Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu nhằm tạo ra giống cây thuốc lá có tính kháng khuẩn, giảm sử dụng nông dược, nâng cao năng suất cây trồng, gien độc tố bở Bt của vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã được chuyển vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens.
25(1): 55-60 3-2003 Tạp chí Sinh học BƯớc đầu tạo thuốc (Nicotiana tabacum L.) chuyển gien nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trần thị dung Trờng đại học Nông-Lâm, Tp Hå ChÝ Minh ngun h÷u hỉ ViƯn Sinh häc nhiệt đới Trong mục đích tạo giống thuốc có tính kháng sâu, giảm sử dụng nông dợc, nâng cao suất trồng, gien độc tố Bt vi khuẩn Bacillus thuringiensis đ đợc chuyển vào thuốc nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sự có mặt cđa gien Bt ë c©y chun gien bc c©y trång sinh protein độc tố để tự bảo vệ chống lại sâu gây hại thuộc họ Cánh vảy Gien thị gus A gien chọn lọc bar đợc gắn vào plasmit pIBT nhằm để chọn lọc đánh giá kết chuyển gien Phơng pháp PCR ®−ỵc dïng ®Ĩ kiĨm tra sù hiƯn diƯn cđa gien Bt mức phân tử I phơng pháp nghiên cứu Vật liệu Nguyên liệu chuyển gien: mẫu thuốc sợi vàng K326 in vitro đợc nuôi cấy từ tháng tuổi trở lên Vi khuẩn plasmit mang gien chun n¹p: chđng vi khn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmit pIBT2 kÝch th−íc 15,3 kb Viện Sinh học nhiệt đới cấu trúc Gien chuyển nạp: - Gien gus A: gien m hãa cho enzym βglucuronidaza đợc phân lập từ vi khuẩn E.coli -glucuronidaza hydrolaza có tác dụng xúc tác phân giải -glucorunit (cơ chất X-gluc) tạo sản phẩm màu xanh chàm đặc trng dễ nhận biết - Gien bar: gien m hãa cho enzym phosphinothricin axetyltransferaza cã nguån gèc tõ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus Enzym có tác dụng làm độc tính phosphinothricin (PPT), hoạt chất thuốc diệt cỏ, cách biến đổi PPT từ dạng có tính diệt cỏ sang dạng bị axêtyl hóa không cã tÝnh diÖt cá - Gien cry1A(c) (gien Bt): m hóa cho protein độc tố (thuộc loại -endotoxin) vi khuẩn Bacillus thuringiensis gây độc cho sâu thuộc Cánh vảy (Lepidoptera) HindIII Bờ trái Bar Lac HindIII Ubi Cry1Ac NOS Bờ phải Z GUS Cấu trúc plasmit pITHB2 Môi trờng nuôi cấy: thành phần theo MS (Murashige & Skoog) víi chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng BA, NAA để tạo chồi thuốc lá; chất kháng sinh xefotaxim để diƯt vi khn tr¸nh sù t¸i nhiƠm Agrobacterium sau chun gien; ho¹t chÊt cđa thc diƯt cá PPT 55 (phosphinothricin) để xác định diện gien bar Hãa chÊt: Dung dÞch nhuém X-gluc, hãa chÊt chiÕt xuÊt ADN thực vật, thực phản ứng PCR chạy điện di Phơng pháp Chuyển gien vào thuốc lá: thuốc in vitro đợc cắt thành mảnh có kích thớc ì cm, loại bỏ gân mép Nuôi chung mẫu vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens mang plasmit pIBT2 (OD = 0,6) Sau ngày, vi khuẩn xâm nhiễm vào mẫu lá, thực trình chuyển nạp gien vào tế bào Chọn lọc mẫu có chứa gien bar: 30 chu kỳ - Giai đoạn chồi: đặt mẫu có không xử lý vi khuẩn môi trờng có nồng độ PPT tăng dần từ 5-10 mg/l, theo dâi sè mÉu l¸ t¸i sinh chåi sau đến tuần nuôi cấy - Giai đoạn cây: đặt chồi thuốc (cao cm) có không xử lý vi khuẩn môi trờng cấy (không có chất kích thích sinh trởng), có nồng độ PPT tăng tõ 10-30 mg/l, theo dâi tû lƯ c©y sèng sau tuần nuôi cấy Xác định có mặt gien gus A: Ngâm mẫu có xử lý vi khuẩn (phát triển xanh tốt môi trờng chọn lọc) không xử lý vi khuẩn (tái sinh tốt môi trờng PPT xefotaxim) dung dịch X-gluc (để qua đêm 37oC), theo dõi số mẫu biểu màu xanh chàm, Xác định diện gien Bt: Dịch chiết ADN đợc cho vào hỗn hợp PCR Thực phản ứng PCR để khuếch đại gien Bt: Chu kỳ đầu: 95oC/7; 54oC/1;72oC/1 Các chu kú sau: 95oC/1’; 54oC/1’; 72oC/1’ Chu kú cuèi: 95oC/7’; 54oC/1; 72oC/1 Điện di sản phẩm PCR gel agaroza 1% quan sát kết để xác định vÞ trÝ cđa gien Bt theo thang ADN chn II Kết thảo luận Chuyển gien vào tế bào thuốc Nuôi chung mẫu chủng vi khn A tumefaciens EHA 105/pITB2 MÉu l¸ dïng chun gien đợc lấy 56 khỏi môi trờng tạo chồi, cắt thành miếng đặt vào 10 ml dung dịch vi khuẩn đĩa petri Ngâm 20 phút Sau đó, mẫu đợc đặt môi trờng chồi nuôi chung với vi khuẩn thời gian 48 để mẫu không bị hủy hoại Đặt mẫu tối Sau ngày, vi khuẩn mọc thành lớp mỏng trắng đục bề mặt môi trờng Các mẫu đ nhiễm khuẩn đợc rửa nhiều lần nớc cất vô trùng có pha 500 mg/l xefotaxim Xefotaxim chất kháng sinh dùng để diệt vi khuẩn A tumefaciens với mục đích tránh tái nhiễm sau mô thuốc đ đợc chuyển gien Các mẫu đ xử lý vi khuẩn đợc đặt môi trờng có nồng độ PPT (phosphinothricin) tăng từ 5-10 mg/l môi trờng để chọn lọc mẫu cã chøa gien bar kh¸ng thc diƯt cá Sau tuần nuôi cấy, mẫu đợc xử lý vi khn xt hiƯn c¸c cơm chåi nhá TiÕp tơc cÊy chuyền tuần lần đến chồi phát triển thành thân, Tách chuyển sang môi trờng có PPT nồng độ tăng từ 10-30 mg/l môi trờng để xác định có mặt gien bar chất kích thích sinh trởng để rễ PPT hoạt chất thuốc diệt cỏ chất dùng để sàng lọc tế bào mô đ đợc chuyển gien kháng thuốc diệt cỏ Tế bào ®−ỵc chun gien bar sÏ m hãa cho enzym phosphinothricin axetyltransferaza có tác dụng kháng đợc thuốc diệt cỏ Các mẫu không xử lý vi khuẩn đặt môi trờng có thuốc diệt cỏ vàng chết dần Còn mẫu đợc xử lý vi khuẩn đặt môi trờng có thuốc diệt cỏ, sau tuần tái sinh chồi, chứng tỏ có hiƯn diƯn cđa gien bar Chän läc c¸c mÉu có chứa gien bar a) Giai đoạn chồi Sau tuần nuôi cấy, mẫu bắt đầu xuất chồi Trên môi trờng có nồng độ PPT mg/l, c¸c mÉu l¸ cã xư lý vi khn cho tỷ lệ tái sinh chồi 60% mẫu đối chứng có tái sinh chồi với tỷ lệ 10% Điều cho thấy cha thể kết luận mẫu đ xử lý vi khuẩn mẫu đ chuyển gien, nồng độ PPT thấp Sau tuần nuôi cấy, mẫu xuất nhiều chồi Trên môi trờng có nồng độ PPT tăng lên 10 mg/l, chồi đ tái sinh mẫu có xử lý vi khuẩn phát triển xanh tốt, đối chứng chết vàng Điều chứng tỏ mẫu đ xư lý vi khn cã mang gien bar kh¸ng thc diệt cỏ nồng độ PPT 10 