết dựng đường cong tăng trưởng rễ agar trình bày hình Rễ nuôi từ môi trường agar (rễ agar), chuyển qua môi trường lỏng-lắc, chưa thích nghi nên rễ bị sốc, hóa nâu chết dần (hình 10) A Kết cho thấy thành công việc nuôi cấy lỏng lắc rễ bán tự mốc, bước chuyển sang ni lỏng trước nuôi cấy lỏng-lắc phù hợp, điều kiện nuôi giúp khẳng định hướng thu nhận nguồn rễ ứng dụng quy mơ cơng nghiệp sau B 1cm 1cm Hình 10 Sự khác biệt rễ lỏng (A) rễ agar (B) nuôi lỏng-lắc sau tuần Khảo sát thành phần môi trường thích hợp Khối lượng (g) Kết tăng trưởng rễ thể qua chênh lệch khối lượng Δ(g) (hình 11) Mỗi lồi thực vật có hấp thu khác thành phần mơi trường Trong thí nghiệm này, thấy ni cấy mơi trường SH, rễ có tăng trưởng cao Mơi trường Hình 11 Biểu đồ thể ảnh hưởng loại môi trường lên tăng trưởng rễ KẾT LUẬN Rễ bán tự mốc có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh (IC50 = 75 µg/ml), nguồn vật liệu mang betuline cao Nguồn rễ bán tự mốc bất định thu cách chủ động cách nuôi cấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA Rễ tơ tạo thành phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ A rhizogenes ATCC 15834 Nguồn rễ độc lập hồn tồn ni cấy lỏng lắc với bước chuyển nuôi 150 cấy lỏng trước mơi trường SH nhằm hướng đến thu nhận sinh khối rễ quy mô sản xuất công nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Csuk R., Schmuck K., Schäfer R., 2006 A practical synthesis of betulinic acid Tetrahedron letters, 47(49): 8769-8770 Gao Y., Xu H., Lu Z., Xu Z., 2009 Quantitative determination of steroids in the fruiting bodies and submerged-cultured mycelia of Inonotus obliquus Se pu= Chinese Journal of Chromatography/ Zhongguo hua xue hui, 27(6): 745 Green B., Bentley M D., Chung B Y., Lynch N G., Jensen B L., 2007 Isolation of betulin and rearrangement to allobetulin A biomimetic natural product synthesis Journal of Chemical Education, 84(12): 1985 Hiroya K., Takahashi T., Miura N., Naganuma A., Sakamoto T., 2002 Synthesis of betulin derivatives and their protective effects against the cytotoxicity of cadmium Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10(10): 3229-3236 Kim D S H L., Pezzuto J M., Pisha E., 1998 Synthesis of betulinic acid derivatives with activity against human melanoma TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 145-151 Bioorganic & Medicinal Chemistry letters, 8(13): 1707-1712 Wolfgang W., Grimmel C., Wagenknecht B., Dichgans J., Weller M., 1999 Betulinic acid-induced apoptosis in glioma cells: A sequential requirement for new protein synthesis, formation of reactive oxygen species, and caspase processing Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 289(3): 1306-1312 A STUDY ON ROOT CULTURES OF Hemigraphis glaucescens C B Clarke FOR BETULINE PRODUCTION Quach Ngo Diem Phuong, Vu Thi Bach Phuong, Giong Hoi Khoanh, Tran Ngoc Trung, Bui Van Le University of Sicence, Ho Chi Minh City SUMMARY Up to now, there has not been any scientific publication related to chemistry and pharmaceutical value of Hemigraphis glaucescens C B Clarke However, they have been used as a popular and effective therapy for hypertensive patients like Pseuderanthemum bracteatum, which has been posted in many publications to include medicinal properties of betuline This research demonstrated that Hemigraphis glaucescens also contains betuline, the same substance in Pseuderanthemum bracteatum Besides, it focused on screening and finding out antioxidant extract fraction of Hermigraphis glaucescens; accordingly, we can apply in vitro culture technique on getting antioxidant materials actively In details, by using Ferric cyanine reducing antioxidant power (Yen and Duh) and free radicals scavenging (DPPH) assay, we elucidated that ethanol fraction of root Hermigraphis glaucescens was the best Adventitious roots were formed by using 0.5 mg/l NAA and hairy roots were also formed by co-culturing with Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 after 10 days Keywords: Agrobacterium rhizogenes, Hemigraphis glaucescens, betuline, hairy root culture Ngày nhận bài: 15-7-2013 151 ... học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Ni cấy rễ in vitro bán tự mốc nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu in vitro chủ động sản xuất betuline Nguồn mẫu: bán tự mốc thu hái quận Tân Phú, Hồ Chí Minh; chủng... 75 µg/ml), nguồn vật liệu mang betuline cao Nguồn rễ bán tự mốc bất định thu cách chủ động cách nuôi cấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA Rễ tơ tạo thành phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ... lắc rễ bán tự mốc, bước chuyển sang ni lỏng trước ni cấy lỏng-lắc phù hợp, điều kiện nuôi giúp khẳng định hướng thu nhận nguồn rễ ứng dụng quy mô công nghiệp sau B 1cm 1cm Hình 10 Sự khác biệt rễ