Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp Amilaza và Proteinaza ngoại bào của các chủng vi khuẩn ưa mặn phân lập được từ các ao đầm nuôi tôm để phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý các chất hữu cơ dư thừa trong các ao đầm nuôi tôm cao sản ở các vùng ven biển.
29(3): 66-71 9-2007 Tạp chí Sinh học Sinh tổng hợp amilaza proteinaza ngoại bào chủng vi khuẩn a mặn phân lập từ đầm nuôi tôm Phan Thị TUyết minh Viện Công nghệ sinh học Tăng Thị Chính Viện Công nghệ môi trờng Hiện nay, đại dịch cúm gia cầm, bệnh bò điên bệnh lở mồm long móng gia súc hoành hành khắp châu lục nhu cầu tiêu thụ sản phẩm thuỷ sản có tôm xuất tăng lên nhanh chóng Việt Nam nớc nớc có điều kiện khí hậu thuận lợi cho việc phát triển nuôi trồng thuỷ sản phục vụ cho xuất khÈu DiƯn tÝch nu«i t«m xt khÈu ë n−íc ta tăng lên nhanh chóng, nhà nớc không kiểm soát đợc Do vây, vấn đề xúc đặt trình nuôi tôm cao sản nguồn nớc bùn ao thờng bị ô nhiễm nặng, thức ăn thừa chất thải tôm làm cho vi sinh vật gây bệnh làm cho tôm chết hàng loạt Trớc đây, ngời ta thờng sử dụng hoá chất để xử lý nớc nuôi tôm bùn đáy ao Các hoá chất làm cho hàng loạt thực vật thuỷ sinh bị chết làm cho lớp bùn đáy ao dày hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh phát triển [3, 5] Việc sử dụng chế phẩm sinh học làm ao đàm nuôi tôm giải pháp có hiệu an toàn cao đợc nớc nuôi tôm hàng đầu giới nh Trung Quốc, Thái Lan sử dụng rộng rãi Việt Nam phần lớn chế phẩm sinh häc sư dơng xư lý n−íc M«i tr−êng nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp proteinaza (CA) (g/l) K2HPO4 1,5 KH2PO4 0,5 Cazein Dextrin 0,05 Cao thÞt Thạch 20 NaCl 50 PH = 6,8 66 bùn ao nuôi tôm nhập từ Thái Lan Trung Quốc Trong thời gian gần đây, nhà khoa học nớc ta tập trung vào hớng nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu ích ứng dụng chúng vào trình làm nớc bùn ao đàm nuôi tôm [4, 6, 7] Trong báo trình bày kết nghiên cứu khả sinh tổng hợp amilaza proteinaza ngoại bào chủng vi khuẩn a mặn phân lập đợc từ ao đầm nuôi tôm để phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý chất hữu d thừa ao đầm nuôi tôm cao sản vùng ven biển I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Nguyên liệu - Các mẫu bùn lấy từ đầm nuôi tôm cao sản Đồ Sơn - Hải Phòng tỉnh phía Nam - Cao thịt, cao nÊm, men pepton, glucoza, sacaroza, tinh bét tan, gelatin, cazein Hãng Merck Môi trờng nghiên cứu [1]: Môi trờngnuôi vi khuẩn sinh tổng hợp amilaza (AA) (g/l) Tinh bét 10 Pepton N−íc biĨn 1000 ml Th¹ch 20 NaCl 50 PH = 6,8 Phơng pháp - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải hợp chất hữu [1, 2] Chúng tiến hành lấy mẫu bùn ao nuôi tôm cao sản Đồ Sơn - Hải Phòng tỉnh phía nam để phân lập nhóm vi khuẩn Các mẫu bùn đợc pha loãng nớc muối sinh lý 0,9% NaCl điều kiện vô trùng Nồng độ pha loãng theo c¬ sè mò 10: 10-1, 10-2, 10-7 Nhá 100 àl dung dịch pha loãng vào đĩa thạch chứa môi trờng tinh bột tan + 5% NaCl cazein + 5% NaCl Gạt cho khô mặt thạch, sau ủ 28 - 30oC 48 Lấy quan sát, tách khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng có chứa môi trờng tơng ứng (tinh bột tan, cazein) Sau chủng vi sinh vật phân lập đợc cấy môi trờng thạch với môi trờng chọn lọc có chứa tinh bột tan cazein Sau 48 nuôi cấy, dùng thuốc thử Lugol để tiến hành kiểm tra vòng phân giải tạo thành môi trờng tinh bột cazein Chủng vi khuẩn tạo vòng phân giải lớn đợc giữ giống để tiếp tục nghiên cứu II KếT QUả Và THảO LUậN Tuyển chọn chủng vi khuẩn a mặn sinh amilaza proteinaza ngoại bào từ ao nuôi tôm Chúng tiến hành lấy mẫu bùn địa điểm vùng nuôi tôm Đồ Sơn - Hải Phòng mẫu bùn số tỉnh phía Nam để phân