mg/l (bảng 1) Bảng Tỷ lệ mẫu tái sinh môi tr−êng chän läc kh¸ng thc diƯt cá (%) Thêi gian nuôi Mẫu chuyển gien Mẫu đối chứng Nồng độ PPT Số mẫu Số mẫu Tỷ lƯ mÉu l¸ Sè mÉu l¸ Sè mÉu l¸ Tû lƯ mÉu l¸ (mg/l) t¸i sinh t¸i sinh (%) Ban đầu tái sinh tái sinh (%) ban đầu tuần 20 12 60 20 10 tuÇn 10 12 12 100 0 b) Giai đoạn Sau tuần nuôi cấy, thuốc đợc chun gien (cã xư lý vi khn) xt hiƯn có nhiều rễ môi trờng có PPT nồng độ 10-30 mg/l, tỷ lệ sống đạt 100% đối chứng chết vàng (bảng 2) Nh vậy, trình nuôi chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, việc chuyển gien đ đợc thực thông qua plasmit pITB2, mẫu thuốc sống đợc môi trờng có thuốc diệt cỏ với nồng độ PPT tăng từ 10-30 mg/l Bảng Tỷ lệ thuốc sống đợc môi trờng chọn lọc kháng thuốc diệt cỏ sau tuần nuôi cấy (%) Nồng độ PPT (mg/l) 10 20 30 Cây thuốc chuyển gien Số Tỷ lệ Số sống ban đầu sống (%) 20 20 100 20 20 100 20 20 100 C©y thuốc đối chứng Số ban đầu 20 20 20 Sè c©y sèng 0 Tû lƯ c©y sống (%) 0 Hình Mẫu thuốc có xử lý vi khuẩn tái sinh chồi đối chứng chết vàng môi trờng có PPT (10 mg/l) 57 Hình Cây thuốc mang gien bar sống môi trờng có PPT (30 mg/l) Hình Cây thuốc đối chứng chết vàng môi trờng có PPT(30 mg/l) Xác định có mặt gien gus A Để tiếp tục khẳng định mẫu đ đợc chuyển gien, thí nghiệm chứng minh có mặt gien gus A đem nhuộm mẫu với chất X-gluc Các mẫu đ đợc chọn lọc mẫu đối chứng, sau đem ngâm dung dịch X-gluc, đợc rửa nhiều lần cồn 70o, lần cách vài Cồn có tác dụng hòa tan diệp lục, riêng màu xanh chàm đặc trng gien gus A bền với cồn Do đó, sau nhiều lần rửa, mẫu gien gus A trở nên dần có màu vàng nhạt, mẫu biểu gien gus A có màu xanh chàm (bảng 3) Nh vậy, sau chọn lọc môi trờng kháng thuốc diệt cỏ, mẫu biểu có mặt cđa gien gus A Trong tù nhiªn, enzym β-glucuronidaza gien gus A m hóa không tồn thực vật, gien gus A gien thị tốt công nghệ gien thực vật Mặt khác sản phẩm màu xanh gien gus A bền phản ứng bị ảnh hởng pH nên thuận tiện cho việc theo dõi Bảng Tỷ lệ mẫu biểu màu xanh chàm (%) Chỉ tiêu Số mẫu ban đầu Số mẫu biểu màu xanh chàm Tỷ lệ mẫu biểu màu xanh chàm (%) 58 Mẫu chuyển gien Mẫu đối chứng 10 10 100 10 0 Cl Cl Br O Glucuronic acid Br OH β - glucuronidase + Glucuronic acid N N H Cl Br H O H C N C Trïng hỵp hợp Trùng C N C H O Oxy hoùa Oxy hãa Br Cl Dichloro - dibromo indigo (ClBr indigo) Phản ứng tạo màu X-gluc dới tác dụng enzym -glucuronidaza Hình Thuốc chuyển gien màu xanh chàm (2) đối chứng không màu nhuộm X-gluc (1) Thang ADN chuÈn kb ADN cña plasmit pITB2 3,4,5 ADN thuốc chuyển gien ADN đối chứng Hình Kết điện di sản phẩm PCR 59 Xác định có mặt gien Bt PCR với cặp mồi đặc trng có khả khuếch đại hàng triệu lần đoạn ADN (gien) tơng ứng Kỹ thuật điện di cho phép quan sát mắt thờng gien lạ Kết điện di hình cho thấy băng ADN gien Bt nằm vạch 0,6 kb mẫu thuốc chuyển gien plasmit pITB2, mẫu đối chứng không xuất băng III Kết luận PCR khuếch đại số lợng ADN cần nhận biết với cặp mồi ®Ỉc tr−ng cho gien Bt, ® thÊy xt hiƯn ë thuốc có xử lý chuyển gien băng ADN cã kÝch th−íc cì 0,6 kb so víi thang chn, băng ADN vắng mặt hoàn toàn mẫu đối chứng không xử lý chuyển gien Trên sở đó, bớc đầu nhận định gien Bt cấu trúc plasmit pITB2 đ đợc chuyển vào thuốc nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tài liệu tham khảo Kết ban đầu đ xác định đợc sù hiƯn diƯn cđa gien bar (gien chän läc kh¸ng thuốc diệt cỏ) gien gus A (gien thị màu gặp X-gluc) mẫu thuốc chuyển gien Điều cho thấy, sau chuyển gien, enzym phosphinothricin axetyltransferaza (kháng thuốc diệt cỏ) enzym -glucuronidaza (phân giải -glucuronit tạo màu xanh chàm) đ hoạt động Có thể suy ADN plasmit đ đợc gắn vào gien thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đ biểu gien qua việc sinh tổng hợp nên enzym nói Gien Bt, có độ lớn theo tài liệu khoảng 0,6 kb, m hãa cho protein ®éc tè cđa vi khn Bacillus thuringiensis Khi sư dơng kü tht Hooykaas P J J and Schilperoort R A., 1992: Plant Mol Biol., 19: 15-18 Klee H., R Horsch and S Rogers, 1987: Annu.Rev plant Physiol., 38: 467-486 Miki B L et al., 1993: Procedure for introducing foreign DNA into plants CRC press, Boca Raton Nguyễn Văn Uyển, 1996: Những phơng pháp công nghệ sinh học thực vật, 1: 31-53, 68-93 NXB N«ng NghiƯp, Walkerpeach C R and Velten J., 1994: Agrobacterium mediated gene transfer to plant cells Plant Mol Biol., 1-19 Gene transfer into tobacco plant (Nicotiana tabacum L.) Mediated by Agrobacterium tumefaciens tran thi dung, nguyen huu ho SUMMARY The transfer of foreign genes into high plants mediated by Agrobacterium tumefaciens is a standard technique in plant molecular biology and genetic engineering Leaf discs of the tobacco cultivar K326 were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA 105 harbouring the plasmid plTB2 containing cryIA(c), bar and gus A genes Infected leaves were transferred onto the MS (Murashige & Skoog) medium supplemented with 5-30 mg/l PPT (phosphinothricin) for selection of the transformants PPT resistant shoots have been obtained and they also expressed the gus activity The presence of the Bt toxin gene from Bacillus thuringiensis was shown by PCR (polymerase chain reaction) Ngµy nhËn bµi: 10-4-2002 60 ... định gien Bt cấu trúc plasmit pITB2 đ đợc chuyển vào thuốc nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tài liệu tham khảo Kết ban đầu đ xác định đợc sù hiƯn diƯn cđa gien bar (gien chän läc kh¸ng thuốc. .. mẫu với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, vi c chuyển gien đ đợc thực thông qua plasmit pITB2, mẫu thuốc sống đợc môi trờng có thuốc diệt cỏ với nồng độ PPT tăng từ 10-30 mg/l Bảng Tỷ lệ thuốc. .. -glucuronit tạo màu xanh chàm) đ hoạt động Có thể suy ADN plasmit đ đợc gắn vào gien thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đ biểu gien qua vi c sinh tổng hợp nên enzym nói Gien Bt, có