lập chủng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột cazein Từ mẫu bùn phân lập đợc 20 chủng vi khuẩn có khả phân huỷ tinh bột cazein để nghiên cứu kết đợc trình bày bảng hình Bảng Hoạt độ enzim phân giải tinh bột cazein chủng vi khuẩn phân lập Ký hiƯu chđng HP-1 HP-2 NB-3 NB-4 CHP-5 CHP-6 NB-7 NB-8 NB-9 NB-10 Đờng kính vòng phân giải Ký hiệu chñng (D-d), mm Tinh bét Cazein 20 12 NB-11 22 14 NB-12 24 18 CHP-13 22 24 CHP-14 25 18 CHP-15 28 27 CHP-16 19 10 HP-17 20 11,5 HP-18 22 12 HP-19 21 15 HP-20 1A Đờng kính vòng phân giải (D-d), mm Tinh bột Cazein 22,5 16 18,5 10 15 12,5 17 14 12 13 20 14,5 11 21,5 19 12 17 14 14 12 1B CHP-5 CHP-6 NB-4 NB-3 NB-4 CHP-6 CHP-5 Hình Hoạt độ amilaza proteinaza ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 1A Phân giải tinh bột; 1B Phân giải cazein 67 Từ kết bảng hình 1, chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải mạnh tinh bột cazein, chúng đợc ký hiệu là: NB-4 CHP-6 để nghiên cứu tiếp ảnh hởng nồng độ muối đến hoạt độ amilaza proteinaza ngoại bào Để nghiên cứu ảnh hởng nồng độ muối lên sinh tổng hợp enzim, sử dụng môi trờng tinh bột cazein lỏng có bổ sung NaCl với nồng độ khác nhau, nuôi lắc 200 vòng/phút 48 30oC, kết đợc trình bày bảng Kết xác định enzim sau 48 h nuôi cấy, 30oC bảng cho thấy nồng độ NaCl có ảnh hởng lớn đến khả sinh enzim ngoại bào hai chđng vi khn ®· tun chän Hai chđng vi khn tuyển chọn sinh proteinaza ngoại bào cao môi trờng có 2% NaCl sinh amilaza ngoại bào cao môi trờng có 5% NaCl Bảng ảnh hởng nồng độ NaCl lên sinh enzim ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn Loại Enzym Amylaza Proteinaza Chñng vi khuÈn NB-4 CHP-6 NB-4 CHP-6 0% NaCl 8,0 7,0 6,0 7,0 Đờng kính vòng phân giải c¬ chÊt (D-d, mm) 2% NaCl 5% NaCl 7% NaCl 10% NaCl 18 16,5 14 12 22 18 17 14 15,0 13,0 9,5 8,0 20 14,5 13,5 8,5 ¶nh hởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ amilaza proteinaza ngoại bàocủa hai chủng vi khuẩn tuyển chọn Để nghiên cứu ảnh hởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp amilaza proteinaza chủng vi khuẩn NB-4 CHP-6 tiến hành nuôi lắc hai chủng bình tam giác 250 ml cã chøa 50 ml m«i tr−êng tinh bét + 5% NaCl môi trờng cazein + 2% NaCl, máy lắc tròn 200 vòng/phút 48 giờ, thang nhiệt độ khác nhau, kết đợc trình bày bảng bảng Bảng ảnh hởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ phân giải tinh bét cđa chđng vi khn ®· tun chän Chủng nghiên cứu NB4 CHP-6 Đờng kính vòng phân giải tinh bét (D-d, mm), sau 48 giê nu«i cÊy 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC 45oC 10 18 23 22 13 11 20 28 25 14 B¶ng ¶nh hởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ phân giải cazein chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng nghiên cứu NB4 CHP-6 Đờng kính vòng phân giải cazein (D-d, mm), sau 48 giê nu«i cÊy 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC 45oC 17,5 25 22 11 9,5 19,5 27 24 12,5 Tõ kÕt qu¶ ë bảng bảng cho thấy, hai chủng vi khuẩn sinh amilaza proteinaza ngoại bào dải nhiệt độ từ 20oC đến 40oC, nhng nhiệt độ thích hợp cho 68 inh tổng hợp amilaza từ 30 - 35oC Còn nhiệt độ thấp 20oC cao 40oC chúng sinh enzim yếu 4 ảnh hởng nguồn cacbon môi trờng nuôi hai chủng vi khuẩn tuyển chọn đến hoạt độ enzim ngoại bào chúng Dinh dỡng vi sinh vật trình chuyển hoá nguồn cacbon thành phần hữu tế bào vi sinh vật Giá trị dinh dỡng khả hấp thụ nguồn cacbon phụ thuộc vào thành phần hoá học, cấu trúc phân tử cacbon đặc điểm sinh lý chủng vi sinh vật Nhiều chất hữu không tan nớc trọng lợng phân tử lớn nên thâm nhập đợc vào tÕ bµo vi sinh vËt (xenluloza, tinh bét, pectin, protein,…) Muốn hấp thụ đợc chất vi sinh vật phải tiết enzim để thuỷ phân chúng thành phần nhỏ Mỗi loại vi sinh vật thờng phát triển tốt số nguồn cacbon định Kết nghiên cứu ảnh hởng nguồn cacbon đến hoạt độ amilaza protenaza đợc trình bày bảng Bảng ảnh hởng nguồn cacbon đến hoạt ®é amilaza vµ proteinaza cđa chđng vi khn ®· tuyển chọn Chủng vi khuẩn NB-4 CHP-6 Đờng kính vòng phân giải tinh bột (D-d, mm) Glucoza Sacaroza Lactoza Tinh bét 9,0 13,0 7,5 16,0 12,0 16,5 7,9 17,0 KÕt bảng cho thấy chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh amilaza ngoại bào mạnh môi trờng nuôi cấy có nguồn cacbon tinh bột Còn môi trờng có nguồn cacbon glucoza chúng lại sinh proteinaza ngoại bào mạnh ảnh hởng nguồn nitơ môi trờng nuôi đến hoạt độ enzim ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn Các nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh vật nguyên liệu để hình thành nhóm amin (-NH3) imin (-NH-) phân tử aminoaxit, nucleotit, bazơ dị vòng hợp chất hoá học khác có mặt nguyên sinh chất Nguồn nitơ vi sinh vật dƠ hÊp thu nhÊt lµ NH4+ vµ NH3 Chóng dƠ dàng thâm nhập vào tế bào vi sinh vật tạo nên cách dễ dàng nhóm amin Đờng kính vòng phân giải cazein (D-d, mm) Glucoza Sacaroza Lactoza Tinh bét 15,5 13,5 7,5 11,0 17,0 15,0 8,2 12,5 vµ imin Cã quan niƯm cho r»ng, mét sè vi khuẩn khả đồng hoá muối amon Quan niệm không đúng, tất vi sinh vËt ®Ịu cã thĨ sư dơng mi amon NÕu vi sinh vật không phát triển đợc môi trờng chứa muối amon nguyên nhân độ chua sinh lí muối này: vì, sau đồng hoá nhóm NH4+, môi trờng lại anion vô (SO4-2, Cl-, HPO4-2) mà pH môi trờng hạ xuống mạnh, làm ức chế phát triển vi sinh vật Ngoài ra, vi sinh vật phát triển đợc môi trờng có muối amon vô nguồn nitơ nhất, thờng vi sinh vật đòi hỏi số axit amin có sẵn môi trờng Kết nghiên cứu ảnh hởng nguồn nitơ đến hoạt độ amilaza proteinaza chủng vi khuẩn tuyển chọn đợc trình bày bảng Bảng ảnh hởng nguồn nitơ môi trờng nuôi đến hoạt độ amilaza proteinaza ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn Đờng kính vòng phân giải (D-d, mm), sau 48 nuôi cấy, 30oC Loại Chủng Cao nấm Bột đậu Enzym vi khuẩn Pepton Cao thịt KNO3 (NH4)2SO4 men tơng 18,0 NB-4 17,5 17,0 18,0 13 Amilaza 17,5 CHP-6 15,5 16,5 17,5 12 19,5 NB-4 14,5 11,0 13,0 14 Proteinaza 21,5 CHP-6 16,0 10,0 12,5 14,5 69 KÕt qu¶ ë bảng cho thấy chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh amilaza ngoại bào cao môi trờng có nguồn nitơ hữu cơ, chúng sinh amilaza ngoại bào yếu môi trờng có bổ sung muối vô KNO3 Chúng hầu nh không phát triển không sinh amilaza proteinaza ngoại bào môi trờng có muối (NH4)2SO4 Chúng sinh proteinaza ngoại bào tốt môi trờng có bột đậu tơng pepton, điều cho thấy proteinaza chủng vi khuẩn enzim cảm ứng phân tử protein bột đậu tơng cha đợc thuỷ phân, pepton protein cha bị thuỷ phân hoàn toàn thành axit amin Do vậy, kích thích trình sinh tổng hợp proteinaza cđa chóng III KÕT LN Hai chđng vi khn NB-4 CHP-6 đợc phân lập từ mẫu bùn nuôi tôm có khả sinh enzim amilaza proteinaza ngoại bào môi trờng có nồng độ NaCl từ 0%10% Nồng độ NaCl có ảnh hởng lớn đến khả sinh enzim ngoại bào hai chủng vi khuẩn tuyển chọn, chúng sinh tổng hợp proteinaza ngoại bào cao môi trờng có 2% NaCl, nhng lại sinh tổng hợp amilaza ngoại bào cao m«i tr−êng cã 5% NaCl Hai chđng vi khuẩn tuyển chọn sinh tổng hợp amilaza proteinaza ngoại bào dải nhiệt độ phát triển từ 20oC đến 40oC, nhng nhiệt độ thích hợp lµ tõ 30 - 35oC Hai chđng vi khn tuyển chọn sinh tổng hợp amilaza ngoại bào mạnh môi trờng nuôi cấy có nguồn cacbon tinh bột sinh tổng hợp proteinaza ngoại bào mạnh môi trờng có nguồn cacbon glucoza Các chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh tổng hợp amilaza ngoại bào cao môi 70 trờng có nguồn nitơ hữu Trong môi trờng có muối nitơ vô chúng sinh tổng hợp enzim yếu, môi trờng có nguồn nitơ muối (NH4)2SO4 hầu nh chúng không sinh tổng hợp đợc enzim Hai chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh tổng hợp proteinaza ngoại bào tốt môi trờng có bổ sung bột đậu tơng pepton TàI LIệU THAM KHảO Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mợu, Phùng Đức Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, 1976: Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập II, Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt Egorov N X., 1983: Thùc tËp vi sinh vËt häc Nxb “MIR” Maxcơva, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Trần Xuân Du, 2003: Giải pháp môi trờng nớc nuôi chu trình nuôi tôm sạch, Báo cáo Hội thảo môi trờng nuôi trồng thủy sản biển Việt nam, Nha Trang Vâ ThÞ Thø, La ThÞ Nga, Trơng Bá Hùng, 2003: Nghiên cứu tạo chế phẩm Bioche đánh giá tác dụng chế phẩm đến môi trờng nớc nuôi tôm, cá: 119-121 Hội nghị Công nghệ sinh häc toµn quèc, Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt Phan ViÕt Tïng, 2003: Sư dơng chÕ phÈm vi sinh (probiotic) nuôi tôm sú thơng phẩm, Báo cáo Hội thảo Môi trờng nuôi trồng thủy sản ven biển ViÖt Nam, Nha Trang Kalkani, 2003: Probiotic: Their role in aquaculture, American standard products, Inc, Jan 10 Sambasivam S., Chandran R., Khan S A., 2003.: Journal Environment Biology, 15 BIOSYNTHESIS AMYLASE AND PROTEINASE OF SOME HALOPHILIC BACTERIAL STRAIN FROM SHRIMP culture PONDS Phan Thi Tuyet Minh, Tang Thi Chinh SUMMARY By the screening sediements of shrimp culture pond, we selected two bacterial strains NB4 and CHP6, these bacterial strains could biosynthesize enzymes amylase and proteinase They could grow and produced amylase and proteinase in the media with NaCl concentration ranged from 0% to 10% The optimum sodium concentration of the media for their production of amylase was 5% NaCl and for their production of proteinase was 2% NaCL These bacterial strains were halophilic microorganisms These bacterial could grow and biosynthesize amylase and proteinase in the media with a range of incubation temperature from 20oC to 40oC, but most suitable temperature for their production of these enzymes were 30oC - 35oC The optimum pH for biosyntheses amylase and proteinase were 6.5 - 8.5 The highest biosynthesis of amylase occurred in media used starch as carbon source and beef extract as nitrogen source The highest biosynthesis of proteinase in media contained glucose and soybean powder The media containing organic nitrogen sources were suitable for the biosyntheses of mentioned above enzymes The media containing inorganic nitrogen likes nitrogen source were very fragile for their production of amylase and proteinase These strains could not grown and produced amylase and proteinase in the media containing ammonium sulfate as nitrogen source Ngày nhận bài:13-4-2006 71 ... tổng hợp proteinaza ngoại bào cao môi trờng có 2% NaCl, nhng lại sinh tổng hợp amilaza ngoại bào cao môi trờng có 5% NaCl Hai chđng vi khn ®· tun chän cã thể sinh tổng hợp amilaza proteinaza ngoại. .. cấy có nguồn cacbon tinh bột sinh tổng hợp proteinaza ngoại bào mạnh môi trờng có nguồn cacbon glucoza Các chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh tổng hợp amilaza ngoại bào cao môi 70 trờng có nguồn nitơ... nitơ vô chúng sinh tổng hợp enzim yếu, môi trờng có nguồn nitơ muối (NH4)2SO4 hầu nh chúng không sinh tổng hợp đợc enzim Hai chủng vi khuẩn tuyển chọn sinh tổng hợp proteinaza ngoại bào tốt môi